2.1. 高分子生产

编码全长PepT的基因_二氧化硫（UniProt Q8EHE6）亚克隆到pET修饰的载体（Nishizawa等。, 2013)其中包含编码烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶裂解位点（ENLYFQG）的DNA序列，然后是His₆或他的₈标签位于3′端。表1总结了高分子生产信息.所有PepT_二氧化硫利用PrimeSTAR Max DNA聚合酶（Takara）通过基于PCR的定点突变方法产生突变体。

2.2。PepT表达条件的优化_二氧化硫

质粒被引入大肠杆菌罗塞塔2（DE3）细胞（Novagen）或转基因C41（DE3）细胞，其携带编码密码子tRNA的pRARE质粒，这些密码子很少用于大肠杆菌转化细胞生长于2.5 ml Luria–Bertani（LB）培养基，含50 微克 毫升⁻¹氨苄西林加或不加0.4%葡萄糖或2.5 ml 310时的极棒肉汤（TB） K.当吸光度为600时 纳米(A类₆₀₀)达到0.5–0.8，用0.5诱导蛋白表达 米M（M）异丙基β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），细胞生长约18 h在293 K、细胞在8000g下离心1次 min，然后悬浮在溶解缓冲液中[50 米M（M）Tris–HCl pH值8.0，300 米M（M）氯化钠，15 米M（M）咪唑，0.5 米M（M）三（2-羧乙基）磷（TCEP），10%甘油，2%n个-十二烷基-β-D类-麦芽糖苷（DDM）]补充cOmplete EDTA游离蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏）。细胞通过使用生物破坏者UCW-310（Cosmo Bio）的超声波作用被破坏，并在277℃下通过温和旋转溶解 K代表1.5 h.在104℃下通过超速离心去除未溶解材料后 000克对于30 277时的最小值 K、 上清液与P3NTA探针混合（内部生产；Backmark等。, 2013)并通过荧光检测进行分析尺寸排除色谱法（FSEC；卡瓦特和古奥，2006年).

2.3. PepT的大规模表达和纯化_二氧化硫

含C-末端His的质粒₆-tag-flued PepT公司_二氧化硫被引入大肠杆菌Rosetta 2（DE3）细胞（Novagen）。转化细胞生长于18 l LB培养基含50 微克 毫升⁻¹310氨苄西林 K.当A类₆₀₀达到0.5–0.8，用0.5诱导表达 米M（M）IPTG和细胞生长约18 h在293 将细胞悬浮在磷酸盐缓冲盐水中。将悬浮液均化并在冰上混合，并在130下通过4-5次破坏 使用微流控器（微流控）的MPa。25℃离心后 000克对于20 分钟后清除碎片，上清液在125℃下超速离心 000克对于1 277小时 K使用45 Ti型转子（贝克曼·库尔特）。将膜部分重新悬浮在膜缓冲液（50 米M（M）Tris–HCl pH值8.0，300 米M（M）氯化钠，0.5 米M（M）TCEP，10%甘油）添加cOmplete EDTA-游离蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏），储存于193 K直到使用。

