2.1、。生物信息学/结构预测

氨基酸序列基序Hx个D类xx个D类xx个Q、 从Cpe0147的酯键结构域衍生而来，提交给爆破服务器和默认值BLASTP公司该算法用于搜索所有生物体中的非冗余蛋白质序列。这项研究确定了许多推测的含酯类结合蛋白，包括来自穆列利斯,柯蒂西M.curtisii和V.剑桥（NCBI参考序列分别为WP_004013458.1、WP_013188882.1和WP_101929469.1）。为了加强这些预测并在这些蛋白质中寻找其他结构域，氨基酸序列被提交给字母折叠2台服务器用于3D结构预测，详见补充表S1–S3（跳线等。, 2021; 瓦拉迪等。, 2022). 预测的结构覆盖在显示含有酯键的蛋白质的晶体结构上（Cpe0147；Kwon等。, 2014; PDB条目4镍6)，异肽键（Spy0128；Kang等。, 2007; PDB条目32亿)和硫酯键（SaTIE；Miller等。, 2018; PDB条目6fx6个). 这使我们能够将假定的域边界映射到莫比伦属和静脉曲张并根据预测的交联类型对结构域进行分类。使用Clustal欧米茄并使用MView（查看）（筛子等。, 2011; 棕色等。, 1998).

2.2. 克隆

穆列利斯（菌株BV 64-5）基因组材料购自ATCC（ATCC 35240D5），利用E14正向（5′-tatttcagggccAAGCCTGGAGTGCTACCTACGTACTACGCTAC-3′）和I30反向（5′-gaattcggatccacaGTAGCTAACGAGTTCTGCGCGCTC-3′）对推测的粘附素序列进行PCR扩增带有5′15-碱基对互补pProEX HTa载体序列的引物用于融合克隆（Clontech）（表1). 选择72°C的高退火温度，以尽量减少由于GC-富集序列导致的错误启动穆列利斯基因组。用pProEX HTa-Fwd（ATGGATCCGAATTCAAAGGCCTAC）和pProEX-HTa-Rev（GGCGCTCTGAAAAACAGTTTC）引物对载体进行类似的PCR-扩增，以产生一个线性产物，该线性产物通过融合重组克隆与粘连蛋白基因片段循环，并转化为电致Competent Stellar大肠杆菌细胞（克隆泰克）。将单个菌落转移到12 ml培养管，含5 ml 2×YT培养基补充至0.1 微克 毫升⁻¹氨苄西林，在37°C下摇晃培养过夜。质粒从1 使用Nucleospin Plasmid EasyPure试剂盒（Macherey-Nagel）的ml细胞体积。

2.3. 蛋白质生产

纯化的质粒用于转化电竞争性大肠杆菌使用标准电穿孔协议的BL21（DE3）细胞。单个菌落在10年内培养过夜 ml 2×YT培养基，37°C，转入2 l装有1个隔板的培养瓶 l 2×YT培养基补充至0.1 微克 毫升⁻¹氨苄青霉素。培养物在37°C下培养，摇晃至OD₆₀₀诱导前为～0.5，0.3 米M（M）异丙基β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷。将培养物转移至18°C并摇晃过夜。细胞在30年内重新悬浮 ml裂解缓冲液（50 米M（M）HEPES–KOH pH值7.5500 米M（M）氯化钠，10 米M（M）咪唑，2%甘油）并转移到50 ml Falcon管，然后在液氮中闪蒸冷却，以便在−20°C下储存。

硒代蛋氨酸（SeMet）替代蛋白以类似的方式产生，但最初在2×YT培养基中过夜培养，离心，再悬浮在1 ml M9最小培养基，接种到2 l装有1个挡板的培养瓶 l M9最低培养基。当OD₆₀₀达到～0.5，粉末状氨基酸（100 赖氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸各mg，50 异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸各mg，60 mg硒代蛋氨酸）添加到培养物中，然后在37°C下再培养15 min，以抑制蛋氨酸生物合成途径。诱导培养物并将其转移至18°C下16 h，如对天然蛋白质所述。

