2.1. 净化谷草Tribolium castaneum六聚体

锥栗木霉蛹（5 g） 20年均质 ml裂解缓冲液（60 米M（M）HEPES pH值7.5100 米M（M）氯化钾，10 米M（M）氯化镁₂, 4 米M（M）DTT，1%NP-40），使用Dounce均质机，使用杵a（20次），然后使用杵B（20次。剩余的聚集体通过使用针状超声波仪（10 s周期，振幅70，Sonicator Q700，QSonica）。匀浆在20℃离心 000克用于10 4°C时最小值。上清液顶部漂浮着一层脂质化合物，而颗粒中含有不溶性的细胞碎片。上清液的透明中间部分被保存下来以备进一步处理。聚乙二醇20 000添加到保存的蛋白质提取物中，最终浓度为8%(w个/v（v）)在冰上孵育20个 min，然后在17℃离心 500克用于10 4°C时最小值。将上清液丢弃，并在14℃离心颗粒 500克对于1 min以去除颗粒中的残留PEG。小球在5分钟内再次悬浮 ml缓冲液（30 米M（M）HEPES pH值7.5150 米M（M）氯化钾，5 米M（M）氯化镁₂, 2 米M（M）DTT），20℃离心 000克用于10 用TurboNuclease（0.2）处理上清液 每1微升 15毫升样品） 室温下在旋转混合器中放置min，然后在20℃下离心 000克用于10 将所得上清液装入Mono Q 5/50柱（GE Healthcare）中。用洗涤缓冲液（30 米M（M）然后用洗脱缓冲液（30 米M（M）HEPES pH值7.5，1 M（M）KCl）。将含有六聚体的馏分混合，并将缓冲液交换成30份组成的缓冲液 米M（M）HEPES pH 7.5100 米M（M）KCl使用PD-10脱盐塔（GE Healthcare）。使用尺寸排除色谱法Superdex 16/600 200 pg列（GE Healthcare）。保存含有六聚体的馏分，并将其浓缩至最终浓度5 毫克 毫升⁻¹使用离心选矿机（100 kDa分子量截止；Amicon）。使用280波长的NanoDrop通过分光光度法估算浓度 纳米。

2.2. 人80S核糖体的纯化

用粘附的HeLa细胞分离人80S核糖体。HeLa细胞在37°C的D-MEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，Sigma–Aldrich）中生长，补充有10%的FBS（胎牛血清，Sigma-Aldrich₂环境。对于核糖体纯化，来自200 使用mm培养皿培养至80%汇合。将细胞从培养皿中刮到培养基中，在8000℃下离心克用于10 min，并转移到新制备的裂解缓冲液中，该缓冲液由25 米M（M）HEPES pH 7.5，15 米M（M）氯化镁₂, 300 米M（M）氯化钠，0.5%(v（v）/v（v）)NP-40。裂解物在冰上孵育30 min，10时离心去除细胞碎片 000克用于15 分钟。为了获得粗核糖体颗粒，将上清液装入30%蔗糖缓冲液中，缓冲液由20 米M（M）HEPES pH值7.6100 米M（M）氯化钾，1 米M（M）DTT，10 米M（M）全日空航空公司₄第5类 米M（M）氯化镁₂并在30℃下隔夜离心 000 转速 最小值⁻¹(105 000克)Beckman 45Ti转子（Beckman Coulter）。将颗粒重新悬浮在由20个颗粒组成的梯度缓冲液中 米M（M）HEPES pH值7.5，6 米M（M）醋酸镁，1 米M（M）DTT，0.01%(w个/v（v）)n个-十二烷基β-D类-麦芽糖苷（DDM），然后装入5–30%(w个/w个)使用梯度主站（BioComp）在梯度缓冲液中制备的线性蔗糖密度梯度。样品离心15 30小时 000 转速 最小值⁻¹(105 000克)在Beckman Optima XPN超级离心机中使用SW32Ti转子。然后使用蠕动泵（Ismatec）将梯度从底部分馏到顶部。这个A类₂₆₀用NanoDrop OneC分光光度计（ThermoFisher Scientific）测量组分的吸光度，并汇总80S核糖体对应的峰值。混合组分中的80S核糖体通过超速离心在50 000 转速 最小值⁻¹(260 000克)使用贝克曼70Ti转子。将最终的核糖体颗粒溶解在由25 米M（M）HEPES pH值7.5125 米M（M）氯化钾，5 米M（M）乙酸镁，1 米M（M）DTT和0.01%(w个/v（v）)DDM公司。核糖体在使用前保存在−80°C。

