2.2.1. 从每个数据集获取3D重建

在RELION公司，单个数据集的处理包括运动校正、CTF估计、粒子拾取、提取、几个分类步骤和精炼（Scheres，2012年; Fernandez-Leiro和Scheres，2017年). 可以进行更广泛的处理，包括贝叶斯抛光和CTF精炼（齐瓦诺夫等。, 2018, 2019). 然而，在重新缩放数据集之前，通常不需要这些附加步骤（图2). 然而，需要获得单个数据集的高分辨率三维重建，因为地图的分辨率与缩放因子的精度直接相关。在大多数情况下，4-5 分辨率足够了。如果存在较大的灵活区域，则可以通过掩蔽来改进地图的比较。

2.2.2. 计算并优化3D地图之间的比例因子

建议使用实空间相关性来比较独立计算的地图的体积。例如，可以使用以下方法确定实际空间中的互相关奇梅拉（佩特森等。2004年)，其中可以使用“Fit in Map”命令实现地图的叠加和拟合[图3(一)]. 此工具提供相关系数在指示拟合质量的贴图之间。Volume Viewer工具可用于使用实际空间插值调整目标地图的像素大小[数据集II，地图2，图3(一)]通过在“功能”、“坐标”中输入调整后的体素大小。

图3 数据集之间的缩放因子。(一)由于标称像素大小的差异，从数据集I（黄色）和数据集II（青色）获得的独立3D地图的体积大小不同。此类映射在中的叠加奇梅拉显示了当缩放map 2（青色）的像素大小以适应map 1（黄色）的像素尺寸时，重建之间的相关性提高。(b条)映射1和映射2之间的傅立叶壳层相关性（FSC），在缩放之前和之后。相关性增加到1.28 每像素奥。

此外，我们还提供了一个Python脚本(https://www.python.org)调用确定相对像素大小.py（补充脚本1）使用释放图像处理程序（Scheres，2012年)和傅里叶壳相关性（FSC；Harauz和van Heel，1986)以确定目标地图的最佳像素大小。输出是FSC保持不变的像素大小范围。此脚本使用文件地图1.mrc和地图2.mrc以及它们相应的像素大小作为输入，将map 2重新缩放为一组像素大小，并通过FSC测量两个感兴趣的3D体之间的互相关。可以通过在命令行中键入以下文本来运行脚本：

应注意，要在RELION公司成功地，要比较的地图的原点需要相同。原因是，重缩放后，重缩放地图的原点将发生偏移。可以使用奇梅拉`“适应地图”选项与vop重采样命令。首先，重新采样的地图需要如上所述进行叠加，以使其坐标与要与之进行比较的地图的坐标相匹配。其次，通过使用vop重采样命令，可以保存具有新坐标的新地图(网格#1上的vop重采样#0，其中#0是地图2_重新缩放.mrc而#1是地图1.mrc)并用于FSC计算。

2.3.1. 方法1

在本例中，使用与上述相同的CPF数据集，需要大规模数据采集（4227部电影）来克服首选方向（补充图S1）。由于显微镜时间有限，我们选择使用独立显微镜收集数据。初始数据处理RELION公司2.0（Fernandez-Leiro&Scheres，2017年)生成了分辨率约为4.00的3D地图 每个显微镜上的。发布的结构（EMDB-3908）是通过结合333获得的 550个颗粒和126个 分别来自数据集I和数据集II的617个粒子。在合并和进一步处理数据后，我们以3.50的速度获得了最终的3D重建 总共77°的分辨率 917个颗粒（占总颗粒的17%），贡献40个 数据集I中的518个粒子（3.73 ？）和37 数据集II中的399个粒子（3.61 （图4）和补充图S1）。

图4 使用方法1合并来自酵母的CPF聚合酶模块的数据集。(一)连接数据前后显示了CPF聚合酶模块的重建。合并数据集后，最终3D结构（EMDB-3908）的全局和局部分辨率提高。来自数据集I和II的贴图表示每个数据集对最终结构的粒子贡献。使用确定局部分辨率RELION公司用于仅从数据集I和II重建粒子的3D重建（以最终/缩放像素大小，即1.40 每像素的奥数），并使用1.28的相对像素大小缩放数据集II后合并数据集 每像素奥。根据黄金标准给出决议(b条)金标准细化的傅里叶壳相关图。(c（c）)数据集I和II以及组合数据集的密度示例。与单个数据集相比，最终的3D结构显示主链和侧链中更精细的细节，如绿色箭头所示。

（i）重新缩放显微照片。原始显微照片可以使用重新缩放释放图像处理程序为此，可以使用先前确定的相对像素大小（1.28 以将数据集II的显微照片重新缩放为最终所需的像素大小（1.40 ？每像素）。在命令行中键入：

（ii）重新运行CTF估算。需要使用新的真实像素大小（1.40）重新计算缩放显微照片的CTF参数 ？每像素）。标称像素尺寸的不准确会影响散焦和对比度传递函数（CTF）估计值（朱等。, 1997). 由于CTF会在图像中引起分辨率相关的振幅调制和相位反转，因此准确估计CTF参数对于确定3D结构至关重要，尤其是在相移变得更为相关的高分辨率下（Mindell&Grigorieff，2003; 程等。, 2015). 在新重新缩放的数据集上运行CTF估计在计算上是廉价的，并且它将保证CTF的准确性。在这一步之后，可以将数据集视为以相同的放大率和像素大小记录在同一显微镜上。可以像以前一样执行粒子拾取、提取、2D分类和进一步的数据处理。无需计算新的盒子大小，可以使用中的“Join STAR files”作业合并数据集RELION公司（图2; Fernandez-Leiro&Scheres，2017年).

