X-ray structure of the direct electron transfer-type FAD glucose dehydrogenase catalytic subunit complexed with a hitchhiker protein

Yoshida, H.; Kojima, K.; Shiota, M.; Yoshimatsu, K.; Yamazaki, T.; Ferri, S.; Tsugawa, W.; Kamitori, S.; Sode, K.

doi:10.1107/S2059798319010878

研究论文

结构
生物学

编号：2059-7983

第75卷| 第9部分| 2019年9月| 第841-851页

https://doi.org/10.107/S2059798319010878

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与搭车蛋白复合的直接电子转移型FAD葡萄糖脱氢酶催化亚基的X射线结构

^一川川大学生命科学研究中心和医学院，1750-1 Ikenobe，Miki-cho，Kita-gun，Kagawa 761-0793，日本，^b条日本东京农业科技大学工程研究生院生物技术与生命科学系，地址：日本东京184-8588，Koganei Naka-cho 2-24-16，^c（c）密苏里州立大学化学系，美国密苏里州斯普林菲尔德65897，^天功能材料研究中心，国家材料科学研究所（NIMS），1-2-1 Sengen，Tsukuba，Ibaraki 305-0047，Japan，^{e（电子）}静冈大学应用化学与生物化学工程系，地址：日本静冈市滨松中町町3-5-1号，邮编：432-8561^（f）美国北卡罗来纳大学教堂山分校和北卡罗莱纳州立大学生物医药工程联合系，北卡罗来那州教堂山，邮编：27599
^*通信电子邮件：ksode@email.unc.edu

美国弗吉尼亚大学Z.S.Derewenda编辑(2019年5月1日收到； 2019年8月2日接受； 2019年8月28日在线)

细菌黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖脱氢酶复合物洋葱伯克霍尔德菌（BcGDH）是一种具有代表性的直接电子转移型FAD依赖脱氢酶复合物分子。在本研究中，BcGDH的X射线结构γα，催化亚单位(α-BcGDH亚单位）与搭便车蛋白复合(γ-亚基），进行测定。这种酶最显著的特征是存在3Fe–4S簇，它位于催化亚基的表面，在分子内和分子间发挥作用电子转移从FAD到电子转移亚单位。配合物的结构表明，这两个分子通过二硫键和疏水相互作用连接，并且需要形成二硫键来稳定催化亚单位。复合物的结构揭示了电子转移亚基的假定位置。BcGDH结构的比较γα和膜结合富马酸还原酶表明，整个BcGDH复合物，也包括膜结合的β-含有三个血红素的亚基c（c）部分，可以形成与富马酸还原酶类似的整体结构，从而实现有效的电子转移。

关键词：直接电子转移;黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性脱氢酶复合物;葡萄糖脱氢酶;铁硫簇;搭便车蛋白;葡萄糖传感器;洋葱伯克霍尔德菌.

PDB参考：γα-亚基复合物洋葱伯克霍尔德菌FAD葡萄糖脱氢酶，6a2u

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1.简介

各种糖氧化还原酶据报道，脱氢酶天生就能够直接电子转移碳材料制成的电极或金电极。这些脱氢酶含有一个电子转移域或亚基，以及一个催化域或亚单位。负责催化糖氧化的催化域或亚基按其辅因子分类：黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）或吡咯喹啉醌（PQQ）。电子转移域或亚单位，负责将电子转移到外部电子受体，也按血红素的类型（血红素b条或c（c）)存在于电子转移域或亚基中。

直接电子转移型（DET型）脱氢酶的代表组之一由纤维二糖脱氢酶（CDH）组成，CDH由催化域含有FAD和血红素b条-类型电子转移畴。在CDH中，通过细胞色素结构域的方法识别了开放和闭合状态催化域通过柔性连接器（Tan等。, 2015 ).

另一个具有代表性的蛋白质组能够直接电子转移由FAD依赖的脱氢酶复合物组成。这些复合物由一个催化亚单位和一个含有三个血红素的电子转移亚单位FAD组成c（c）部分和一个小亚单位。报道了几种细菌FAD依赖性脱氢酶复合物的分离、表征、生物电化学研究和应用，包括细菌葡萄糖脱氢酶（FADGDH；Inose等。, 2003 ; 外等。1996年 ; 津谷等。, 2006 ; 山崎面包等。, 1999 ; Yamaoka&Sode，2007年 ; 山冈等。, 2008 )果糖脱氢酶（FDH；Ameyama等。, 1981 ; 卡瓦伊等。, 2013 ;), 2-酮-D类-葡萄糖酸脱氢酶（KGDH；Kataoka等。, 2015 ; 科川等。, 1981 )山梨醇脱氢酶（富山等。, 2005 )。由于血红素的存在，这些依赖FAD的脱氢酶复合物有可能将电子直接转移到电极上c（c）亚单位。然而，目前还没有DET型FAD依赖性脱氢酶复合物中任何亚单位的结构信息。