2.3. ssDNA涂层格栅的制备

ssDNA涂层格栅的制备如下。商业化获得的盐精DNA（Sigma–Aldrich，目录号31149），平均长度为700 bp在无核水中溶解至最终浓度10 毫克 毫升⁻¹，通过加热至98°C 10变性 分钟后立即放在冰上。采用辉光放电（Quorum SC7620，2 s脉冲）。然后用镊子抓住格栅，5 将µl新制备的ssDNA涂敷在格栅的碳侧。30 s、 用滤纸（沃特曼1号）从格栅的另一侧（铜侧）吸干ssDNA溶液。格栅立即用于标准样品玻璃化程序，20 样品应用和吸墨剂之间的等待时间，如下所述。

为了排除辉光放电、栅极类型和操作员偏置的影响，样品制备使用了不同的辉光放电装置（Gatan Solaris II和Quorum SC7620）、栅极（Quantifoil 2/2、2/1和1.2/1.3）和两种不同的Vitrobot Mark IV装置。此外，四名不同的操作员重复了ssDNA网格涂层和玻璃化程序。上述修改均未对结果的再现性产生任何影响。用不含ssDNA的无核水处理一批控制格栅，未观察到抗聚集作用。

2.4. 低温电磁样品制备和3D重建：锥栗木霉六聚体

用于玻璃化锥栗木霉六聚体，3.2 浓度为0.7的µl六聚体 毫克 毫升⁻¹分别应用于辉光放电多孔碳格栅（Quantifoil R2/2，300目，铜；对照样品）或ssDNA涂层格栅。玻璃化冷冻采用FEI玻璃化机器人标记IV（3 s印迹时间，0印迹力，20 s等待时间，4°C时湿度为100%）。这两组数据都是使用ThermoFisher Titan Krios G2电子显微镜收集的，该电子显微镜配备了K2峰值直接电子探测器（Gatan eV.对于在普通多孔碳网格上制备的样品，放大倍数设置为130 000×，导致校准像素大小为1.04 Å; 对于在ssDNA涂层格栅上制备的样品，放大倍数为165 000×，相应的像素大小为0.822 Å. 散焦范围设置为−4.0到−1.2 微米。在总电子曝光量为63和57的情况下获得了显微照片 e（电子）⁻ Å⁻²分别用于标准和ssDNA涂覆的网格。从标准网格和ssDNA涂层网格分别收集了1514和1711张显微照片。

一张显微照片的电影框架内的机械漂移和梁诱导运动用MotionCor公司2个使用5×5补丁（郑等。, 2017). 对运动校正帧进行剂量加权，并使用Gctf公司（张，2016). 根据从普通多孔碳涂层格栅收集的数据集，51 通过人工采摘和crYOLO公司（瓦格纳等。, 2019). 这些颗粒是从盒子大小为256像素的显微照片中提取出来的，并在年进行无参考2D分类RELION公司3.1（Scheres，2012年)，最终选择了27名 429个粒子显示出高分辨率特征。粒子被重新提取，并以256像素的方框大小重新居中。初始三维参考模型由随机梯度衰减算法生成D类3对称RELION公司3.1. 生成的初始3D模型用作3D的初始模型精细化强加的D类3对称使用中的自动细化程序RELION公司3.1. 之后，使用强制的3D分类D类3对称性省略了对齐步骤，并且该类包含最好的10个 选择了362个粒子。进行各向异性放大率校正和三阶和四阶像差估计，然后进行离焦和像散估计精细化在里面RELION公司3.1（齐瓦诺夫等。, 2020). 然后对粒子进行另一轮3D自动重定义D类3对称，然后使用默认参数进行贝叶斯抛光RELION公司3.1（齐瓦诺夫等。, 2019). 像差估计的步骤精细化，贝叶斯抛光和自动重定义反复进行，直到分辨率没有改善。最后，在中执行后处理步骤RELION公司3.1，其中包括阈值掩蔽，B类-通过调制传递函数对因子进行锐化和除法。使用与上述样品基本相同的步骤，对ssDNA涂层网格上收集的数据集进行三维重建。唯一的区别是在随后的步骤中。初始粒子拾取crYOLO公司结果是16 616个颗粒。2D分类步骤选择了8465个粒子。3D分类选择了用于最终3D细化的最终3106个粒子。

