2.1. 光束线的简要说明

两种光谱学方法都需要较高的通量而CD需要一个小通量密度以防止对生物大分子的辐照损伤。低杂散光水平对CD测量也至关重要，然而，CD测量需要中等的分辨率和波长，通常要低至170左右 纳米。荧光测量需要低至较低波长的激发（<140 纳米）。

波束线设计在其他地方有详细描述（Tao等。, 2007). 如图1所示光束线主要由第一环形镜、氟化锂（LiF）窗阀、Seya单色器、第二环形镜、平面镜和光学端窗组成。第一个环形镜以62.5°的入射角使光束向上偏转，并在入口狭缝处垂直聚焦。当车窗阀关闭时，它允许在大气压力下安装该阀后面的部分光束线，光束处于打开状态，为光束线的安装和对准提供了相当大的灵活性。第二个环形镜将光束水平重定向，并将其聚焦在样品位置。通过移动平面镜，光束可以快速切换到不同的分支，用于CD或荧光测量。荧光室和氟化钙（CaF）选择LiF窗口₂)CD室窗口，因为LiF窗口达到荧光测量所需的较低截止波长，而CD通常记录到170 纳米和CaF₂窗户的化学稳定性也更高。

图1 梁线4B8的布局。TM1，第一环形镜；WV、LiF窗阀；EN，入口狭缝；FB，固定挡板；G、 光栅；EX，出口狭缝；TM2，第二环形镜；MB，活动挡板；PM，平面镜；LW、LiF窗口；CW、CaF2窗口；F、 焦点。

此外，北京同步辐射装置（BSRF）是一个寄生光源，与北京正负电子对撞机（BEPC）共用储存环。在专用同步加速器模式下，储存环的运行速度为2.5 峰值束流为250的GeV mA。在高能模式下，能量为1.89 GeV和现在峰值电流是550 妈妈。

2.2. 波束线性能评估

这个通量如图2所示; 震级为～10¹¹ 光子⁻¹峰值波长位于~180 纳米。这个通量根据光电二极管（UVG-100；IRD）的电流估算。通过记录水杨酸钠的荧光得到分布曲线，水杨酸钠盐的荧光发射效率在此范围内保持不变。

图2 CD样品位置的光通量。用氮气吹扫CD室。140左右的多个峰值 nm来自氮吸收。

使用一系列参考样本（Starna）评估光束线性能。使用特征吸收峰在240至290之间的钬溶液基准实现波长校准 nm（图3). 波长精度的再现性已被证明保持在0.1以内 nm用于长期操作。

图3 使用0.75带宽的氧化钬参考溶液进行波长校准 nm，参考值在括号内。

使用己烷参考溶液中的甲苯，使用两个狭缝宽度测定光谱分辨率（图4). 使用最大峰值与最小峰值的吸光度比计算分辨率。使用参考盐溶液测定杂散光水平（图5). 200以下 nm，水平为0.06%，足以进行SRCD测量。光束线参数汇总在表1中.

图4 使用己烷溶液中的参考甲苯进行光谱分辨率测定。最大吸光度与最小吸光度的峰值比测量分辨率。

图5 通过不同参考盐溶液的传输确定杂散光水平评估。

3.1. CD仪器

CD是手性生物分子对左旋和右旋圆偏振光的差分吸收。光弹性调制器（PEM90，CaF₂晶体光学头；Hinds Instruments）用于将线偏振光转换为50度左右的圆偏振光 千赫。圆极化取决于线性极化，因此在PEM前面安装了Seramont偏振器（B-Halle GmbH），以保持高线性极化。通过设置延迟来校准PEM，使CD信号最大化为192.5 参考样品为nm（1秒)-（+）-10-樟脑磺酸（CSA）（奥克伯格等。, 2000).

