1.简介

线粒体含有大量蛋白质。然而，线粒体只能自行合成少数蛋白质（西克曼等。, 2003; 灰色等。, 1999)。大多数线粒体蛋白质在细胞溶质中被翻译，并通过一种多蛋白复合体运输到线粒体：外膜复合体的转位酶（TOM）和内膜复合体（TIM）的转位酶（Neupert&Herrmann，2007）)。超过一半的线粒体前蛋白是通过形成带正电的N末端前序列合成的两性恋的将前蛋白靶向线粒体的螺旋。前蛋白通过外膜（TOM）复合体的一般转定位酶和内膜（TIM23）复合体（Abe）的前序列转定位酶导入等。, 2000; 查辛斯卡等。, 2009; Wu&Sha，2006年; 阿尔德等。, 2008; 沃尔格特尔等。, 2009)。经过TOM复合体后，带有N末端靶向预序列的前蛋白被Tim50（TIM23复合体的重要成员）在膜间空间（IMS；盖斯勒等。2002年; 山本等。2002年; 莫克拉尼亚克等。, 2003; 拉赫曼等。2014年)。在TIM23复合体内，TIM23蛋白的C末端半部分形成穿过线粒体内膜的跨膜通道。Tim50的IMS域与Tim23的N末端IMS域相互作用，将前蛋白传递给Tim23（Schulz等。, 2011)。Tim50还起到枢纽蛋白的作用，与其他TIM23复合物成员如Tim21相互作用，调节TIM23跨膜通道的打开和关闭（Chacinska等。, 2005; 梅内克等。, 2006; 利托夫琴科等。, 2013).

Tim50的IMS结构域包含一个抗胰蛋白酶的核心结构域，其中包含164–361个残基。这个晶体结构Tim50（164–361）的分辨率已确定为1.83 奥（钱）等。, 2011)。这个晶体结构Tim50（164–361）中包含一个大槽，作为预设序列的假定绑定位置，并有一个凸起β-发夹。已经证明β-发夹对于Tim50和Tim23的相互作用至关重要，这表明这两种重要的Tim23蛋白在前蛋白输入中具有协同作用。据报道，N末端靶向预序列构成了一个两性恋的螺旋线（Abe等。, 2000)。Tim50（164–361）结构中鉴定的推定序列前结合槽足够大，可以容纳α-由预序列形成的螺旋线。然而，目前尚不清楚前蛋白受体Tim50如何在分子水平上与前序列螺旋相互作用。

Tim50作为膜间空间的前蛋白受体，能够与大量不同的前序列相互作用。为了适应不同的预序列，Tim50可能在假定的预序列绑定槽处表现出构象灵活性。本研究提供了结构证据，表明Tim50的假定预序列结合槽具有显著的塑性，可以与不同的预序列相互作用。有趣的是，新解决的Tim50（164–361）结构中的晶体堆积提供了信息，以揭示Tim50的IMS域具体识别预序列螺旋并与之交互作用的机制。

2.方法

酿酒酵母Tim50（164–361）按照钱的描述进行表达和纯化等。(2011)。使用悬滴蒸汽扩散法在条件100下生长晶体 米M（M）MES pH 6.0，1.6 M（M）硫酸镁₄（表1)。晶体为针状，尺寸为0.1×0.1×0.5 mm.数据收集自在含有20%甘油的母液中冷却的晶体。晶体将X射线衍射到2.67 APS处SER-CAT波束线上的光学分辨率（表2)。这些新获得的晶体没有以前产生的晶体衍射（钱等。, 2011)，可能是因为在非对称单元在新获得的晶体中。数据处理中使用了100幅振荡为1°的衍射数据图像。衍射数据使用香港（HKL）-3000（次要等。, 2006)。Tim50（164–361）结构的原子坐标（PDB条目3夸尔; 钱等。, 2011)被用作分子置换方法中的搜索模型，使用相位器（麦考伊等。2007年)。模型由手动构建库特（埃姆斯利和考坦，2004年).精炼使用REFMAC公司（Vagin&Teplyakov，2010年)来自中央对手方清算所4套房（优胜者等。, 2011)。坐标和结构因子已存放在PDB中，并带有登录代码4平方英尺.