2.5. 模型构建和精细化： 锥栗木霉六聚体

低温电子密度图锥栗木霉六聚体被裁剪、归一化和分配空间组 对1RaptorX公司用于生成的模型锥栗木霉六聚体2转录变体X1（NCBI参考序列XM_008199125.2；Xu等。, 2021). 该模型是使用以下工具手动安装到地图中的UCSF奇美拉1.14（彼得森等。, 2004)并于年重建库特0.9.5（埃姆斯利等。, 2010). 在重建的映射中未解析的部分结构被移除，并且根据重建对环路进行重建。该结构在实际空间中使用凤凰1.19（利布施内尔等。, 2019)在往复空间中使用REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011)，同时使用摩尔概率Web服务器版本4.2（Chen等。, 2010). 决赛精细化在实际空间中使用凤凰设置为强制D类三非晶体对称性约束。

2.6. 冷冻电镜样品制备和三维重建：人80S核糖体

用于人80S核糖体的玻璃化冷冻，3.0 浓度为1.2μl的核糖体样品 毫克 毫升⁻¹应用于辉光放电多孔碳格栅（Quantifoil R2/2，300目，铜；对照样品）或ssDNA涂层格栅上。玻璃化采用FEI Vitrobot Mark IV（3 s印迹时间，0印迹力，30 s等待时间，4°C时湿度为100%）。在配备Falcon 3直接电子探测器（ThermoFisher Scientific）的赛默飞世尔Titan Krios G2电子显微镜上收集ssDNA涂层格栅的数据集，该探测器以积分模式运行。放大倍数设置为75 000×，导致校准像素大小为1.063 Å. 散焦范围设置为−2.4到−0.6 微米。在总电子曝光64次的情况下获得了显微照片 e（电子）⁻ Å⁻²共收集了4527张显微照片。3D重建工作流程与T.卡斯塔尼姆六聚体，具有以下修饰。用于提取粒子的方框大小为512像素，133像素 524个粒子由crYOLO公司然后由提取RELION公司3.1. 无参考2D分类后124 保留了986个颗粒。使用3D分类，我们选择了66个 372个粒子用于最终3D自动重定义侧面分离器算法用作中的外部重建脚本RELION公司3.1（拉姆劳尔等。, 2020).

2.7. 模型精细化：人80S核糖体

人类80S核糖体的结构（PDB条目6平方英尺; 纳奇亚尔等。, 2017)被用作起始模型。使用以下方法将该结构拟合到低温电子显微镜图中奇美拉（ChimeraX）1.2.5（佩特森等。, 2021). 实时空间精细化使用执行凤凰1.20，启动模型用作参考约束。模型的目视检查和互相关验证在库特0.9和奇美拉（ChimeraX）1.2.5（埃姆斯利等。, 2010; 彼得森等。, 2021). 使用摩尔概率Web服务器版本4.2（Chen等。, 2010).

2.8. 人80S核糖体断层图像的采集与重建

倾斜系列人类核糖体样品收集在玻璃化网格上，玻璃化网格的条件与用于单粒子数据收集的网格相同。使用配备Falcon 3直接电子探测器（ThermoFisher Scientific）的ThermoFisher Arctica电子显微镜，以积分模式收集标准多孔碳网格玻璃化冷冻核糖体和ssDNA涂层网格玻璃化核糖体的数据集。倾斜度系列使用串行EM（肖伯等。, 2019)，倾斜范围为−56°至+56°，步进增量为2°，使用剂量对称采集方案（Turoňová等。, 2020). 收集倾斜系列，总曝光量为180 e（电子）⁻ Å⁻²散焦度为-6 微米。放大倍数设置为28 000×，像素大小为5.19 Å. 获得的倾斜序列在IMOD公司4.11（克雷默等。1996年)通过后续倾斜之间的互相关。手动进行断层扫描定位。使用加权反向投影算法重建断层图。使用3对断层图像进行可视化数据管理模块（克莱默等。1996年).