2.4. 净化

细胞颗粒在M-110P微流控器（微流体）中溶解。裂解产物在30℃离心澄清 000克对于20 将上清液涂在5 ml IMAC柱（HiTrap）与裂解缓冲液预平衡。洗涤缓冲液的两列体积（50 米M（M）HEPES–KOH pH值7.5500 米M（M）氯化钠，20 米M（M）然后将咪唑钠、2%甘油）通过色谱柱，然后用含50的缓冲液洗脱 米M（M）HEPES–NaOH pH 7.0，300 米M（M）氯化钠，500 米M（M）咪唑钠，2%甘油。

多组氨酸标签与缓冲液交换同时通过透析与1 我尺寸排除色谱法（SEC）缓冲器（20 米M（M）HEPES–NaOH pH 7.0，100 米M（M）NaCl）补充β-巯基乙醇转化为1 米M（M）重组烟草蚀刻病毒蛋白酶（rTEV），蛋白质质量比为1:75。隔夜透析后，将样品重新涂在IMAC柱上洗脱液收集并浓缩至500 在使用SEC缓冲液进行预平衡的Superdex S200 10/30尺寸排除柱（GE Healthcare Life Sciences）上进行涂敷之前，应先涂敷µl。洗脱的蛋白质浓缩至～250 毫克 毫升⁻¹并在结晶实验之前储存在冰上。

2.5. X射线晶体学

在96 well板（Art-Robbins仪器）上进行了坐滴式蒸汽扩散实验，筛选了576种不同条件（表2). 滴400滴 nl（200 ～250时的nl蛋白 毫克 毫升⁻¹在SEC缓冲区中与200混合 nl水库溶液）使用Oryx4机器人（道格拉斯仪器）进行分配，并与100进行平衡 µl储液罐溶液，温度为18°C。几种条件产生蛋白质晶体，然后使用1 微升+1 24孔Linbro板（Hampton Research）中的µl滴与500相平衡 µl贮存器，包含MORPHEUS筛网配方G2（Gorrec，2009). 优化条件为10%(v（v）/v（v）)聚乙二醇8000，20%(v（v）/v（v）)乙二醇，0.02 M（M） 羧酸（甲酸钠、乙酸铵、柠檬酸三钠、酒石酸钠钾、草酸盐钠）和0.1 M（M）MES–咪唑，pH 6.5。在相同条件下制备了SeMet取代晶体。

晶体直接从结晶液滴安装在尼龙环中，并在液氮中闪蒸冷却。数据收集在澳大利亚同步加速器的MX1和MX2光束线上。使用执行索引和集成扩展数据集使用合并和缩放无AIMLESS（卡布施，2010年; Evans&Murshudov，2013年). 表3给出了两种天然晶体形式的数据收集和处理细节.

表3 数据收集和处理 括号中的值用于外壳。   P（P）1个结构 P（P）21结构 SeMet公司 衍射光源 Beamline MX1，澳大利亚同步加速器 Beamline MX2，澳大利亚同步加速器 Beamline MX1，澳大利亚同步加速器 波长（Ω） 0.95370 0.95370 0.95370 温度（K） 100 100 100 探测器 ADSC Quantum 210r CCD ADSC Quantum 315 CCD ADSC Quantum 210r CCD 晶体到探测器的距离（mm） 80.06 100.06 120 每张图像的旋转范围（°） 1 1 1 总旋转范围（°） 720 360 360 每张图像的曝光时间（s） 1 1 1 “空间”组 P（P）1 P（P）21 P（P）21 一,b条,c（c）(Å) 27.90, 54.98, 57.32 34.55, 51.60, 81.21 34.66, 51.69, 81.21 α,β,γ(°) 67.72, 76.47, 85.35 90.00, 101.60, 90.00 90.00, 101.59, 90.00 镶嵌度（°） 0.28 0.80 0.24 分辨率范围（Ω） 51.73–1.15 (1.17–1.15) 79.50–1.50 (1.53–1.50) 43.3–1.40 (1.42–1.40) 反射总数 807789 (38851) 322292 (14567) 409094 (17529) 独特反射次数 102468 (4921) 43553 (2081) 55013 (2545) 完整性（%） 94.1 (90.6) 97.1 (95.5) 99.2 (94.0) 多重性 7.9 (7.9) 7.4 (7.0) 7.4 (6.9) 〈我/σ(我) 20.2（1.0） 22.3（2.7） 18.6 (2.0) R（右）下午。† 0.026 (0.884) 0.023 (0.447) 0.020 (0.330) 科科斯群岛1/2‡ 1.000 (0.549) 1.000 (0.919) 1.000（0.892） 总体B类Wilson图中的因子（λ2) 10.1 13.9 12.1 半集之间的DelAnom相关性     0.699 (0.071) 异常正态概率中斜率     1.081 †精确诱导R（右）因子（Weiss，2001). 相关系数（Karplus&Diederichs，2012）).