我们的研究小组一直在研究一种由洋葱伯克霍尔德菌SM4（BcGDH）。BcGDH由三个不同的亚单位组成：催化亚单位(α-亚单位），在其氧化还原中心包含一个FAD辅因子，显示催化活性氧化葡萄糖的第一个羟基，即小亚基(γ-亚单位），细菌TAT分泌系统的一种搭便车蛋白，对正确折叠和分泌α-亚单位（山冈等。, 2004 )和带有三个血红素的膜结合亚单位c（c）部分(β-亚单位），负责活性位辅因子和外部电子受体之间的电子转移。由于β-亚单位BcGDH能够将电子直接转移到电极上，使其成为葡萄糖传感器的理想分子，并应用于各种生物医学设备（Sode等。，2016年 ; 山下等。, 2018 )。此外，BcGDHγα复杂，BcGDH缺乏β-亚单位，也表现出染料介导的葡萄糖脱氢酶活性（肌醇等。, 2003)。最近，根据生化分析和电子顺磁共振在光谱学中，我们报道了催化亚基中存在3Fe–4S簇（Shiota等。，2016年 )。3Fe–4S簇位于富含半胱氨酸的区域，该区域保存在先前报道的FAD依赖性脱氢酶复合物的催化亚基中。3Fe–4S集群负责电子转移从FAD（分子内）到多血红素c（c）亚单位（分子间），是理解这类能够直接电子转移的酶的特征的关键位置。

FAD-依赖性脱氢酶复合体中酶的另一个显著特征是存在一个小亚单位，它对FAD催化亚单位的功能表达至关重要。考虑到它们的一级结构，特别是分泌所需的信号序列，这些小亚基被预测为搭车蛋白，是将催化亚基分泌到周质空间（山冈等。, 2004)。然而，没有任何类型的搭车蛋白或其与靶蛋白的复合物的结构信息。

在本研究中，我们测定了BcGDH的X射线结构γα由BcGDH催化亚基和小（搭便车者）亚基复合而成。FAD结合催化亚单位的结构类似于几种葡萄糖-甲醇-胆碱（GMC）的结构氧化还原酶。BcGDH的催化位点γα与其他GMC相比是保守的氧化还原酶。在BcGDH结构中γα3Fe–4S簇位于催化亚基的表面。催化亚基与小亚基复合物的结构表明，这两个分子通过二硫键和疏水相互作用连接。进行定点突变研究以阐明二硫键的作用。还讨论了与其他FAD依赖性脱氢酶复合物和富马酸还原酶的结构相似性。

2.材料和方法

2.1. BcGDH的重组表达γα

编码催化物的结构基因(α)和小型(γ)GDH亚单位洋葱伯克氏菌将sp.SM4（FERMBP-7306）亚克隆到高表达载体pTrc99A中，并在其C末端带有His标记α-亚单位。构建的质粒（命名为pTrcγα-His）转化为细菌宿主大肠杆菌BL21（DE3）进行表达。在本研究中γ-亚单位和His标记α亚单位表达为重组野生型BcGDHγα. Theγ-亚单位由168个氨基酸组成（18 kDa），包括N末端信号肽的47个氨基酸γ-亚基含有121个氨基酸（13 kDa）。这个α亚基由539个氨基酸组成，是作为催化域第页，共60页千帕。

转化大肠杆菌500年培养 ml容量为100的锥形烧瓶 ml ZYP-5052培养基（Studier，2005 )在293的旋转振动器中 K代表48 小时。

这个大肠杆菌利用硒营养缺陷菌B834（DE3）生产含硒代蛋氨酸的BcGDHγα. The大肠杆菌携带pTrc的B834（DE3）细胞γα-他在500年被培养 ml容量为100的锥形烧瓶 ml PASM-5052培养基（Studier，2005)在293的旋转振动器中 K代表211 小时。

通过离心法收集细胞，然后在20分钟内重新悬浮米M（M）含有20的磷酸钠缓冲液米M（M）咪唑和0.5 M（M）氯化钠pH值7.0。再次悬浮后，细胞被法式压榨机打碎。裂解物在10 000克用于15 277时的最小值 K来去除由细胞碎片和包涵体组成的不溶性部分。产生的上清液被指定为粗提取物，通过FPLC进行纯化。