2.9. 低温EM样品制备和三维重建：脱铁蛋白

脱铁蛋白样品由位于布尔诺的赛默飞世尔科技公司提供。对于玻璃化，3.1 μl脱铁蛋白，浓度4.0 毫克 毫升⁻¹30年内 米M（M）HEPES pH值7.5150 米M（M）氯化钠，1 米M（M）将DTT缓冲液涂敷在标准或ssDNA涂层多孔碳网格上（Quantifoil R2/2300目，铜）。玻璃化冷冻采用FEI玻璃化机器人标记IV（6 s印迹时间，30 s等待时间，0吸力，4°C下100%湿度）。数据集是使用位于布尔诺的ThermoFisher Scientific工厂中的Thermo Fisher Titan Krios G4电子显微镜从ssDNA涂层多孔碳网格收集的，该电子显微镜配备Falcon 4直接电子探测器（ThermoFisher Scitentific），该探测器以电子计数模式运行，安装在Selectris能量过滤器后面，狭缝设置为10 eV。放大倍数设置为120 000×，导致校准像素大小为0.4525 Å. 散焦范围为-0.3至-1.7 微米。在总电子曝光量为40的情况下获得了显微照片 e（电子）⁻ Å⁻²共收集了3282张显微照片。使用RELION公司4.0-执行MotionCor公司2使用5×5贴片。对运动校正的显微照片进行剂量加权，并使用CTFFIND公司4（Rohou和Grigorieff，2015年). 粒子由自动拾取crYOLO公司然后使用RELION公司4.0贝塔（基马尼乌斯等。, 2021)使用512像素的方框大小。总计206 提取030粒。在初始2D分类之前，将颗粒分成4×箱。经过两轮无参考二维分类，162 选择299个颗粒进行进一步处理。载脂蛋白地图（EMDB条目EMD-24665号; 张等。, 2020)低通滤波至30 在三维自动重定义中，使用了一个初始模型，该模型具有八面体对称性RELION公司4.0倍。随后，在RELION公司4.0-beta，选择156 560个颗粒用于进一步处理。这些粒子被重新提取，盒子大小为512像素。进行了另一轮具有强制八面体对称性的3D自动细化，然后进行了具有强制八面体对称性的3D分类，省略了对齐步骤，得到了最终的65 786个粒子。这些粒子经过放大校正和三阶和四阶Zernike多项式的估计RELION公司4.0贝塔（齐瓦诺夫等。, 2020). 像差校正后的粒子进一步接受逐粒离焦、全显微镜散光和CTF包络函数估计（CTF）B类-系数拟合）。Ewald球体校正三维重建按照宗教_重建在里面RELION公司4.0倍（Russo&Henderson，2018年). 对颗粒进行另一轮具有强制八面体对称性的3D自动细化，然后使用默认参数进行贝叶斯抛光RELION公司4.0贝塔（齐瓦诺夫等。, 2019). 又一轮CTF精细化重复进行放大率各向异性、光学像差、粒子离焦和显微像散估计。CTF公司精细化随后，使用强加的八面体对称性进行3D自动重新定义，并进行另一轮贝叶斯抛光。最后，3D自动重新定义，然后埃瓦尔德球体进行了纠正。后处理步骤，包括阈值掩蔽和B类-因子锐化，在RELION公司4.0倍。

2.10. 模型构建和精细化：脱铁蛋白

去铁蛋白（PDB入口）的结构7千瓦)用作的起始模型结构测定（张）等。, 2020). 使用以下公式将模型拟合到低温电子显微镜图上奇美拉（ChimeraX）1.2.5（彼得森等。, 2021). 实时空间精细化然后在中执行凤凰1.20，起动模型用作参考约束（Liebschner等。, 2019). 模型的目视检查和验证在库特0.9和嵌合体X（埃姆斯利等。, 2010; 彼得森等。, 2021). 使用摩尔概率Web服务器版本4.2（Chen等。, 2010).