在277℃下，将膜部分溶解在补充有cOmplete EDTA-游离蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的增溶缓冲液中 K代表2 h.在125℃下通过超速离心去除未溶解材料后 000克对于30 277时的最小值 K使用45型钛转子（Beckman Coulter），将上清液与25 ml Ni–NTA超流树脂（Qiagen）与Ni缓冲液（50 米M（M）Tris–HCl pH值8.0，300 米M（M）氯化钠，0.5 米M（M）TCEP，5%甘油，0.05%DDM），含15 米M（M）咪唑1 277小时 K、将混合物转移到Econo-色谱柱（Bio-Rad）中，并收集流通部分。用10柱体积含50的镍缓冲液清洗树脂 米M（M）咪唑，用含300的镍缓冲液洗脱蛋白质样品 米M（M）咪唑。劈开他的₆融合到PepT C末端的标签_二氧化硫，将His-tagged TEV蛋白酶（内部生产）添加到洗脱部分，比例为1:75(w个:w个)蛋白酶：蛋白质比，溶液透析两次 l透析缓冲液（50 米M（M）Tris–HCl pH值8.0，300 米M（M）氯化钠，0.25 米M（M）TCEP、5%甘油、0.03%DDM）。为了去除裂解的His-tag和His-tagged TEV蛋白酶，将溶液与Ni–NTA树脂混合，用透析缓冲液平衡1.5 277小时 K，并且使用Amicon Ultra离心过滤器（100 kDa分子量截止；Millipore）。浓缩样品在40℃进行超速离心 000 转速 最小值⁻¹对于20 使用S55A2转子（Hitachi Koki），将上清液涂在HiLoad 16/600 Superdex 200 pg色谱柱（GE Healthcare）上，用50 pg的SEC缓冲液平衡 米M（M）Tris–HCl pH值8.0，300 米M（M）NaCl、5%甘油、0.03%DDM。纯度和同质性FSEC对蛋白质样品进行了评估。蛋白质样品的纯度也通过SDS-PAGE进行评估。蛋白质浓度根据280的吸光度进行估算 纳米(A类₂₈₀)使用NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测量。使用肽质量指纹法分析SDS-PAGE凝胶中检测到的蛋白质条带。

2.4. 皂苷A的表达与纯化

将皂苷A的编码区克隆到含有N末端His的改良pET-28b载体中₆标记后跟“eTEV”序列（Tabata等。, 2018)，得到蛋白序列MGSSHHHHHSSGLVPRENLYFQGMGSLPCDICKDVVTAAGDMLKDNATEEILVYLEKTCDWLPKPNMSASCKEIVDSYLPILDIIKGEMSRPGEVCSALNCES。TEV蛋白酶裂解的蛋白质代表具有三个额外N末端残基（Gly-Met-Gly）的皂苷A多肽序列。根据先前报道的方法（Frauenfeld）进行皂苷A的表达和纯化等。，2016年).

2.5. PepT的重建_二氧化硫成Salipro颗粒

用于重建PepT_二氧化硫转化为Salipro纳米粒子，8 µl纯化PepT_二氧化硫第20.4页 毫克 毫升⁻¹TBSGD缓冲器中（25 米M（M）Tris–HCl pH 8.0，5%甘油，0.03%DDM），30 5微升 毫克 毫升⁻¹DMPG（Avanti）脂质溶液在脂质溶解缓冲液中（50 米M（M）HEPES–NaOH pH 7.5，150 米M（M）氯化钠，0.224%DDM）和12 µl HBSD缓冲液（50 米M（M）HEPES–NaOH pH 7.5，150 米M（M）NaCl、0.03%DDM）混合并在298下孵育 K代表5 最小值下一个，120 1.2µl纯化皂苷A 毫克 毫升⁻¹并将混合物在278下孵育 K代表5 最小值随后，114 µl saposin SEC缓冲液，由25 米M（M）磷酸钠pH 7.4200 米M（M）将氯化钠添加到混合物中，并在278℃下培养 K代表5 分钟，之后234 添加µl皂苷SEC缓冲液。将混合物注入Superdex 200 Increase 10/300 GL色谱柱（GE Healthcare）中，用皂苷SEC缓冲液平衡。含有Salipro–PepT的组分_二氧化硫合并并浓缩至～0.5 毫克 毫升⁻¹使用Amicon Ultra离心过滤器（30 kDa分子量截止；Millipore）。