2.2. 酶纯化

重组BcGDHγα复合物用镍-羧酸盐纯化色谱法和阳离子交换色谱法。将粗提取物装入HisTrap HP柱（1 毫升；GE Healthcare Life Sciences，Uppsala，Sweden）已与20 米M（M）含有20的磷酸钠缓冲液米M（M）咪唑和0.5 M（M）NaCl pH 7.0，用相同的缓冲液清洗。然后用十个柱体积的逐步咪唑梯度洗脱GDH（70、380和500 米M（M）咪唑在20 米M（M）磷酸钠缓冲液和0.5 M（M）NaCl pH 7.0），速率为1 毫升最小值⁻¹对于每个步骤。将活性最高的组分汇集在一起，并在10个组分中透析过夜米M（M）磷酸钾缓冲液pH 6.0。

随后将汇集的部分加载到资源S列（5 毫升；GE Healthcare，Little Chalfont，England）已与10 米M（M）磷酸钾缓冲液pH 6.0，用相同的缓冲液清洗。用20个柱体积的线性NaCl梯度（0-1）洗脱GDH M（M）10中的NaCl 米M（M）磷酸钾缓冲液（pH 6.0），速率为5 毫升最小值⁻¹.纯化酶浓缩至8.9 毫克毫升⁻¹并使用Amicon Ultra-15（标称分子量限值3000；爱尔兰卡里格特沃希尔的默克Millipore）将缓冲液交换为Milli-Q水。使用DC蛋白质检测试剂盒（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯生物实验室）测量蛋白质浓度。

2.3. 定点突变

靶氨基酸的定点突变（Cys213α-亚单位和Cys152γ-亚单位）是根据制造商的说明使用QuikChange诱变试剂盒（美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦）完成的。所有突变均经核苷酸测序证实。

2.4. 酶分析

粗提物和纯化的重组BcGDH的活性γα使用先前研究中描述的方法测定复合物（Inose等。, 2003)稍作修改。酶样品在室温下与10 米M（M）磷酸钾缓冲液，pH 7.0，含6 米M（M）5-甲基硫酸苯那嗪（甲基硫酸吩嗪；PMS），0.06 米M（M）2,6-二氯苯酚靛酚（DCIP）和各种浓度的葡萄糖。通过监测600℃时DCIP吸光度的下降来确定活性 nm和使用摩尔吸收系数DCIP（16.3 米M（M） 厘米⁻¹pH7.0）计算酶活性。这个摩尔吸收系数通过在600℃下测量固定浓度DCIP的吸光度来测定DCIP的 10纳米米M（M）磷酸钾缓冲液pH 7.0。一个单位酶活性被定义为氧化1的酶的数量微摩尔葡萄糖/分钟。

2.5. 结晶

初始晶体筛选是使用坐滴蒸汽扩散法和蚊子系统（英国赫特福德郡TTP Labtech）进行的。野生型BcGDH的蛋白质浓度γα为8.9 毫克毫升⁻¹在Milli-Q水中。几天后，在pH值为7.0的60%Tacsimate溶液中观察到黄色晶体。在含有1.5混合物的液滴中获得了衍射良好的晶体 µl蛋白质溶液（5.7 毫克毫升⁻¹在Milli-Q水中）和0.75 在含有50µl的井中的储层溶液（59.9–60.2%Tacsimate pH 7.0） 293处采用坐滴法的µl储层溶液英国。

BcGDH中的蛋氨酸γα被硒代蛋氨酸（SeMet-BcGDHγα)为了确定野生型BcGDH结构因子的初始阶段γα然而，SeMet-BcGDH晶体γα未在与野生型BcGDH相同的条件下获得γα.自准备SeMet BcGDH以来γα包含少量未经处理的γ-亚单位（18 在SDS-PAGE凝胶上观察到，SeMet-BcGDH的结晶γα在以下人员在场的情况下尝试蛋白酶使用Proti Ace（美国加利福尼亚州汉普顿研究所）。SeMet-BcGDH的一些晶体γα出现在由1.0组成的液滴中 µl蛋白质溶液（10.2 毫克毫升⁻¹在Milli-Q水中），0.2 0.1微升毫克毫升⁻¹枯草杆菌素溶液和1.0 在含有50μl的井中的储层溶液（60%Tacsimate pH 7.0） 293处采用坐滴法的µl储层溶液英国。

2.6. X射线晶体学

两种野生型BcGDH单晶γα和SeMet BcGDHγα安装在低温回路中，并在100℃的氮气流中直接闪蒸冷却在日本筑波高能加速器研究组织（KEK）的PF-AR NE3A光束线上，使用ADSC Quantum 270 CCD探测器系统收集X射线衍射数据。衍射数据使用香港（HKL）-2000（Otwinowski&Minor，1997）)和中央对手方清算所4套房（优胜者等。, 2011 )。虽然X射线衍射数据来自BcGDH晶体γα至2.2 分辨率，实际用于结构测定被截断为2.6 由于高分辨率R（右）_合并在最外层。晶体的单位-细胞参数很大(一=b条= 110.5,c（c）= 524.9 并且衍射图样具有强烈的各向异性。

SeMet BcGDH的初始阶段γα使用单波长获得反常色散（SAD）方法自动解决方案项目（Terwilliger，2004 )。由于野生型BcGDH晶体的单位胞参数γα与SeMet衍生物同构，相直接转移到前者，并使用自动编译在中菲尼克斯系统（亚当斯等。, 2010 ; 阿富汗等。, 2012 ).