2.11. 格栅涂层用聚合物的测试

以下聚合物作为网格涂层进行了测试：平均分子量为50的聚谷氨酸 000–100 000 Da（Sigma–Aldrich），聚（4-苯乙烯磺酸钠），平均分子量200 000 Da（Sigma–Aldrich），平均分子量为35的聚乙二醇 000 Da（Sigma–Aldrich）和poly(L（左）-赖氨酸）氢溴酸盐（Sigma–Aldrich），平均分子量为70 000–150 000 Da.将聚电解质稀释至最终浓度10 毫克 毫升⁻¹在无核水中，用于制备聚合物涂层格栅，协议与ssDNA涂层格栅相同。

3.1. 在应用样品之前，用聚电解质涂覆低温电磁板栅

在使用样品之前，使用以下程序对格栅的聚电解质涂层进行测试。（i） 一个解决方案聚电解质浓度为10 毫克 毫升⁻¹在无核水中加热至98°C 10 最小值（图1). （ii）5 µl聚电解质用移液管将溶液移到等离子体处理过的多孔碳网格上，并培养30分钟 s（图1). （iii）从格栅的另一侧吸出多余的溶液（图1). （iv）使用聚电解质涂层格栅制备标准深冻样品（图1). 测试的聚电解质包括DNA、聚谷氨酸、聚4-苯乙烯磺酸钠（PSS）、聚乙二醇（PEG）和聚(L（左）-赖氨酸）（pLys）。使用透射低温电子显微镜对所得网格进行成像。为了消除栅极间可变性的影响，这在冷冻EM样品的制备中很高，我们使用至少三个独立制备的栅极测试了所有电解质。在样品之前，将带负电荷的聚电解质应用于格栅，消除了聚集，改善了玻璃冰中颗粒的分布（图2，补充图S1).

图1 ssDNA涂层低温电磁栅的制备。（1） 在将dsDNA应用于低温EM多孔碳网格之前，将其加热至98°C 10 min以获得ssDNA。然后立即将ssDNA溶液置于冰上，以防止形成双链DNA。（2） 5个 将µl ssDNA涂敷在多孔网格上。（3）30 s、 ssDNA从格栅的另一侧被吸光。（4）ssDNA涂层格栅可用于常规样品玻璃化程序。

图2 常规多孔碳网格和ssDNA涂层网格上玻璃化样品的比较。六聚体样品(一–（f）)，人80S核糖体(克–我)和脱铁蛋白(j个–我)规则多孔碳格栅上的玻璃化(一，克，j个)和ssDNA涂层多孔碳格栅(b条，小时，k个). 规则网格上的样本(一，克，j个)聚合，而在ssDNA涂层格栅上(b条，小时，k个)是单分散的。显微照片中的白色比例尺代表30 纳米。(c（c），d日)从规则多孔碳网格获得的图像计算六聚体的三维低温电子显微镜重建(c（c）)带有突出显示的细节（红色β-图纸）(d日). (e（电子），（f）)从ssDNA涂层的低温电子显微镜网格获得的六聚体的三维低温电子显微镜重建(我，我)脱铁蛋白的冷冻电镜重建(我)和人类80S核糖体(我)取自ssDNA涂层格栅上玻璃化的样品。

3.2. 测试样品1：来自锥栗木霉

六聚体是57 昆虫幼虫和蛹血淋巴中的kDa蛋白（Burmester，1999). 它与形成均六聚体D类3对称。纯化的锥栗木霉浓度为5的六聚体 毫克 毫升⁻¹在pH 7.5的缓冲液中，含有30 米M（M）HEPES和100 米M（M）实验中使用了氯化钾。当在标准多孔碳格栅上玻璃化时，锥栗木霉六聚体聚合，使大多数粒子图像对单粒子重建无效（图2一，补充图S1一). 六聚体结构的总分辨率为3.1 Å（图2d日，补充图S2一，补充表S1). 综合体的表面部分分辨率很低，这妨碍了其结构的建造（图2c（c）和2d日). 相反，在DNA涂层格栅上玻璃化的同一个六聚体样品没有出现颗粒聚集（图2b条，补充图S1b条). 自动拾取过程，如中所实现的crYOLO公司有效识别了六聚体颗粒（瓦格纳等。, 2019). 最终结构达到3.1的分辨率 奥（图2e（电子）和2（f），补充图S2b条)六聚体的低温电子显微镜图的表面区域质量足以进行模型构建（图2e（电子）和2（f）).

