2.1. 转化、表达、纯化和结晶

全长野生型和Val120Thr突变体抄送如Bulut所述，将FDH基因克隆到带有C末端六组氨酸标签的pET-23a（+）细菌表达载体中等。(2021). 质粒被转化为大肠杆菌BL21 Rosetta 2菌株。转化后的细菌细胞在6 l含100的LB培养基 微克 毫升⁻¹氨苄西林和35 微克 毫升⁻¹37°C下的氯霉素。一次OD₆₀₀达到0.7–0.8的范围，通过添加异丙基诱导蛋白质表达β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），最终浓度为0.4 米M（M）用于3-4 37°C时为h。然后使用Beckman Allegra 15R台式离心机在4°C、3500℃下采集细胞 转速 最小值⁻¹对于30 min。细胞颗粒在−80°C下储存，直至纯化。

将冷冻细胞颗粒溶解在含有500 米M（M）氯化钠，50 米M（M）Tris–HCl pH值7.5，5%(v（v）/v（v）)甘油，0.1%(v（v）/v（v）)Triton®声波风廓线仪X-100并使用布兰森W250声波发生器（美国康涅狄格州布鲁克菲尔德）在冰上进行超声波处理，直到溶液完全清除。细胞裂解液在4℃、35℃下离心 000 转速 最小值⁻¹对于1 h使用配备Ti-45转子的Beckman Optima L-80XP超离心机（美国Beckman）。细胞颗粒被丢弃，含有可溶性蛋白的上清液通过0.2 μm膜，并加载到Ni–NTA柱上，该柱之前已与三个柱体积的加载缓冲液（包括200 米M（M）氯化钠，20 米M（M）Tris–HCl pH 7.5，20 米M（M）咪唑。未结合和非特异性结合蛋白质通过五个柱体积的加载缓冲液通过柱进行洗涤。六组氨酸标记抄送用200个洗脱缓冲液洗脱FDH蛋白 米M（M）氯化钠，20 米M（M）Tris–HCl pH值7.5，250 米M（M）咪唑。洗脱的蛋白质在透析膜（3）中进行透析 kDa分子量截止值）对由200组成的缓冲液 米M（M）氯化钠，20 米M（M）Tris–HCl pH值7.5，在4°C下过夜，以去除多余的咪唑。浓缩的纯蛋白在15%SDS-PAGE上进行验证。

蛋白质结晶筛选实验是使用坐滴式微囊油下法进行的。纯化的野生型和Val120Thr突变体抄送在72周的Terasaki平板（Greiner Bio-One，Kremsmünster，奥地利）中，将FDH蛋白与约3500种商用稀疏基质结晶筛选条件以1:1的体积比混合。混合物上覆盖了16.6 µl 100%石蜡油（Tekkim Kimya，伊斯坦布尔，Turkiye）。结晶板在4°C下培养，并经常在光学显微镜下检查。最好的抄送FDH晶体在Wizard III条件47（美国汉普顿研究所）下六周内生长，用于野生型和突变蛋白。这种情况包括30%(w个/v（v）)PEG 5000 MME，100 米M（M）MES–氢氧化钠pH 6.5，200 米M（M）硫酸铵。

2.2. 酶动力学活性测定

对野生型和突变型进行活性分析抄送为了计算不同底物、辅酶和酶浓度下的FDHK（K）_米，V（V）_最大值和k个_猫值。这些值被用来绘制Michaelis–Menten和Lineweaver–Burk图，从而产生一个计算方程。用于测量的反应条件如表1所示.

测量在25°C和340°C下进行 微板阅读器中的nm（Varioscan，ThermoFisher Scientific，美国）。

2.3. 晶体采集和交付

这个抄送使用安装在磁棒上的MiTeGen MicroLoops采集FDH晶体（Garman&Owen，2006）)在光学显微镜下同时监测，如Atalay所述等。(2023). 收获的晶体通过将其放入液氮中进行闪蒸冷却，并放置在一个冷冻机器人样品圆盘中（目录号M-CP-111-021，MiTeGen，USA）。将冰球安装在转移和安装工具上，并将其放入样品杜瓦瓶中，该杜瓦瓶在100℃下自动重新填充液氮 K、 土耳其DeLight光源（居尔等。, 2023).