实验相位由单波长获得反常色散（SAD）使用SeMet取代晶体。A波长342 eV高于理论硒吸收边缘(12 658 eV）用于数据收集。获得了自然晶体的衍射数据，确保了强异常信号的足够多重性。处理后的数据已提交给汽车里克肖web服务器和SeMet晶体结构使用自动SAD协议（Panjikar等。, 2005). 本地结构由解决分子置换使用SeMet结构中的单个域作为中的搜索模型相位器（麦考伊等。, 2007). 两者都是P（P）1和P（P）2₁天然结构中包含一个单域、双域分子不对称单元。建模和真实空间的迭代循环精炼在里面库特（埃姆斯利等。, 2010)，连同最大似然 精炼在里面雷夫马克5（穆尔舒多夫等。, 2011)，完成了结构。最后几轮精炼使用完全各向异性建模B类解决方案允许的因素。精炼详细信息见表4.

2.6. 质谱法

用于X射线晶体学的双域蛋白质经过电泳（SDS–PAGE）和条带从凝胶基质中切除，去渍，用胰蛋白酶消化（无还原和烷基化以检测二硫键交联肽），酸化消化液在0.1%甲酸中稀释五倍。答2 微升等分的每个消化液的脱盐量为0.3×10 mm存水弯柱，填充3个 在0.075×200上分离之前，使用µm Reprosil C18培养基（Dr Maisch） mm PicoFrit色谱柱（新目标）内部装有3个 在水中使用0.1%甲酸梯度的µm Reprosil C18介质(一个)和0.1%甲酸在乙腈中(B类)在250 荷兰 最小值⁻¹: 0 最小1%B类, 4 最小2%B类, 22 最小35%B类, 24 最小90%B类, 28 最小90%B类, 28.5 最小1%B类, 45 最小1%B类将PicoFrit喷雾导入TripleTOF 6600四极杆飞行时间质谱仪（美国马萨诸塞州弗雷明翰Sciex）扫描米/z（z）150为350至1600 ms，然后每个周期最多30次ms/ms扫描(米/z（z）100–1600）。手动解释产生的原始数据导致此处描述的蛋白质的三种交联肽的注释MS/MS光谱。

3.1. 生物信息学和结构预测在单蛋白粘附素中识别多达51个重复结构域

一个爆破序列搜索确定了许多假定的分子内含有酯类结合的Ig样结构域，这些结构域包含特征性Hx个D类xx个D类xx个Cpe0147（Kwon）中与反应性（交联）谷氨酰胺相关的Q序列基序等。, 2014). 这项研究预测了来自柯蒂西M.curtisii，包括序列C端半部分中的14个串联域。这个柯蒂西M.curtisii基因组序列（GenBank汇编CP001992.1）表明，该假设蛋白质是细菌蛋白质组中最大的蛋白质，包含5040个氨基酸（表5). 密切相关的细菌种类穆列利斯（GenBank组件GCA_000160615.1）包含一个更大的7645氨基酸蛋白质，类似于其蛋白质组中最大的基因产物（表5). 这两种蛋白质是同源的柯蒂西M.curtisii蛋白质，覆盖62%的穆列利斯序列并与之共享35%的序列同源性(补充图S1). 这两种蛋白质都含有细胞壁锚定LPx个TG基序，将其识别为细胞表面蛋白和推测的粘附素。

这两种蛋白质中的酯键交联结构域是使用针对Cpe0147结构域2的成对氨基酸序列比对，以及聚焦于保守Hx个D类xx个D类xx个Q图案(补充图S2). 后续3D结构预测使用字母折叠2（跳线等。, 2021; 瓦拉迪等。, 2022)证实了两种蛋白中均存在18个酯键交联结构域穆列利斯和柯蒂西M.curtisii蛋白质，主要位于其各自序列的C末端一半（图1).

