2.1. 激光源

晶体加工机使用的激光振荡器是NSL-193L（尼康公司）。该装置发射193束激光 nm波长，脉冲宽度小于1.3 ns，频率为1–400 千赫。最大脉冲强度为1.0 µJ/脉冲，从原来的0.25升级而来 µJ/脉冲。由于NSL-193L是一种四级激光器，因此它被放置在一个带有联锁系统的隔间中。该装置配有波长转换晶体，可产生193的激光束 nm波长。由于转换晶体对湿度非常敏感，因此可以连续控制温度和₂需要进行气体净化。然而，波长转换晶体的不断劣化是不可避免的。因此，使用功率计（PD300-UV-193；Ophir Optronics Solutions）定期监测采样点下游的激光功率，以检查退化情况（图1b条).

2.2。激光光学

晶体加工机的激光光学元件设计为允许激光照射位置高速移动，同时保持扫描平面内激光焦距不变。两个Galvano反射镜控制深紫外激光器的光束方向，在样品位置上游放置的反射镜处，光束方向改变90°（图1c（c）)。聚焦透镜将激光束聚焦到6.6×6.9 样品位置上的µm（水平×垂直，FWHM）（图1天)。而以前的系统的光斑直径为15 µm（北野、松村等。, 2005)由于激光光学的改进，激光焦距已减小到以前系统的一半以下。此外，激光注量从0.1增加到8.0 J型 厘米⁻²与以前的系统（北野、松村等。, 2005)。半镜只反射193波长左右的光 nm（图1c（c）)。由于镜子可以传输其他波长的光，因此可以使用同轴摄像机从与激光器相同的方向观察样品（图1e（电子）).

2.3. 样品的持有和操作

测角仪有四个轴(X（X）,Y（Y）,Z轴和φ，旋转轴），以在处理期间调整样本位置和方向。旋转轴采用气动测角仪（AB-150R；佳能），以保持偏心精度在1以内 微米。低温流装置用于在晶体加工过程中保持样品冷却。太空机器人（村上春树等。, 2012)采用杜瓦瓶进行高效可靠的样品交换，杜瓦瓶最多可装入两个UniPuck。

2.4. 控制软件

控制软件（图1（f）)用Qt4和GCC编写，有一个用于扫描平面上多边形顶点位置的注册面板。为了处理样品，激光束以特定速度（通常为10 毫米 秒⁻¹)。通过使用鼠标拖动安装的水晶图像上的顶点，可以在控制监视器上直接更改多边形形状（图1e（电子）)。可以指定多边形线的宽度和激光照射重复次数，并且对于难以处理的样品可以增加。可以将形状更改为φ-轴对称旋转体，如球体或圆柱体，方法是在扫描平面中创建多边形，然后围绕φ轴。可通过控制软件指定成型的步进角和总旋转角。此外，控制软件还包括样品校准和样品交换功能。可以通过远程处理样本无机器软件（NoMachine Co.）。

2.5. 蛋白质晶体的应用

由于深紫外激光可以加工由尼龙等聚合物制成的蛋白质晶体、周围的溶剂和冷冻圈，因此用户可以自由指定加工形状，而不必考虑样品的构成。请注意，如前所述，深紫外激光照射对蛋白质晶体造成的损伤仅限于距离激光束足迹几微米左右（巴苏等。, 2019)。根据晶体加工的目的，用户可以选择合适的加工模式。有两种典型的处理模式：溶剂去除处理和球形处理（图2)。在溶剂去除处理中，用户可以选择性地去除多晶体的溶剂部分、低温环和不需要的部分。在球面加工中，样品被深紫外激光反复照射，并由测角仪旋转形成球体或圆柱体。在支持信息.

图2 晶体加工示例。晶体如前所示(一)–(天)以及之后(一′)–(天'）晶体加工。晶体位于石圈上(一,b条)或尼龙圈(c（c）,天)。晶体在(一'）和(c（c）′）中除去溶剂(b条'）和(天′). 激光扫描路径用粉红色的线表示。

晶体加工实验的典型工作流程如下。首先，使用X射线光栅扫描的常规函数评估晶体质量和在低温环中的位置PReMo公司(光子工厂远程监控系统)数据采集软件（山田等。, 2013)。这一步是必需的，因为在控制监视器上很难从视觉上识别薄片或针状形状的晶体或覆盖有霜的晶体，因此只能通过衍射来评估晶体的质量。当晶体区域之间的晶体质量不同时，应保留晶体的高质量区域用于基于光栅扫描的处理。检查晶体的位置和质量后，将晶体安装在加工机上，并参考X射线光栅扫描结果进行加工。最后，将处理过的晶体安装在光束线的衍射仪上，以采集衍射数据。晶体加工机可以存储两个UniPuck，一次最多可以加工32个晶体。

3.1. 方法

BphA4是一种蛋白质，含有408个氨基酸残基，包含9个S原子，来自五个蛋氨酸和四个半胱氨酸残基，以及黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）中的两个P原子。晶体的制备如前所述（Senda等。, 2000)。使用2.7的X射线波长收集原生SAD数据 位于日本筑波县KEK光子工厂光束线BL-1A上（KEK-PF）。BL-1A是专门为使用蛋白质晶体进行长波长X射线衍射实验而设计的。低剂量（约1 每个数据集的MGy）如表1所示为了确认辐射损伤可以忽略不计，我们在激光处理前后从每个晶体收集了三次衍射数据集。