CD检测示意图如图6所示交替变化的圆偏振光穿过样品，到达PMT探测器（R6836遮阳帘光电倍增管；滨松）。信号由带宽为150的前置放大器（A1H；电子管）放大 kHz以消除高频噪声。然后通过信号处理单元（SCU100；Hinds Instruments）将放大的信号分离为交流和直流分量。直流分量反馈至国产高压伺服控制器（HT伺服），该控制器通过调整施加在PMT上的高压（HT），在光谱扫描期间保持直流分量恒定。AC部件被输入锁定放大器（7265型；信号恢复）以拾取CD信号。CD、DC、高压和束流信号均被采集。

图6 4B8光盘检测仪器框图：PMT高压控制伺服、信号处理和数据采集系统。

在CD扫描期间，可以使用传输信号与记录的高压、PMT增益和束流相结合的既定方法同时记录吸收，以恢复吸收（Sutherland，1996).

SRCD样品室不是抽真空，而是用氮气吹扫，以方便测量：液氮蒸发产生的高纯度干燥气体会去除仪器中光路中的氧气。样品温度由珀尔贴温度控制器控制。

为了检测膜蛋白和其他混浊样品，样品必须靠近检测器，以达到较大的接受角度，从而将与光散射从这些样品中（华莱士等。, 2003). 从样品到探测器表面的距离在光束线4B8处是可变的，可以小到10 mm，以达到要求的90°验收。

3.2. CD仪器的性能

CSA通常用作CD光谱仪的校准样品。如图7所示，两个特征峰的比值(θ_192.5纳米到θ_290.5纳米)为1.98±0.01，表明仪器已经过良好校准，杂散光水平得到了良好控制（Miles等。, 2003). 使用CD工具程序（Lees等。, 2004).

图7 CSA的CD光谱，1 毫克 毫升−1在1中 毫米长的电池。192.5 nm和290.5 nm处两个波段的最大值之比 纳米为1.98。

Beamline 4B8提供低至172的常规CD测量 水溶液为nm，使用0.01 毫米长的石英电池（124；Hellma）。当CaF₂如果使用电池，则可以在170以下实现更短的波长 nm（图8).

图8 伴刀豆球蛋白IV的CD谱；蛋白质浓度~7 毫克 毫升−1，使用0.01 毫米CaF2细胞和D2O作为溶剂。

UV-VUV辐照对生物分子的影响变性已开始关注SRCD测量（Wien等。, 2005). 发现存在一个阈值通量密度对于变性（英里等。, 2008). 人血清白蛋白（HSA）通常用作辐照变性指示灯，因为它容易受到UV–VUV辐射。在束流为～200的专用操作模式下 mA，HSA的多次扫描表明，辐照损伤可以忽略不计 毫米×1.5 mm辐照面积（图9). 然而，当束流超过400时，寄生模式下的辐照损伤很明显 mA。当样品向下游移动以将斑点尺寸扩大至8时，可将不利影响降至最低 毫米×2 mm，同时减少通量密度。

图9 HSA三次连续扫描图；蛋白质浓度～7.5 毫克 毫升−1, 0.01 毫米电池。

样品温度可控制在275至368之间 K.肌红蛋白的熔化曲线如图10所示.

图10 肌红蛋白的热变性曲线与温度的关系，监测温度为192 纳米。插图：马骨骼肌肌红蛋白的CD谱；蛋白质浓度～7 毫克 毫升−1, 0.01 毫米电池。

4.1. 荧光仪器

VUV激发的光学布局光致发光测量示意图如图11所示。对于荧光测量，移动平面镜，通过LiF光学窗口将光束水平转换95°进入荧光室。然后，LiF分束器反射部分光束，激发水杨酸钠荧光屏，以监测事件的变化通量，而透射光束聚焦在样品上。样品架最多可容纳七个样品。操作器（MB1504；McAllister）上安装了带样品支架的低温恒温器头，用于调整、优化和恢复样品位置。荧光检测部分垂直于激励光束布置。荧光由两个透镜收集和聚焦，并投射到荧光单色仪（SP308；Acton）的入口狭缝上，该单色仪装有三个覆盖190至1700范围的光栅 nm，光谱分辨率为0.2 纳米。电动滤波器移位器提供八种长通光学滤波器的选择。为了避免各向异性效应，可以在发射路径中安装魔角偏振片。