2.6. 低温电磁样品制备和数据收集

Quantifoil铜200目R1.2/1.3多孔碳格栅在玻璃载玻片上辉光放电30次 第2.6节 微升等分的将样品溶液的一半涂在网格上，并用滤纸吸干4.5 s在100%湿度和277 K、 然后使用试管机器人Mark IV（赛默飞世尔科技公司）将格栅迅速放入液态乙烷中，使其迅速冻结。将栅极插入200℃运行的Talos Arctica FEG透射电子显微镜（Thermo Fisher Scientific） kV，低温阶段用液氮冷却。使用Falcon 3EC 4k×4k CMOS直接电子探测器（Thermo Fisher Scientific）在计数模式下以标称放大倍数×96记录低温EM图像 000，对应于0.87的图像像素大小 Å，使用电子动力装置软件包。PepT的电影帧_二氧化硫以1.2的剂量率，以10°增量，从30°至50°的倾斜角度收集包埋在Salipro中的四聚体 e每像素每秒，曝光时间为68.38 s.累计敞口总额为82 e（电子） Å⁻²被分割成102帧。使用1.0到3.0的离焦范围，在一个会话中收集了1609张显微照片（30°倾斜，1275张显微照片；40°倾斜，272张显微照片，50°倾斜，62张显微照片）的数据集 微米。

2.7. 图像处理

使用了从30°到50°的各种倾斜的数据集。电影帧随后被对齐，以校正梁诱导的移动和漂移，使用MotionCor公司2（郑等。, 2017)，并且对比度传递函数（CTF）的参数使用Gctf公司（张，2016)。总计288 使用Gautomach公司(https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/)，然后使用依赖-3.0（齐瓦诺夫等。, 2018)。从良好的2D类中选择粒子图像，以获得PepT的初始3D模型_二氧化硫嵌入Salipro中的四聚体冷冻SPARC（Punjani）等。, 2017)带有C类4对称性。总共43个 来自最佳3D类别的172个粒子接受了3D精细化，重建后的分辨率为5.9 奥和aB类系数−307 Ų.使用搜索范围为±2000的每粒子离焦进一步细化了3D定义的结构 奥氏和贝叶斯抛光，将分辨率提高到4.3 带有B类系数−171 Ų为了进一步提高分辨率，CTF精细化使用波束时间校正和贝叶斯抛光进行了两次迭代，得出4.3 ？分辨率和aB类系数−161 Ų最后4.1 ？分辨率和aB类系数−147 Ų。3D密度图使用UCSF奇美拉（佩特森等。, 2004).

2.8. X射线晶体学分析

PepT_二氧化硫以2:3的比例将样品与单油精（Nu-Chek Prep）混合(w个:w个)使用耦合注射器的蛋白质：脂质比率。混合物液滴（30 nl）被分配到96 well Laminex玻璃夹芯板（MD11-50-100；分子尺寸）上，并覆盖800 nl储层溶液，使用Gryphon LCP结晶机器人（Art Robbins）。293进行初始结晶筛选 K使用内部生产的网格筛结晶工具作为储层溶液。为了优化结晶条件，除了优化沉淀剂和盐的pH值和浓度外，还将StockOptions Salt and Additive Screen（Hampton Research）添加到LCP结晶的储层溶液中。使用MicroMeshes（MiTeGen）、MicroMounts（MiTeGen）或LithoLoops（Protein Wave）采集晶体，并在液氮中进行闪冷。结晶信息见表2.

2.9. X射线数据采集和处理

所有X射线衍射数据集通过螺旋数据收集方法收集，使用SPring-8光束线BL32XU（Hirata等。, 2013)。通过光栅扫描确定衍射良好晶体的位置，并从每个晶体收集5°或10°楔形数据。所有衍射数据均用XDS公司（卡布施，2010年)和与合并XSCALE公司基于层次聚类分析的互相关方法在卡莫软件（Yamashita等。, 2018).

分子替换用相位器（麦考伊等。, 2007)。对于结构测定表单的B类晶体，分子的结构A类PepT的_二氧化硫（PDB条目4个lep)，报道为二聚体形式，用作搜索模型。对于结构测定表单的A类晶体，结构由形式决定B类晶体（PDB入口6千卡)被用作搜索模型。模型构建使用库特（埃姆斯利和考坦，2004年; 埃姆斯利等。, 2010).精炼使用执行菲尼克斯定义（亚当斯等。, 2010)和REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011)使用中央对手方清算所4我2接口（波特顿等。, 2018)。表3总结了数据收集统计数据。分子图形是使用生成的CueMol公司(网址：https://www.cuemol.org).