3.结果和讨论

在本研究中，我们描述了晶体结构酵母Tim50（164–361），这与我们之前报道的情况有显著不同（钱等。, 2011)。结构数据支持这样一种观点，即Tim50假定的前序列结合沟可能具有显著的结构灵活性，可以识别线粒体生物发生的各种前蛋白并与之相互作用。数据还说明了Tim50可以专门识别并与两性恋的预排序螺旋。

这个晶体结构属于酿酒酵母本研究中测定的Tim50（164–361）命名为Tim50_new晶体结构前面描述的Tim50（164–361）中的一个被称为Tim50_old（Qian等。, 2011)。Tim50_new的结构测定为2.67 使用Tim50_old作为搜索模型的分子置换法的奥数分辨率（表1和2)。在Tim50_new结构中，残基177–356的电子密度可见。在Tim50_new中，Tim50 IMS结构域分子形成一个单体，由五个α-螺旋（A1–A5）和九个β-绞线（B1–B9）（图1)。该结构的核心由平行线构成β-由B1、B4、B5、B8和B9形成的板材。A类β-从Tim50分子表面突出约15的发夹 ？由B2和B3以及B2和B2之间的短回路形成（图1)。靠近突出部分β-发夹，Tim50_new包含一个大槽，该槽被假设为预序列绑定位置（图1)。一个中有六个单体非对称单元Tim50_new，而在非对称单元时间50_old。

图1 Tim50_new的晶体结构。(一)Tim50_new结构在功能区表示中显示为立体视图。分子的N端和C端被标记。二级结构A1、A2、B2和B3已标记。假定的预顺序绑定槽用箭头表示。图中所示的Tim50分子是单体E类在中非对称单元Tim50_new，属于I组(b条)。Tim50_new结构如所示表面电位代表。Tim50_new分子的取向与(一)。适用于表面电位如下图所示。本文中的数字都是使用PyMOL公司.

当将Tim50_new结构与Tim50_old结构进行比较时，大多数分子重叠得很好。然而，突出部分发生了显著的构象变化β-由B2和B3以及附近的螺旋A2形成的发夹（图2一)。Tim50_new的主体，不包括突出部分β-发夹和螺旋A2可以与Tim50_old中的对应物很好地重叠，根平方偏差（r.m.s.d）为0.550 ω表示主链原子。相反，突出物的尖端β-发夹偏离分子主体4.5 与Tim50_old结构中的Å相比，Tim50_new结构中的Å（图2一)。同时，附近的螺旋线A2移动约5 朝向凸出物的方向β-发夹（图2一)。此外，Tim50_new中的螺旋A2比Tim50_old中的多2圈。因为突出β-发夹和螺旋A2构成Tim50假定的预序列结合槽的一侧，Tim50_new中的构象变化可能会显著改变槽的物理性质。这些结构观察表明，Tim50的IMS结构域在假定的前序列结合沟中表现出显著的结构可塑性，这可能在Tim50作为与各种前序列相互作用的TIM23复合体中的受体蛋白的功能中发挥重要作用。Tim50假定的预序列绑定槽有能力调整其自身构造，以适应不同尺寸、疏水性和其他物理性质的预序列，这是合理的。

图2 突出的部分β-发夹和附近的螺旋A2在Tim50分子中表现出结构可塑性。(一)金中的Tim50_新结构与银中的Tim 50_旧结构重叠。该图中的Tim50分子从图1中的方向绕水平轴旋转约90°。1。图中假定的预序列绑定槽面向读取器。标记了次级结构A2、B2和B3。Tim50的N端和C端被标记。此处显示的Tim50_new结构是单体E类在中非对称单元，属于I组(b条)基团I和II的Tim50_新单体的结构重叠。I组单体E类为金和II类单体A类为青色。二级结构A2、B2和B3已标记。Tim50的N端和C端被标记。图中的Tim50分子与(一)。假定的预序列绑定槽已标记。