图1 与细菌性阴道病有关的放线菌家族细菌的假定粘附素的预测结构域。酯键结构域为蓝色，异肽结构域为绿色。N端粘连蛋白（A）和C端LPx个TG室锚定（锚定图）位置如图所示。域从每个相应的粘附素域开始从1开始编号。这个穆列利斯和柯蒂西M.curtisii结构域结构和蛋白质序列匹配，除了大的异肽-结构域插入（在穆列利斯带有粗体红线）。克隆并表达编码重复结构域46和47的双域基因构建物晶体结构测定纯化蛋白的纯度。

要识别的其余部分中的其他域穆列利斯蛋白质，我们使用该蛋白的含异肽C末端结构域的氨基酸序列来搜索额外的Ig样重复序列化脓链球菌菌毛蛋白Spy0128。成对序列比对、内部多序列比对的组合(补充图S3)，人工检测特征序列基序和3D结构预测强调了在穆列利斯蛋白质。这个curtisii先生蛋白质虽然具有更少的假定的异肽结构域（总共13个），但似乎具有类似的酯键和异肽结构区分布（图1)符合共同的进化起源。

进一步分析放线菌，V.剑桥也常与细菌性阴道病相关，显示出一个由20个重复结构域、11个酯类键交联结构域和9个异肽类键交联区域组成的假定粘连蛋白。尝试使用字母折叠失败（图1).

明确确认交联类型的预测组合穆列利斯蛋白质，我们在两个结构域类型之间的界面上表征了一个重组的双结构域蛋白结构体，包括相邻的第15个假定的酯类结合结构域和第32个假定的异肽结构域（该结构体包含图1中的46E–47I结构域).

3.2.质谱法确定了三种不同的分子内交联类型

首先通过质谱指纹图谱对双域结构中的交联化学进行确证，将蛋白质进行胰蛋白酶消化，然后进行LC-MS/MS质谱分析(补充图S4–S6). 质谱中鉴定出的独特片段包含两种预测的交联类型，一种是Thr6674和Gln6827之间的酯键交联，另一种是Lys6842和Asn6955之间的异肽键交联，并进一步鉴定出连接Cys6887和Cys6895的二硫键。

3.3、。X射线晶体学揭示的交叉链

混合酯-异肽结构体46E–47I的晶体结构在两个不同的空间群中求解。SAD获得了实验相汽车里克肖使用SeMet取代晶体的数据（每个蛋白质分子两个硒原子；Panjikar等。, 2005). 原生结构（图2)然后由解决分子置换使用相位器（麦考伊等。, 2007). 两个空间群的分子在287个排列的C中不同^α坐标的平方根差（r.m.s.d.）为1.78 Å. 每对域排列更紧密（C^α残留物1–168，0.72 奥里曼标准差。；C^α残留物169–292，0.50 År.m.s.d.），表明柔性结构域间连接体提供了略微不同的相对结构域取向。结构确定和细化统计见表3和4.

图2 双域结构46E–47I的结构穆列利斯粘附素及其与Cpe0147和Spy0128蛋白的比较。(一)穆列利斯粘附素结构域（蓝色的酯结构域；绿色的异肽结构域）与Cpe0147结构域2重叠（PDB条目4镍6; 黄色）和Spy0128粘附素域2（PDB条目32亿; 黄色）。(b条)的拓扑图穆列利斯粘附素结构域。N端酯结构域呈蓝色，交联显示为连接结构域第一和最后一股的粗体水平线。C-末端异肽结构域呈绿色，交联显示为粗体水平线。这个异肽键连接股1和9，而二硫键连接股2和5。每个结构域拓扑与Cpe0147或Spy0128蛋白质相似，但有四个主要变化，如(一).