制备了球形和溶剂去除的BphA4晶体，以评估晶体加工的有效性。激光照射条件为1.0 5.0时每脉冲µJ kHz，平均激光功率约3.3 样品位置处的mW。500×300×150成型 微米晶体变成直径为120的球体 µm约为20 最小值（图3一)从BphA4晶体中去除溶剂大约需要10 相同激光照射条件下的min（图4一)。所有衍射数据均由XDS公司（卡布施，2010年一,b条)、和下部结构由确定SHELXC公司/D类（谢尔德里克，2010年)使用香港（HKL）2地图接口（Pape&Schneider，2004).SHEXLD公司通过1000次试验进行了计算。我们在SHELXD公司使用两个标准进行计算。首先，CC_全部的–立方厘米_虚弱的1000次试验的散点图SHELXD公司计算需要明确划分为两个不同的分布组：高CC和低CC_全部的/抄送_虚弱的组。其次，CC_全部的在高CC中，值需要大于30%_全部的/抄送_虚弱的组。

图3 球形处理前后BphA4晶体衍射数据质量的比较。(一)球面加工前后的晶体。(b条)–(天)我/σ(我),R（右）测量并根据衍射分辨率绘制了反常相关值。数据集1、2和3在处理前收集（红色），数据集4、5和6在处理后收集（蓝色）（见表2)。在(b条)和(c（c）)数据集1-3和数据集4-6的行几乎完全重叠。在(天)、数据集1和4、数据集2和5以及数据集3和6分别用实线、虚线和虚线绘制。(e（电子）,（f）)CC公司全部的–立方厘米虚弱的散点图SHELXD公司之前对晶体的计算(e（电子）)以及之后(（f）)球面加工。

图4 溶剂去除处理前后BphA4晶体衍射数据质量的比较。(一)去除溶剂前后的晶体。(b条)–(天)我/σ(我),R（右）测量以及根据衍射分辨率绘制的异常相关值。数据集1、2和3在处理前收集（红色），数据集4、5和6在处理后收集（蓝色）（见表3)。在(天)、数据集1和4、数据集2和5以及数据集3和6分别用实线、虚线和虚线绘制。(e（电子）,（f）)CC公司全部的–立方厘米虚弱的散点图SHELXD公司之前对晶体的计算(e（电子）)以及之后(（f）)溶剂去除处理。

碳酸酐酶阿纳巴埃纳sp.PCC7120（以下简称碳酸酐酶All2909）由178个氨基酸残基组成，仅包含一个蛋氨酸S原子。由于碳酸酐酶All2090不含金属离子（平川等。, 2021)，除S原子外，没有明显的反常散射体。晶体的制备如前所述（平川等。, 2021)。我们将晶体加工成直径为80–100的球形 使用与BphA4相同的处理条件。数据收集条件如表1所示我们使用小型卡伯测角仪从一个不同取向的晶体中收集了四组数据。本地SAD阶段化的数据是通过使用XSCALE公司（卡布施，2010年一,b条)利用高冗余数据增强微弱异常信号。

3.2. 结果

球形加工前后BphA4晶体的数据统计比较表明我/σ(我)和R（右）_测量分别从22.6%和13.7%提高到31.8%和9.7%。异常相关性从7.2%增加到19.0%（图3和表2)。还观察到溶剂去除的显著效果；我/σ(我),R（右）_测量异常相关性分别从22.8%、13.6%和8.1%提高到26.8%、11.7%和19.0%（图4和表3).

的成功率下部结构确定依据SHELXD公司球形和溶剂去除处理后均增加（图3e（电子）, 3（f）, 4e（电子）和4（f）)。虽然一些试验显示CC_全部的在溶剂去除前大于30%，CC中未观察到明显的开裂_全部的–立方厘米_虚弱的散点图。去除溶剂后，我们在1000个试验中发现了一个成功的试验（图4（f）)。球形加工晶体的数据显示出更明显的改善（图3)从而使成功率从33/1000提高到114/1000。球面加工后的显著改善可能是由于晶体本身对X射线吸收的误差最小所致；对于球形晶体，球形晶体内部的衍射X射线路径长度变得均匀。

接下来，我们用一个具有挑战性的例子：碳酸酐酶All2909来检验球形加工的效果。该蛋白质仅含有一个蛋氨酸残基，Bijvoet比率计算为0.86%。球形加工碳酸酐酶All2909晶体的合并数据集的数据统计如图5所示和表4最初，本机SAD阶段化是使用冗余度极高的数据集作为参考来执行的。该数据集是通过合并来自七个晶体的28个数据集而准备的。由于吸光度的高冗余性和低系统误差，该数据集具有高质量，因此可以进行自然SAD定相。接下来，减少合并数据的数量，以评估球形成形的效果。我们通过合并来自两个晶体的八个数据集来准备另一个数据集。令人惊讶的是，自动SHARP（冯海因等。2007年)，它利用SHELXD公司对于下部结构决心，成功解决了晶体结构采用本地SAD方法；二聚体分子356个残基中的322个非对称单元尽管异常信号非常微弱，但它们都是自动构建和排序的。这一结果表明，使用长波X射线的专用数据收集环境和适当的样本处理，即使对于具有挑战性的样本，也可以实现本机SAD定相。

图5 碳酸酐酶All2909球状加工晶体的衍射数据质量。(一)球面加工前后的晶体。(b条)–(天)我/σ(我),R（右）测量根据衍射分辨率绘制SigAno值。通过合并八个和28个数据集而准备的数据集图形分别以红色和蓝色显示。