1.简介

埃博拉病毒能够引起一种表现为严重出血热的疾病，病死率高达90%(1976年扎伊尔埃博拉出血热, 1978). 虽然疫情一般在地理上是孤立的，但2014-2015年的疫情造成了28起以上疫情 000例并在国家之间传播（赫西等。, 2015). 埃博拉病毒是一种非片段化的负义RNA病毒，其RNA基因组在病毒的整个生命周期中都被病毒核蛋白（NP）包裹。这种蛋白-RNA复合物作为额外病毒蛋白的支架，包括病毒聚合酶，以进行病毒转录和复制。RNA、核蛋白和这些额外的病毒蛋白的复合物形成核衣壳，是埃博拉病毒的结构组成部分。全长埃博拉病毒核蛋白长度为739个氨基酸。然而，N末端450氨基酸（NP 1–450）对于蛋白质来说是必要的和足够的齐聚和RNA结合（渡边等。，2006年)，并且该蛋白质的N末端区域在病毒粒子中形成类似NP的螺旋丝（Bharat等。, 2012).

NP的行列式齐聚和RNA结合一直是一些结构研究的重点。晶体结构和氢/氘交换质谱法已经表明NP的N末端区域具有一个折叠的核，其两侧是无序区域（Kirchdoerfer等。, 2015; 梁等。, 2015). NP的折叠核具有N端和C端叶，主要是α-螺旋结构。埃博拉病毒NP的有效晶体结构均使用单体NP（Dong等。, 2015; 柯奇多尔等。, 2015; 梁等。, 2015). 在其中两个结构中，NP与病毒蛋白35（VP35；Kirchdoerfer）的肽结合等。, 2015; 梁等。, 2015). VP35肽的结合被认为对维持NP的单体状态和防止宿主RNA过早和非特异性包被很重要（Kirchdoerfer等。, 2015; 梁等。, 2015; 莱拉等。, 2011).

去除VP35肽后，NP齐聚成线性聚合物能够封装RNA。齐聚作用NP的N端和C端蛋白区域介导到两个折叠的NP 1–450核心（Kirchdoerfer等。, 2015; 梁等。, 2015). 这个齐聚NP引起两个叶之间的构象变化，为RNA创造高亲和力结合位点（Kirchdoerfer等。, 2015; 杉田等。，2018年). 埃博拉病毒核衣壳和埃博拉流感病毒NP 1–450的冷冻电子断层扫描（Cryo-ET）研究证明了NP丝的左手螺旋性质，以及NP的第一个结构证据齐聚调节NP单体之间接触的区域（Wan等。, 2017). 然而，这项早期低温-ET工作的有限分辨率使人们无法清楚地阐明NP之间以及与RNA之间的分子相互作用。最近使用单粒子低温电子显微镜（cryo-EM）对NP 1–450进行的研究确定，该螺旋丝的结构为3.6 分辨率（Sugita等。，2018年). 这种结构揭示了单体、伴侣NP和寡聚体、RNA-bound NP之间的分子相互作用和构象变化。这里，我们使用单粒子低温电子显微镜以3.1的改进分辨率测定了NP 1–450螺旋的结构 Å.

2.材料和方法

3.结果

NP螺旋丝在对齐的剂量加权显微照片电影中具有倒钩状外观（图1). 粒子的二维排列揭示了具有明显二级结构特征的类别。精细的3D粒子方向显示了垂直于螺旋轴的视图的优势，正如在原始显微照片中选取的螺旋丝方向所预期的那样（图2一). 最终映射的精细螺旋参数为−14.71°扭曲和2.84 每个NP原聚体的上升。重建后的地图分辨率为3.1 使用金标准傅里叶-壳层相关截止值0.143进行估算。局部分辨率估计显示分辨率范围为3.0–3.8 奥（图2)，NP折叠核心显示最高分辨率，而外围表面暴露区域重建为较低分辨率，可能表明局部迁移或构象复形。

图1 通过二维对齐进行图像采集和处理。(一)对原始显微照片电影进行校准和剂量加权。比例尺为100 纳米。(b条)拾取粒子的二维对齐显示了粒子的螺旋性质，并有二级结构的证据。

图2 粒子角度分布和贴图分辨率。(一)精细粒子取向的角分布表明垂直于灯丝轴的视图（红色）占主导地位。(b条)傅里叶壳层相关图显示分辨率为3.1 使用金色标准FSC截止值0.143，如虚线所示。NP螺旋丝的局部分辨率(c（c）)和一个孤立的NP原聚体(d日)估计为RELION公司（库库克尔比尔等。2014年)表明NP的高分辨率折叠核具有低分辨率外围区域。

地图的高分辨率使建筑和精炼埃博拉病毒NP与RNA结合的原子模型。大多数氨基酸的侧链密度很明显，我们观察到6种氨基酸的密度核苷酸RNA，类似于先前的研究（Sugita等。，2018年; 图3). 由于NP被认为与RNA结合而没有序列特异性，RNA核苷酸在地图上看到的表示界的平均值核苷酸。我们将这种密度建模为六个腺苷残基的聚合物，因为正如预期的那样，这些残基都不进行序列特异性接触。