2.10. 低温电磁模型的建立

这个晶体结构PepT的_二氧化硫在本工程中确定（形式B类晶体）作为刚体拟合到3D密度图中，使用UCSF奇美拉和库特（埃姆斯利和考坦，2004年; 埃姆斯利等。, 2010).精炼使用执行菲尼克斯定义（亚当斯等。, 2010)。使用真实空间细化构象精细化在里面菲尼克斯（亚当斯等。, 2010)带有二级结构约束。我们首先执行模型精细化针对相应的EM图分别针对每个亚单位。为了解决子单元接口中可能出现的冲突，我们根据相应的EM映射对整个模型进行了细化。表4总结了细化统计对于整体结构，沉积图及其相关坐标。

3.1. 基于FSEC的表达条件优化

用于四聚体PepT的结构分析_二氧化硫，优化表达和纯化条件。全长PepT_二氧化硫在C末端与His标签融合后，使用改良的pET载体（Nishizawa）表达等。, 2013; 表1)，以及表达式级别和同质性使用基于FSEC的高通量筛选方法对样品进行了评估（Kawate&Goauux，2006)使用P3NTA肽作为探针（Backmark等。, 2013)。出乎意料的是，融合到C末端的组氨酸残基的数量极大地影响了齐聚PepT状态_二氧化硫和他的₆-标记为PepT_二氧化硫更容易形成四聚体（图1一)。在我们测试的条件下，PepT的表达水平_二氧化硫在BL21（DE3）衍生菌株中大肠杆菌与之前研究中使用的C41（DE3）菌株（Guettou等。, 2013)。在表达宿主中是否存在读取罕见密码子的tRNA并不影响表达水平。向培养基中添加葡萄糖不会影响表达水平。PepT的表达水平_二氧化硫与之前的研究中使用的TB培养基相比，使用LB培养基时的含量更高。这些培养条件影响表达水平，但不影响齐聚PepT状态_二氧化硫.

图1 蛋白质制备。(一)荧光检测尺寸排除色谱法基于（FSEC）的His分析6（黑色）和他的8（红色）构造。组氨酸标签特异性荧光探针P3NTA用于检测（激发，482 纳米；排放，520 纳米）。四聚体PepT对应的峰二氧化硫标有星号。(b条)证券交易委员会色谱图纯PepT的二氧化硫.荧光检测器监测主要来自色氨酸残基的荧光信号，激发强度为280 350 nm和发射 纳米。四聚体PepT对应的峰二氧化硫标有星号。(c（c）)考马斯亮蓝染色SDS-PAGE分析。左车道，分子量标记（标记单位为kDa）；右车道，来自SEC净化的合并峰值分数。

3.2. PepT的大规模表达和纯化_二氧化硫

C末端His₆-标记为PepT_二氧化硫在本研究优化的条件下大规模表达。佩普_二氧化硫用DDM溶解后通过Ni–NTA纯化亲和层析然后是他的标签，第二个Ni-NTA色谱法去除His-tagged TEV蛋白酶和尺寸排除色谱法（美国证券交易委员会）。美国证券交易委员会色谱图在SDS–PAGE分析中，峰显示出单分散性，峰组分显示出单一条带，显示出高纯度和同质性获得的PepT的_二氧化硫样品（图1b条和1c（c）)。PepT的洗脱体积_二氧化硫在SEC色谱图是14.8 使用Superose 6 Increase柱（GE Healthcare）在含有DDM的缓冲液中加入ml（图1b条)，这是四聚体PepT的合理洗脱位置_二氧化硫（分子量约为200 kDa）。最终产量约为2.5 毫克/升大肠杆菌文化。