3.3. 测试样品2：人80S核糖体

人类80S核糖体的分子量为4.3 MDa（卡特等。, 2015). 人类80S核糖体的第一个低温电子显微镜结构的分辨率为3.6 2015年Bruno Klaholz的团队（卡特等。, 2015). 浓度为1.2的80S核糖体试样 毫克 毫升⁻¹25中 米M（M）HEPES pH值7.5125 米M（M）氯化钾，5 米M（M）醋酸镁，1 米M（M）DTT，0.01%DDM缓冲液在标准低温电子显微镜网格上显示出几乎完全的粒子聚集（图2克，补充图S1c（c）). 这些网格的电子显微照片不能用于低温电子显微镜重建。通常，人类80S核糖体样品表现良好，许多高分辨率结构证明了这一点。我们实验中使用的样品在纯化过程中被损坏，因此在使用标准低温电子显微镜网格制备样品的过程中出现聚集现象。相反，DNA包被的网格包含分离的颗粒（图2小时，补充图S1d日). 22年的最后重建 000个粒子达到3.8的分辨率 奥（图2我，补充图S2c（c），补充表S1). 网格上的DNA涂层对于结构测定从我们的样品中提取80S核糖体。从DNA包被的网格中解出的结构与先前解出的核糖体结构相同，两个冷冻EM图之间的互相关为0.92。

3.4. 测试样品3：人脱铁蛋白

由于其稳定性和24倍立方对称性，Apoferrin是基准低温电子显微镜方法最受欢迎的样品之一（Wu等。, 2020). 去铁蛋白的重建通常达到2以上的分辨率 Ω，最高分辨率接近1.2 奥（吴）等。, 2020; 纳卡内等。, 2020; 是的等。, 2020; 张等。, 2020). 我们的脱铁蛋白测试样品在标准多孔碳网格上表现出广泛聚集，这阻止了图像用于单粒子重建（图2j个，补充图S1e（电子）). 如下文所述，在我们的实验中观察到的脱铁蛋白聚集可能是由于提纯过程中对样品的损坏造成的。相比之下，ssDNA涂层网格能够记录数据，这些数据可用于重建其结构，分辨率为1.77 奥（图2我，补充图S1（f） 和S2d日，补充表S1).

3.5. 涂覆ssDNA的网格能够进行高分辨率结构测定

在没有大分子样品的情况下，ssDNA涂层网格玻璃化的电子显微照片显示，DNA链从边缘向孔洞中心延伸（图3). DNA链与大分子样品在网格中的表现方式相同；然而，DNA不太明显，可能是因为冰层较厚（图1). DNA链增加了感兴趣的大分子周围的背景。然而，网格上DNA的存在并没有阻止重建达到高分辨率；对于载脂蛋白铁蛋白，这是1.77 奥（图2我，补充图S2d日，补充表S1).

图3 玻璃化后网格孔中ssDNA的分布。(一)无大分子样品的ssDNA涂层网格玻璃化的透射电子显微照片。ssDNA的碳边和缠结链分别用白色和青色箭头表示。(b条，c（c）)插图显示了距离碳边缘不同距离处缠结的ssDNA链的细节。白色比例尺代表100 纳米。

3.6. 防止样品聚集所需的聚电解质的特性

对带有正电荷、中性电荷和负电荷的聚电解质进行测试，以确定网格涂层对大分子行为的抗聚集作用是否与电荷有关。选择聚合物的长度以匹配初始实验中使用的ssDNA片段的长度。我们测试了分子量为50的带负电荷的聚谷氨酸（pGlu） 000–100 000 Da和平均分子量为200的聚（4-苯乙烯磺酸钠）（PSS） 000 Da，中性聚乙二醇（PEG），平均分子量为35 000 Da和正电荷聚合物(L（左）-赖氨酸）（pLys），分子量为70 000–150 000 与未涂覆网格相比，预先涂覆pGlu和PSS的Da.网格提高了样品质量，但程度低于涂覆ssDNA的网格（图4b条–4d日和4小时–4j个). PSS对80S核糖体样品没有抗聚集作用（图4d日). 研究表明，PSS对提高溶液粘度的作用很小（Tian等。, 2015). 相反，向溶液中添加ssDNA和pLys会增加溶液的粘度（Laesecke&Burger，2014）; Yaron&Berger，1963年). 因此，网格表面样品粘度的局部增加可能有助于聚电解质网格涂层。PEG涂层格栅上玻璃化样品的行为与控制格栅上的样品没有区别（图4e（电子）和4k个)以及带有pLys的格栅涂层加剧了样品聚集（图4（f）和4我). 综上所述，结果证明网格涂层化合物的负电荷对测试大分子的抗聚集作用至关重要。六聚体、人80S核糖体和脱铁蛋白是具有主要负表面电荷的可溶性大分子复合物(补充图S3). 因此，用ssDNA涂层格栅有可能提高大多数大分子样品的质量。我们推测，具有总正电荷的大分子或复合物，如组蛋白，可能受益于用带正电荷的聚合物（如pLys）涂覆网格。