（iii）通过重新缩放先前拾取的粒子的坐标来节省时间。通过重新缩放初始处理中已拾取或提取的粒子的坐标，可以节省处理或手动拾取时间。由于显微照片的缩放，坐标将发生变化。此外，放大倍数和显微照片的路径需要在STAR文件中更新。我们提供了第二个Python脚本，名为重新缩放文章.py（补充脚本2）从颗粒.星形/data.star（数据星）文件并根据像素大小进行更正。它使用的列是_rln显微镜名称,_rln坐标X,_rln坐标,_rln原始X,_rln原始Y,_rln认证和_rln检测器像素大小。脚本的输入是用于RELION公司运行，计算出相对像素大小和目标/重缩放像素大小。它还允许更改STAR文件中显微照片的名称(例如重新缩放的MRC文件所在的新路径）。输出文件已准备好导入到RELION公司（“Import”），且易于使用。

2.3.2. 方法2

方法2与方法1的不同之处在于，在从显微照片中提取时，不缩放显微照片，而是缩放颗粒（图1和2). 利用外显子连接反应后立即捕获的酵母催化后剪接体的结构证明了这种方法（威尔金森等。, 2017). 发布的结构（EMDB-3979）是从48个数据集中获得的 1.120收集617个颗粒 每像素的奥数为3.73 奥分辨率。随后，第二个数据集42 在0.900时收集了566个颗粒 每像素奥，精确到3.89 分辨率（补充图S1和S2）。这两个数据集都是在MRC-LMB的Krios 1上收集的。原始数据集（较大的像素大小）被称为“数据集I”，在本例中使用了未抛光的粒子，精确到4.02 分辨率（图5). 数据集II的相对像素大小使用奇梅拉，如上所述，它与数据集I的互相关峰值为0.880 每像素奥（图6).

图5 使用方法2合并酵母后催化（P复合物）剪接体的数据集。(一)合并数据集后，最终3D结构的全局和局部分辨率提高。使用确定局部分辨率RELION公司用于仅从数据集I和II（最终/缩放像素大小）以及使用0.880的相对像素大小缩放数据集II后组合数据集进行粒子的三维重建 每像素奥。根据黄金标准给出决议(b条)数据集I和II以及组合数据集的密度示例。

图6 缩放效果。(一)根据数据集I和数据集II计算的3D重建之间的相关性（1.120 ？每像素），使用数据集II的各种像素大小。使用以下公式计算相关性奇梅拉如文中所述。(b条)金标准FSC用于仅数据集I（浅灰色）、仅数据集II（黑色）和通过组合文本中描述的数据（红色）进行剪接体重建。其他曲线来自使用所示像素大小到1.120的错误缩放数据集II Å，然后与数据集I合并，进行细化和后处理。这些曲线的颜色与(一). 根据黄金标准给出决议。

（i）重新计算CTF离焦值在本例中，数据集II最初使用0.900像素大小进行处理（包括CTF估计） 每像素的奥数，这是数据采集放大时报告的标称像素大小。确定相对像素大小（0.880 考虑到新的像素大小，需要重新估计CTF参数。或者，由于拟合的离焦值取决于像素大小的平方，因此可以将这些值乘以（0.880/0.900）²:

（ii）重新提取和缩放颗粒.英寸RELION公司缩放粒子的一种方便方法是在“粒子提取”作业类型期间。在此作业中，可以选择以特定的方框大小提取并将此方框缩放为另一个方框大小。（如果磁盘上不再有显微照片或希望缩放抛光颗粒，也可以使用重新处理). 一个限制是，框大小必须是偶数。在给定的示例中，数据集II从0.880重新缩放 Å/像素至1.120 每像素的奥数，最终方框大小为420像素（数据集I的方框大小）。要直接缩放到420像素的方框，必须提取方框大小为420×1.120/0.880=534.5像素的图像，这是不可能的。一种可能性是用一个534像素的方框进行提取，并将其缩放到420像素，使缩放后的像素大小为534/420×0.880=1.119，这可能足够准确（见下文）。或者，我们提供一个Python脚本箱标尺.py（补充脚本4），它可以找到一对非常接近所需比率的偶数框大小。其运行方式如下（粗体表示用户输入）：

（iii）将粒子裁剪为正确的长方体大小。粒子现在处于正确的比例，但框大小为440（数据集II），需要与框大小为420的粒子合并（数据集I）。您可以使用重新处理如下所示：

在这个例子中，结合数据集得到了3.70的重建结果 ？分辨率，与单独重建的任一数据集相比，局部分辨率和密度质量显著提高（图5). 使用CTF进行进一步处理后精炼和贝叶斯抛光RELION公司3.0（齐瓦诺夫等。, 2018)，我们能够将分辨率提高到3.30 ？，与公布的重建相比有了显著改进（补充图S2）。

注：要将此方法与贝叶斯抛光集成，请对数据集II进行抛光，在“附加参数”下提供以下附加标志：--窗口560——刻度440

因此，将以正确的尺寸生产抛光颗粒，但盒子尺寸为440。这些可以按如下方式裁剪：