2.4. 数据收集和处理

衍射数据收集自抄送蒂尔基耶伊斯坦布尔健康科学大学使用Rigaku XtaLAB协同流X射线衍射仪控制的FDH晶体CrysAlis公司^赞成软件（版本1.171.42.35a；Rigaku-Oxford Diffraction）。通过设置为100的Oxford Cryosystems Cryostream 800 Plus不断冷却晶体 K.PhotonJet-R X射线发生器在40 30千伏 mA和1200.0 W，光束强度为10%。数据采集波长为1.54 ？，探测器距离为47.00 mm。扫描宽度设置为0.25°，而曝光时间为10.0 至少收集了15次数据 小时43 最小值19 第条。

按照Gul的描述，在环境温度下进行数据采集等。(2023). 数据缩减使用CrysAlis公司^赞成版本1.171.42.35a。数据还原结果为*.mtz（毫米）文件。

2.5.结构确定和精细化

低温抄送FDH结构确定为1.4 分辨率为空间组 P（P）1使用自动分子置换程序相位器（版本2.8.3；McCoy等。, 2007)在凤凰套件（版本1.20.1；Liebschner等。, 2019). 之前发布的抄送带PDB代码的FDH结构5dna（郭等。, 2016)用作的初始搜索模型分子置换野生型的抄送FDH结构。对于Val120Thr-抄送野生型FDH、Val120抄送FDH结构突变为苏氨酸PyMoL公司用作中的搜索模型分子替换。最初，刚性车身和模拟退火精炼在中执行凤凰然后，根据模拟退火图对各个坐标和平移/平动/螺旋（TLS）参数进行细化精细化。最终的模型抄送FDH结构使用库特版本0.9.8.1（Emsley等。, 2010)每轮之后精细化。水分子被添加到适当的电子密度云中，而那些位于密度之外的则被手动移除。直到R（右）_工作和R（右）_自由的足够低（Brünger，1992). 结构图是使用生成的PyMOL公司（版本2.5.2；薛定谔）和库特（版本0.9.8.1）。

3.1. 野生型apo抄送按1.4确定的FDH结构 低温下的光学分辨率

我们确定了晶体结构野生型apo抄送FDH为1.4 分辨率（PDB条目8小时)土耳其光源（“Turkish DeLight”）在低温下的整体完整性为98.82%，伊斯坦布尔，蒂尔基耶。确定的结构由两个同型二聚体组成抄送FDH（图1). Ramachandran图表明，98.01%的残留物位于有利区域，而1.99%位于允许区域，没有异常值。数据收集和细化统计如表2所示.

图1 1.4版 分辨率apo野生型抄送包含两个同二聚体的FDH结构。四个单体分子以不同的颜色显示。淡绿色和小麦中的单体形成第一个二聚体，而粉红色和淡青色中的单体则形成第二个二聚物。

最终得到的电子密度图质量上乘，揭示了水分子的配位和侧链等结构特征抄送FDH分子的详细信息。电子密度在3σ水平（图2).

图2 第2个F类o个−F类c（c）地图被涂成蓝色并在(一) 2.0σ, (b条) 2.5σ和(c（c）) 3.0σ水平。抄送FDH以斗杆表示法显示。

我们把两者叠加在一起抄送我们体内的FDH同型二聚体晶体结构比较它们的相似之处(补充图S2). 两个同型二聚体的相对标准偏差为0.352 Å. 特别是抄送FDH同型二聚体似乎几乎相同(补充图S2c（c）)，而在远离中心二聚核心结构域的区域观察到一些轻微的构象变化（补充图S2b条和S2d日).