通过比较一个单体结构中的六种单体结构，可以进一步说明Tim50假定的预序结合槽的结构塑性非对称单元Tim50_new的。一个单体中的六个单体非对称单元Tim50_new的称为分子A类——F类当仔细检查六个分子的结构时，我们发现这六个分子可以分为两组。分子B类,C类和E类在整个结构中都有非常相似的结构，属于I组。另一方面，分子A类,D类和F类在突出部分采用不同的构造β-发夹和螺旋A2来自第一组，属于第二组。当第一组构件的结构与第二组构件重叠时，很明显，两组构件之间的结构主体非常相似。然而，突出的β-发夹和螺旋A2显示了两组成员之间的显著差异（图2b条)。凸起主链原子的平方根偏差（r.m.s.d）β-发夹和螺旋A2为～2 当I族和II族单体叠加时，表明推定的序列前结合槽内发生了显著的构象变化。突出的部分β-Tim50_new和Tim50_old中第一组和第二组成员的发夹和螺旋A2显示出三种不同的构象。因此，我们通过比较Tim50_new和Tim50_old结构以及比较非对称单元Tim50_new的研究表明，Tim50的IMS域在假定的预序列结合槽周围表现出显著的结构塑性。突出的部分β-Tim50 IMS域内的发夹和螺旋A2可以采用多种构象，而Tim50主体（164–361）保持一种稳定构象。

有趣的是β-发夹和螺旋A2在相同的结晶条件下，即使在结构上也表现出不同的构象。为了进一步了解Tim50_new的I族和II族成员采用不同构象的机制，我们检查了由晶体堆积产生的I族成员和II类成员的相邻分子。我们推断Tim50（164–361）的邻近环境可能在Tim50的构象中起着重要作用。令人惊讶的是，对于基团I和基团II的成员，假定的预序列结合槽被相邻单体的二级结构占据。对于I组成员，来自相邻单体的螺旋A1对接到假定的序列前结合槽中，而对于II组成员，来自相邻单体的N-末端富含脯氨酸的环插入假定的序列前结合槽中（图3)。与此形成鲜明对比的是，当我们检查Tim50_old结构中的晶体封装时，假定的预序列绑定槽实际上是空的（数据未显示）。因此，Tim50_old很可能代表Tim50 IMS域的无序列前构象，而Tim50_new对应于Tim50的IMS域序列前结合构象。第一组和第二组成员之间的结构差异非对称单元Tim50的新结构表明，Tim50 IMS域的假定预序列绑定槽可能采用不同的构象来适应各种预序列。

图3 Tim50_new分子的预设序列结合槽被晶体堆积产生的相邻分子的二级结构占据。(一)相邻分子（单体）的螺旋A1A类)对接在假定的单体预序结合槽中E类Tim50_新结构的主要原因是疏水相互作用。单体E类Tim50_new属于I组，以金色显示。相邻分子的螺旋A1以浅蓝色显示，并标记为A1′。单体的二级结构A2、B2和B3E类已标记。标记A1′的残基Tyr223、Tyr277和Gln230，B2和B3的残基Trp207和Trp213，A2的残基Asn240和Tyr244，这些残基参与相互作用。虚线表示A1的Gln230和A2的Asn240之间的氢键。(b条)相邻分子的N末端富含脯氨酸的环被插入到假定的单体预序列结合槽中A类Tim50_新结构的疏水相互作用。单体A类Tim50_new结构属于II组，以青色显示。相邻分子的N末端富含脯氨酸的环以绿色显示。标记参与相互作用的N-末端富含脯氨酸环的残基Pro187和Tyr188、B2和B3的残基Trp207和Trp213以及A2的残基Tyr244。