3.3. PepT的单粒子冷冻电镜分析_二氧化硫

通过PepT了解低聚物形成的结构_二氧化硫，我们重建了PepT_二氧化硫使用皂苷A和DMPG将其转化为Salipro纳米粒子脂质，并使用低温电子显微镜进行单粒子分析（图2一–2e（电子），补充图S1）。虽然在PepT的低温电子显微镜照片中可以清楚地观察到方形颗粒_二氧化硫在Salipro重建，整体分辨率限制在6.7 由于严重的取向偏差，图的质量太差，无法细化原子模型（补充图S1）。有趣的是，在之前的研究中没有报道过这种首选样本定向问题（弗劳恩菲尔德等。，2016年)。在之前的研究中，牛脑脂提取物被用于重建，但该产品已不再商业化。在脂类本研究中用于重建可能会影响溶液条件下试样的物理性质，从而导致优选试样的取向问题。为了减少方向偏差，我们尝试通过将网格从30°倾斜到50°（Tan等。, 2017)这大大提高了数据质量（补充图S1）。总共43个 172个来自三个不同倾斜角（30°、40°和50°）的选定粒子生成了总分辨率为4.1的三维EM图 根据金标准傅里叶壳相关（FSC）0.143标准（Scheres&Chen，2012）; 图2天，补充图S2，表4)。PepT的四聚体结构_二氧化硫在最终的3D密度图中清晰可见（图2（f）)，其中与先前的研究相比，来自庞大氨基酸残基的二级结构特征和侧链密度更清晰（6.5 分辨率；弗劳恩菲尔德等。，2016年; 图2克)。由皂苷A和脂类在四聚体PepT周围也观察到_二氧化硫分子；然而，与PepT相比，这些区域的密度并不明显_二氧化硫分子（图2小时)表明Salipro支架区域具有灵活性。EM密度图表明，TM螺旋之间的细胞外环对四聚体组装的贡献在之前的研究中没有得到很好的解决（图2小时和2（f）)。然而，原子水平齐聚由于决议限制，机制尚不明确。

图2 PepT的单篇分析二氧化硫使用低温电子显微镜。(一)PepT的Salipro重建二氧化硫.PepT重组前后的SEC色谱图二氧化硫分别显示为灰色和黑色线条（左侧面板）。用SDS–PAGE（右侧面板）分析红色箭头所示的峰分数。(b条)PepT的原始电子显微照片二氧化硫.Salipro-recomposed PepT二氧化硫粒子用红色圆圈表示。(c（c）)由粒子生成的代表性2D类平均值。比例尺代表10 纳米。(天)两个独立细化的半衰期图之间的金标准FSC。(e（电子）)倾斜法收集的所有颗粒的欧拉角分布。(（f）)四聚体PepT的三维密度图二氧化硫并入Salipro纳米颗粒中。原子模型通过使用晶体结构在本研究中确定为初始模型。(克)选定螺旋和侧链的密度。(小时)分子间相互作用区域周围的密度。原聚体的胞外环被染成绿色，相邻原聚体的H12被染成品红色。

3.4. PepT的X射线晶体学分析_二氧化硫

为了进一步提高分辨率，我们尝试结晶四聚体PepT_二氧化硫使用LCP方法（Caffrey和Cherezov，2009)蛋白质浓度为20、45和75 毫克 毫升⁻¹.PepT的微晶_二氧化硫使用45 毫克 毫升⁻¹含有PEG 200作为沉淀剂的多种条件下的样品（图3)。由于晶体尺寸太小，无法从单晶中收集数据，因此使用位于日本兵库县SPring-8的BL32XU的微焦点束从微晶中收集小楔形数据，并使用多晶体合并软件进行组合卡莫（山下等。, 2018)。通过使用以前报道的PepT结构的分子置换方法_二氧化硫二聚体（PDB入口4个lep，分子A类)作为搜索模型（Guettou等。, 2014)，窗体的结构A类和B类晶体最终以3.9和3.5的分辨率测定 分别为？（表3).