图4 不同性质的聚电解质对样品聚集的影响。(一，克)人80S核糖体对照样品(一)和六聚体(克)在规则的多孔碳网格上进行玻璃化。(b条–（f），小时–我)人体80S核糖体样本(b条–（f）)和六聚体(小时–我)在涂有各种聚电解质的格栅上进行玻璃化。(b条–d日，小时–j个)负电荷聚电解质ssDNA(b条，小时)，pGlu(c（c），我)和PSS(d日，j个). (e（电子），k个)PEG作为聚电解质没有总费用(（f），我)pLys被检测为带正电荷聚电解质。显微照片中的白色比例尺代表30 纳米。

3.7. ssDNA涂层可以从次优的大分子样品中制备有用的网格

制备低温电磁板栅的常用方法是在玻璃化之前用滤纸吸走多余的样品（Dubochet等。, 1988). 据推测，由于暴露于流动液体的剪切力或与碳载体、滤纸或空气-水界面的相互作用，在样品吸干过程中，大分子可能会受到损坏（Chen等。, 2019; Glaeser，2018年; Glaeser&Han，2017年; 阿姆斯特朗等。, 2020; 2019年利乌姆基斯; D'Impima公司等。, 2019; 贵族等。, 2018; 郑等。, 2000). 我们实验中使用的六聚体、人80S核糖体和脱铁蛋白样品聚集在标准低温EM网格上，但没有聚集在ssDNA涂层网格上，这证明聚集发生在标准低温-EM网格上的印迹过程中。当用不含ssDNA的无核水处理控制栅时，未观察到抗聚集作用。

直径为13的六聚体自动装箱粒子之间的平均最短距离 nm，在标准和ssDNA涂层网格上记录的电子显微照片分别为16±2和40±13 nm。对于人类80S核糖体，其直径为25 nm，距离分别为29±4和39±9 nm。无法在标准网格上计算脱铁蛋白颗粒之间的距离，因为自动装箱程序由于极端的样本聚集而失败。标准网格上六聚体和80S核糖体的平均最近邻距离接近各自的粒径，表明样品是聚集的。相反，在ssDNA涂层格栅上，颗粒得到了充分分离。

在规则多孔碳网格和ssDNA涂层网格上玻璃化的人80S核糖体的冷冻层析图显示，核糖体在两种网格的空气-水界面上都聚集（图5). 这表明聚电解质涂层并不能阻止大分子到达空气-水界面，这可能对诱导大分子聚集没有重要作用。需要注意的是，制备良好的脱铁蛋白和80S人核糖体样品不会聚集在标准的冷冻-EM网格上（Khatter等。, 2015; 吴等。, 2020)，表明我们实验中使用的大分子复合物在纯化或样品储存不当时受损。因此，网格的ssDNA涂层可以为低温电子显微镜制备有用的样品，甚至可以从经过次优纯化程序的大分子样品中制备。无论玻璃冰的厚度如何，网格的ssDNA涂层都改善了多孔碳孔中的样品分布，表明聚电解质涂层并不是由于冰的厚度增加。我们推测聚电解质格栅涂层源于涂层对格栅表面和大分子进行电荷屏蔽的能力，并限制大分子的扩散，从而通过局部增加粘度和减少大分子与格栅支架和吸墨纸的接触频率来减少剪切力的影响。

图5 人类80S核糖体在规则多孔碳网格和ssDNA涂层网格上玻璃化的Tomograms。人类80S核糖体在规则多孔碳网格上玻璃化的样品(一–c（c）)和ssDNA涂层(d日–（f）)网格。(一，d日)XZ公司上下空气-水界面的断层图中的平面分别由白色和黑色三角形以及相同颜色的虚线表示。(b条，e（电子）)XY公司断层图顶部的平面。(c（c），（f）)XY公司断层图底部的平面。中的黑白三角形和虚线(b条)–(（f）)显示了横截面的位置，如(一)和(d日).