3.2. 野生型apo抄送FDH结构与一些细微差异保持一致

我们的野生型apo抄送FDH结构在相同条件下结晶空间组和单位电池与之前的结构相同（PDB条目5天; 郭等。, 2016). 当我们比较1.4 分辨率apo抄送具有先前发布的apo结构（PDB条目）的FDH结构5dna)在1.75 分辨率整体结构对齐良好，r.m.s.d.为0.266 ？，如预期（图3).

图3 两个apo野生型的叠加抄送FDH结构。我们的1.4 分辨率结构以四种不同的颜色显示，表示每条链：一个，淡绿色；B类小麦；C类，粉红色；D类，淡青色。PDB条目5dna是灰色的。侧链中的构象差异显示在棍子表示的方框中。

差异主要表现在直接接触溶剂的残留物中（图3). 此外，上一个apo抄送FDH结构缺少残基15–18（Ala15、Asp16、Glu17和Glu18），这些残基是链中环的一部分C类，而我们的结构对这些残基有明确的电子密度(补充图S3).

3.3. 野生型apo抄送在2.1中确定的FDH结构 环境温度下的光学分辨率

这个晶体结构野生型apo抄送FDH在土耳其光源（“土耳其DeLight”），伊斯坦布尔，蒂尔基耶，2.1测定 分辨率（PDB条目8个iq7)在环境温度下完整性为85.9%。与低温结构类似，该结构由两个同二聚体组成（图4). 根据Ramachandran统计，97.66%的残基位于有利区域，2.34%位于允许区域，没有异常值。数据收集和细化统计如表2所示.

图4 野生型apo抄送2.1的FDH结构 环境温度下的分辨率。

3.4. 低温和环境载脂蛋白抄送FDH结构略有不同

我们的低温（PDB入口8小时)和环境（PDB入口8个iq7)抄送FDH结构叠加了0.554的r.m.s.d.，表明两种结构之间存在细微差异。这些差异主要存在于柔性区和氨基酸侧链（图5).

图5 低温和环境野生型的叠加抄送FDH结构。

我们还比较了低温和室温结构中确定的水分子数量。与只有393个水分子的环境温度结构相比，低温结构显示出识别出的水分子数量显著增加，分解出2179个水分子。

3.5. 缬氨酸突变为苏氨酸可显著提高抄送频差

进行动力学分析以评估抄送缬氨酸突变为苏氨酸的残基120导致的FDH活性。这个K（K）_米，k个_猫和k个_猫/K（K）_米甲酸盐的计算值如表3所示.下部K（K）_米Val120Thr突变体的甲酸值表明对底物结合的亲和力约为1.5倍，而对底物的亲和力越高k个_猫表明营业额比野生型高（6.57倍）。整体催化效率(k个_猫/K（K）_米)被发现在突变体中大约大10倍抄送FDH公司。

3.6. 这个抄送FDH Val120Thr突变结构揭示活性位点中的新氢键

我们确定了新的Val120Thr突变体的结构抄送FDH为1.9 低温下的Å分辨率（PDB条目第八节). 该结构由两个同二聚体组成，完整性为99.7%。Ramachandran统计数据表明，98.02%的残留物位于有利区域，1.98%位于允许区域，没有异常值。表2显示数据收集和精炼统计数据。

野生型的叠加抄送FDH和Val120Thr突变体(补充图S4一)证明了这种单一突变不会导致整体结构发生显著变化（r.m.s.d.为0.270 Å). 然而，仔细观察突变位点发现了野生型中不存在的新氢键抄送位置120的苏氨酸和三个水分子之间的FDH（图6;补充图。S4系列b条–S4系列（f）).

图6 2F类o个−F类c（c）残渣120的模拟退火省略图抄送FDH，以蓝色显示，轮廓为1.0σ水平（布伦格等。, 1998; 霍德尔等。, 1992). (一)低温野生型Val120抄送FDH结构（PDB入口8小时). (b条)低温Val120Thr突变体的Thr120抄送FDH（PDB入口第八节). 氢键用虚线表示，虚线的距离以Ω为单位。