图3 模型与重建密度的拟合。NP–RNA螺旋丝的立体视图(一)结合RNA(b条)N端子齐聚手臂和(c（c）)C端子齐聚螺旋线。

此处显示的坐标模型与之前发布的3.6很好地重叠 与RNA结合的NP（Sugita等。，2018年; 图4). 在之前发布的地图和此处显示的地图之间，似乎存在2.2%的各向同性拉伸。我们将此归因于之前收集的数据的像素大小校准中的问题。然而，这种影响很小，不太可能影响之前研究得出的结论。未来的抗病毒药物开发工作可能受益于记录此类校准问题，以产生更准确的模型。

图4 (一)3.1的立体视图 这里给出的分辨率模型（深绿色）与之前发布的3.6叠加 ？分辨率蛋白质模型（浅绿色；PDB入口5z9瓦; 杉田等。，2018年). 此处所示模型中的结合RNA显示为棒状。3.1的比较 这里显示的分辨率密度(b条)使用3.6 Sugita的光学分辨率密度等。(2018) (c（c）)显示了中高分辨率数据的RNA碱基的更清晰定义(b条).

NP与RNA的相互作用主要由静电相互作用介导，其中Lys160、Arg174、Arg298、His310和Arg401直接与RNA主干带负电荷的磷酸盐相互作用（图5一). 其他残留物Val178、Leu245、Leu331和Val334为疏水填料创造了表面核苷酸碱基。启动-启动NP相互作用似乎最小。螺旋线匝间间隙大（图5b条)提示由带电荷的氨基酸在匝间介导的柔性或构象异构的侧链相互作用，这之前被假设为赋予NP丝柔性（Sugita等。，2018年).齐聚作用NP的折叠是由侧对侧相互作用以及NP折叠核心两侧的N-和C-末端区域介导的（图5c（c）). 侧对侧NP相互作用由盐桥和疏水相互作用的混合物介导（图5d日). N端子齐聚该区域是一个螺旋，通过短连接体连接到NP的折叠核心。该螺旋将Ile24埋入邻近NP的疏水囊中，并与VP35伴侣肽（Kirchdoerfer等。, 2015; 梁等。, 2015)图5e（电子）). C端子齐聚区域折叠成一对螺旋，这些螺旋叠加在相邻NP的等效螺旋上，主要使用疏水残基（图5（f）). 这些螺旋的形成创造了一个平台，将折叠NP核的C末端叶的疏水表面放置在该平台上，支持NP核中寡聚化诱导的NP构象变化模型，以创建RNA-结合位点。

图5 蛋白质–参与NP齐聚和RNA结合的蛋白质界面。(一)RNA在折叠核心的NP N端和C端叶之间结合，由几个基本氨基酸以及核苷酸碱基堆积的疏水表面的形成介导。(b条)NP之间的导通-匝间相互作用最小，螺旋匝间存在较大间隙。(c（c）–（f）)NP-蛋白质-蛋白质相互作用在相互作用中扩散(d日)，N端子齐聚地区(e（电子）)和C端子齐聚地区(（f）).

4.讨论

与其他非片段负义RNA病毒的核蛋白类似，埃博拉病毒核蛋白开始其生命，由VP35以单体形式伴随，然后转变为与病毒RNA结合的寡聚形式。这里，我们展示了寡聚RNA结合埃博拉毒核蛋白的高分辨率低温电子显微镜结构。从伴侣单体到寡聚体、RNA-结合形式的转变涉及广泛蛋白质-蛋白质界面的破坏和形成，这些界面与构象变化相耦合。从伴侣单体中去除VP35肽是这些变化的先决条件（Kirchdoerfer等。, 2015)，尽管VP35是如何删除的体内尚不清楚，可能涉及其他细胞或病毒因子，如病毒聚合酶L。从NP中去除VP35后，NP N末端齐聚传入单体的区域和侧面NP能够与相邻的NP相互作用。C末端的后续折叠齐聚螺旋创造了一个疏水平台，通过其C端叶结合传入的NP。NP的C端螺旋的这种相互作用_我−1带有NP的C端叶_我导致NP的C端叶移动_我朝向N末端叶，形成RNA-结合位点。以这种方式将单体NP添加到生长的低聚物中，可以使病毒RNA在5′至3′方向上被包裹，这一机制有助于病毒RNA的共复制包裹。与该模型相关的一个未知问题是，如何逆转这一过程，使病毒RNA暴露于RNA合成，因为核苷酸碱基当用NP包埋时，不能作为聚合酶模板。

3.1 这里介绍的分辨率结构概括了之前发布的3.6中观察到的特征 奥分辨率结构（Sugita等。，2018年)包括蛋白质与蛋白质和蛋白质与RNA的相互作用。改进的分辨率提供了蛋白质侧链和核苷酸碱基，阐明NP原生质体和RNA之间的分子接触。埃博拉病毒仍然是世界卫生安全的新威胁。应对这一威胁的关键是发现和评估新的治疗方法。与RNA结合的埃博拉病毒NP的高分辨率结构将更好地描述以病毒核衣壳组装为靶点的潜在抗病毒药物。