图11 荧光仪器的光学布局。BS：分束器；MPM，移动平面镜；D、 检测器；EM，发射单色仪；FA，过滤器组件；FS，荧光屏；五十、 透镜；S、 样品；W、 LiF窗口。

荧光信号由光子计数头（H6241；哈马松）检测，其输出TTL脉冲被输入计数器模块（974；ORTEC）。从水杨酸钠信号校准样本信号。需要反射率来确定量子效率。将荧光屏插入样品和收集透镜之间，通过检测UV–VUV反射（Justel等。, 2001). 面向样品表面安装CCD摄像机，以记录荧光图像。使用涡轮泵（Turbo70；Varian）排空腔室。图12显示了典型商用红色（YGB）、绿色（ZSM）和蓝色（BAM）荧光粉的一系列VUV激发和发射光谱。

图12 红色、绿色和蓝色荧光粉的光致发光。实线：（Y，Gd）BO三：欧盟3+（YGB），红灯；虚线，Zn2二氧化硅4：锰2+（ZSM），绿灯；虚线，BaMgAl10O（运行）17：欧盟2+（BAM），蓝光。左：发射波长为594的激发光谱 纳米，526 nm和452 YGB、ZSM和BAM分别为nm。右：发射光谱，均在172激发 纳米。插图：YGB带1的发光图像 mm比例尺。

已实现荧光测量的远程访问。远程桌面（Radmin；FASCO）在用户的家用计算机上运行，并显示光束线4B8桌面。借助仪器自动化，用户可以通过选择样品、优化样品位置、选择过滤器、控制样品温度（低至14 K） 收集数据并最终传输数据。

4.2. 荧光寿命测量

荧光寿命检测对荧光研究至关重要。同步辐射具有脉冲短、重复频率高、波长可调范围宽等优点，是荧光寿命测量的理想激发源。这个脉冲持续时间是150 脉冲间隔为800的ps BSRF单束团模式下为ns。采用时间相关单光子计数（TCSPC）方法在时域内测量荧光寿命。采用反向启动-停止技术，使来自样本的脉冲信号用于启动时幅转换器（TAC），激励参考脉冲用于停止TAC。

如图13所示在输入TAC（576；ORTEC）之前，样品脉冲由快速PMT（XP2020Q；Photonis）检测，并由常数分式鉴别器（583；ORTEC）识别。它也可以通过单个光子计数单元（H7421-50；哈马松）检测，其输出TTL信号可以直接输入TAC。探测器安装在发射单色仪的出口狭缝端口。通过检测光束线入口狭缝的可见反射，使用另一个PMT（XP2020）获得激励参考脉冲。然后，信号在输入TAC之前被识别和延迟。将TAC输出输入到多通道分析仪（特朗普MCA卡；ORTEC）中，以恢复衰减曲线。为了避免脉冲堆积计数率保持在重复频率的1%以下。

图13 TCSPC设置的框图。Ref，同步辐射参考脉冲；S、 样品；Emi，样品排放量；D、 检测器；恒定分数鉴别器；时间-幅度转换器；MCA，多通道分析仪。

使用已知寿命的化合物测试仪器的性能。强度衰减曲线属于N个-乙酰基-L（左）-色氨酸酰胺（NATA）如图14所示.测量寿命（2.62±0.35 ns）与报告值一致（Lakowicz，1983). 仪器响应函数（IRF）是通过检测激励脉冲的散射来测量的。

图14 荧光衰减曲线N个-乙酰基-L（左）-水中的色氨酸酰胺（NATA），280 nm激发和350 nm发射。粗体线条，拟合结果。IRF，仪表响应功能。