图3 PepT的LCP晶体二氧化硫. (一)形状的晶体A类. (b条)形状的晶体B类.

3.5. 四聚体PepT的整体结构_二氧化硫

PepT_二氧化硫从两种晶体形式（形式A类和B类)以类似方式组装成四聚体（r.m.s.d.为0.83 对于所有C，为^α原子），尽管空间群和晶体填料不同（表3，补充图S3）。因此，在下文中，我们将重点讨论从表单中获得的结构B类水晶（图4一, 4b条和4c（c）)由于其电子密度的质量优于其他晶体形式。四聚体中的所有原聚体均采用向内开放的构象，其中一个大的中心亲水底物结合囊朝向膜的胞内侧。结构比较表明，目前的四聚体结构在原聚体水平上与先前报道的二聚体结构重叠良好（r.m.s.d.为1.1 对于所有C，为^α原子；补充图S4一)。目前的晶体结构很好地符合本研究中获得的低温电子显微镜图（图2（f），补充图4b条).

图4 PepT的四聚体组织二氧化硫. (一,b条,c（c）)四聚体PepT的总体结构二氧化硫是从(一)细胞外(b条)膜和(c（c）)细胞内侧。这四种原生质体分别为紫红色、绿色、蓝色和黄色。标记的矩形`天'和`e（电子）'指示中突出显示的区域(天)和(e（电子）)分别是。(天,e（电子）)细胞外环（ECL）与邻近原聚体H12的分子间相互作用从(天)细胞外和(e（电子）)膜侧。可能的氢键高达3.2 以黑色虚线表示。(（f）)答2毫发o个负极DF公司c（c）ECL和H12之间相互作用区域的电子密度图，等高线为1.1σ两个原生质体的C原子分别为洋红色和绿色。(克)PepT的序列比对二氧化硫ECL地区的其他原核POT家族。(小时)基于FSEC的PepT突变分析二氧化硫.四聚体PepT对应的峰二氧化硫标有星号。

3.6. PepT的分子间相互作用_二氧化硫四聚体

在本研究确定的结构中，与先前报道的二聚体结构相比，还观察到H12的滑动运动（补充图4一)，支持先前报告中提出的H12对四聚体形成的重要性（Guettou等。, 2014)。在细胞内，一个原聚体的H12与相邻原聚体H5和H8之间形成亚单位间疏水相互作用（图4c（c）)。在当前结构的细胞外侧，可以清楚地观察到细胞外环（ECL）的电子密度，这在以前的结构中没有很好地解决（图4（f）)。ECL由H7-H8（ECL）之间的两个细胞外连接子组成_一)和H9–H10（ECL_b条)（图4天和4e（电子）)，其中四个β-股线形成平行和反平行β-板材结构。结构表明ECL在PepT中起着重要作用_二氧化硫四聚体的形成，以及H12（图4天和4e（电子）)。ECL通过疏水或氢键相互作用与相邻原聚体的H9和H12相互作用（图4一, 4天和4e（电子）)。在之前的研究中，H12中Asn468对PepT四聚反应的重要性_二氧化硫建议（Guettou等。, 2014)。本研究中确定的高分辨率结构清楚地表明，H12中Asn465和Asn468的侧链与相邻原聚体的ECL形成氢键，从而稳定了四聚体（图4一, 4天和4e（电子）)。这两个天冬酰胺残基和ECL的氨基酸序列在POT家族成员中不保守。有趣的是，PepT的ECL_二氧化硫与其他原核同源物相比，其结构被报道为单体或二聚体（图4克)。相反，在进化上与PepT更接近的POT家族成员中_二氧化硫在氨基酸水平上，ECL的肽长度被保留，而氨基酸序列不是高度保守的。这些结果表明，这些非保守氨基酸残基在PepT中起着重要作用_二氧化硫-特异性四聚体的形成，使用FSEC的突变分析进一步支持了这一点（图4小时).