N末端46E的酯键结构域与产气荚膜杆菌Cpe0147（千瓦等。, 2014)，r.m.s.d.为1.88 高于108℃^α原子（图2). 可以看到一个明确的分子内酯类键交联在第一个上连接Thr6674β-最后，域褶皱链至Gln6827β-股。46E结构域与Cpe0147的黏附素柄结构域1的区别仅在于存在α-螺旋插入和通过不同方向的金属结环。在46E结构域中，这个环折叠回到蛋白质上，形成一个双标记β-板材，而不是呈现Cpe0147中所示的扩展金属结合结构。

在含有异肽的47I结构域之前有一个短的2–3氨基酸连接子。正如预测的那样异肽键链接第一个和最后一个β-该域的链，将Lys6842连接到Asn6955。该结构域与双结构域的第二个（较小的）异肽结构域之间有明显的同源性化脓链球菌菌毛蛋白Spy0128（图2). 两个结构的叠加提供了2.34的r.m.s.d 高于102℃^α原子。47I域之间的主要差异穆列利斯Spy0128的域2是一个两级删除β-第页，共页β-三明治和一点额外的β-绞线(β-股7）与相反方向相关β-板材（图2). Cys6887和Cys6895之间的二硫键由质谱法47I畴中未完全形成晶体结构，这可能是辐射损伤的结果，因此被建模为部分占据。

3.4. 交联环境证实了类酶交联反应机制

每个交联位点周围的环境如图3所示与范例Cpe0147结构（PDB条目4镍6)，Thr6674和Gln6827之间的分子内酯键虽然位于几乎相同的位置，但在46E中相邻侧链的构象及其相互作用中显示出微小的变化(补充图S7一). 与Cpe0147中一样，一对氢键结合的埋藏酸性残基（46E中的Glu6791和Asp6698）与酯键相连，在酯键上它们可以促进键形成反应。然而，在46E中，它们不与生成的酯部分直接相互作用。这些酸残留物具有较高的预测磷K（K）_一值，表示两者都已质子化，同样类似于Cpe0147。所有其他辅助侧链都适当地放置在提议的丝氨酸蛋白酶样键形成机制（Kwon等。, 2014).

图3 三种不同的分子内交联穆列利斯粘附素结构域。(一)突出显示交叉连接位置的总体结构，包括放大视图。(b条)交联侧链的电子密度(F类o个−F类c（c）忽略3.0的等高线贴图σ). (c（c）)化学绘图显示键几何形状和氢键的图表。第页K（K）显示了Asp6698、Glu6899和Asp6912的值。

在异肽结构域47I的N末端，Cys6895和Cys6887之间的二硫键连接同一个内的两个相邻链β-表。这种保守的二硫键是否对蛋白质的稳定性有显著的贡献尚不清楚，尽管我们注意到在蛋白质的异肽结构域的类似位置发现了二硫键口放线菌FimP和奈斯伦迪氏杆菌菌毛粘附素FimA（PDB条目3个uxf和第三季度分别为；佩尔松等。, 2012; 米什拉等。, 2011). 分子中二硫键的构象穆列利斯该结构具有高能和潜在反应性的−RH Staple构象，可以稳定β-通过连接相邻绞线的薄板结构（施密特等。, 2006).

这个异肽键在穆列利斯47I域位于域的C端，其环境类似于Spy0128域2结构（PDB条目32亿;补充图S7b条). Lys6842周围的疏水环境由三个芳香侧链和许多其他非极性基团组成，将修饰pK（K）_一第个，共个ɛ-氨基，使交联形成如Kang所述等。(2007). 在穆列利斯结构域，两条酸性侧链形成氢键异肽键，这意味着它们的极化效应促进了键的形成。至于酯键位点，预计两个酸性侧链都具有升高的pK（K）_一值，因此大部分被质子化。

3.5. N末端区域中假定的TED结构域加强了粘附作用

最后，我们考虑了这些蛋白质是否真的是粘附素的问题。细胞表面黏附素通常包括支持在重复的“柄”上的N末端黏附域，该柄将黏附器投射到远离细菌表面的位置。在我们对穆列利斯和curtisii先生序列中，第一个可识别的茎结构域之前的N末端区域超过2000个残基长。在寻找该区域可能的结构域时，我们再次尝试使用字母折叠2.这揭示了两种蛋白质中的硫酯交联结构域（TED）。二级结构和域元素在穆列利斯/柯蒂西M.curtisii和SaTIE蛋白（Miller等。, 2018). 具体来说，保守的TQXX年φW图案，其中φ是芳香族的，预测Cys529和Gln712之间的硫酯键可能有助于宿主细胞粘附(补充图S8). 对于V.剑桥蛋白质。