对于Tim50_new的I族成员，通过晶体堆积产生的相邻分子的螺旋A1占据了假定的预序列结合槽（图3一)。相邻分子的螺旋A1位于凸出物之间β-发夹和螺旋A2，并沿着Tim50（164–361）的假定预序列绑定槽的长尺寸延伸。相邻分子的螺旋A1主要对接在假定的预序列结合槽中通过疏水相互作用。来自邻近分子螺旋A1的Tyr223从突起处与Trp207和Trp213进行广泛的疏水相互作用β-发夹。Trp207和Trp213位于β-发夹并沿相反方向摆动以容纳来自相邻分子的Tyr223。此外，来自邻近分子螺旋A1的Tyr227使疏水相互作用来自螺旋A2的Tyr244。来自相邻分子螺旋A1的Gln230与来自螺旋A2的Asn240形成氢键。I组单体的假定预序列结合槽与相邻单体的螺旋A1之间的相互作用代表了这两个单体之间的唯一接触。

据报道，N末端线粒体靶向前序列形成一个两性恋的螺旋与TOM复合体中的Tom20受体相互作用以启动蛋白质移位（Abe等。, 2000)。前序列和Tom20受体之间的结合是通过疏水相互作用介导的。我们认为，来自邻近分子的螺旋A1可能会模拟前序列，与膜间空间内TIM23复合体中的Tim50受体相互作用。与预序列和Tom20之间的结合性质类似，Tim50也与预序列螺旋的疏水侧相互作用。

对于Tim50_new的II族成员，前序列结合囊被相邻单体的N末端富含脯氨酸的环所占据（图3b条)。富含脯氨酸的环形成一个急转弯，主要通过疏水相互作用与假定的预序列结合沟相互作用。富含脯氨酸环的Pro187和Tyr188从突起处与Trp207和Trp213进行疏水性相互作用β-螺旋A2的发夹和Tyr244（图3b条).

我们的数据表明β-发夹和附近的螺旋A2在识别线粒体前蛋白的前序列并与之相互作用中起着重要作用。大的疏水残基Trp207和Trp213都位于突出物的内侧（朝向假定的预序列结合槽）β-发夹，使这一侧β-发夹相当疏水。据报道β-发夹代表Tim50分子表面最大的保守区（Qian等。, 2011)。Tim50的序列比对表明，Trp207和Trp213在不同物种（Qian等。, 2011)。很可能突出物的内侧β-Tim50 IMS结构域的发夹负责通过疏水相互作用识别前序螺旋。凸出物的结构塑性β-发夹和附近的螺旋A2可能有助于Tim50调节不同大小的预序列。

结构和诱变分析表明，Tim50的保守残基Arg214和Lys217可能与Tim23的IMS结构域（Qian等。, 2011)。有趣的是，残留物Arg214和Lys217位于突出物的外侧（背对假定的预序结合槽）β-发夹。因此β-发夹可能在Tim50的功能中发挥关键作用。这个的内侧β-发夹负责识别前序螺旋的疏水表面，而β-发夹参与招募Tim23进行后续蛋白质转运。此外，突出的β-Tim50的发夹具有显著的结构灵活性，有助于其绑定到Tim23的预序列和IMS域。有趣的是，核磁共振波谱分析表明Tim23的IMS结构域本质上也是柔性的（de la Cruz等。, 2010)。Tim23的IMS域在Tim50的前序列结合位点附近与Tim50相互作用，导致假设Tim50和Tim23形成复合前序列结合囊。这也使得预蛋白从Tim50转移到Tim23更加方便。

以前曾报道过使用晶体包装作为正确预测蛋白质-肽相互作用位点的工具（Sha等。, 2000)。在本研究中，由于晶体堆积，Tim50的假定预序列结合槽被螺旋A1和相邻单体的N末端富含脯氨酸环占据。这种结合主要是通过疏水相互作用介导的，并可能在突起处产生构象变化β-发夹和附近的螺旋A2。我们认为来自相邻单体的螺旋A1可能会模拟预序列螺旋，对接到假定的Tim50预序列结合槽中通过疏水相互作用。数据表明，前蛋白受体Tim50在假定的序列前结合沟内，特别是在突起处，具有显著的结构可塑性β-发夹和附近的螺旋A2，以接收预序列。作为比较，在TOM复合物的前蛋白受体Tom70中也观察到结构可塑性（Li等。, 2009, 2010).