进一步的模型构建和结构精细化使用执行库特（埃姆斯利等。, 2010 )和REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011 )分别是。使用验证了结构检查（拉斯科夫斯基等。1993年 , 2001 ).

这个反常色散为了确定铁-硫原子簇中铁原子的数量和位置，利用了铁原子的。野生型BcGDH晶体的SAD数据集γα收集到1.74086 使用ADSC Quantum 210r CCD探测器系统，在KEK的光束线PF-AR NW12A上获得光学分辨率。

数据收集和细化统计表1列出了所有数据集图1、2、3、4、6和补充图S2、S5、S6、S7和S9是使用PyMOL公司（美国纽约，薛定谔）。

表1
数据收集和精细化统计学

括号中的值表示最高分辨率箱。

	BcGDH公司γα	BcGDH公司γα	赛美特BcGDHγα
数据收集
光束线	PF-AR NE3A型	PF NW12A型	PF-AR NE3A型
温度（K）	100	100	100
波长（Ω）	1	1.74086	0.97892
分辨率范围（Ω）	50.0–2.60 (2.64–2.60)	50.0–2.90（2.95–2.90）	50.0–3.40 (3.46–3.40)
测量反射次数	1273970	369135	929441
独特反射次数	60005	43770	49132
多重性	21.2 (21.4)	4.9 (6.8)	18.9 (19.0)
完整性（%）	99.9 (100.0)	96.7 (99.9)	100.0 (100.0)
平均值我/σ(我)	24.4 (10.0)	20.2 (5.6)	43.1 (12.6)
R（右）_合并†(%)	15.0 (42.8)	13.5 (46.9)	16.2 (48.5)
“空间”组	对6₅22	对6₅22	对6₅22
一，b条，c（c）(Å)	110.52, 110.52, 524.88	110.72, 110.72, 525.42	110.48, 110.48, 524.09
α，β，γ(°)	90, 90, 120	90, 90, 120	90, 90, 120
精炼
分辨率范围（Ω）	43.74–2.60 (2.67–2.60)
反射次数	56812 (4078)
完整性（%）	99.9 (99.2)
R（右）系数（%）	20.5 (27.3)
R（右）_自由的(%)	26.1 (37.6)
R.m.s.d.，粘结长度（Ω）	0.003
R.m.s.d.，粘结角（°）	0.6
拉马钱德兰阴谋
最受青睐地区（%）	84.6
附加允许区域（%）	15
B类因子（λ²)
蛋白质	45.6
辅因子FAD	31.6[两个分子]
3Fe–4S型	33.0[两个分子]
水	29.9
PDB代码	6a2个

†R（右）_合并= $[\textstyle\sum_{hkl}\sum_}|i_{i}（hkl）-\langle i（hk1）\rangle|/]$ $[\textstyle\sum_{hkl}\sum_{i} 我_{i} （香港）]$ ，其中我_我(香港特别行政区)是我th测量和〈我(香港特别行政区)〉是加权平均数的所有测量值我(香港特别行政区).

3.结果

3.1. BcGDH的总体结构γα

图1和补充图S1显示建筑群的整体结构γ-和α-BcGDH的亚单位和蛋白质的拓扑结构。这个γ-亚单位由五个组成α-螺旋（红色）。的总体结构α-亚单位包括15α-螺旋线（蓝色）和17β-股，采用FAD装订折叠。附加域包含一个六股反平行线β-被六个包围的床单α-螺旋和一个包括两个α-螺旋线(α11和α12）面向γ-亚单位。两个不同的长回路区域位于β2和β3之间β4和α8.前一个循环（Ala39–Leu83）包含一个唯一的α-螺旋线(α2）位于靠近γ-亚单位位于γα-亚单位复合物和铁硫簇上方，如红色圆圈所示[图1(一)]，这将在后面描述。后一环（Glu197–Asn229）围绕铁硫簇并包含半胱氨酸簇（Cys212、Cys213、Cys2018和Cys222）；四种半胱氨酸中的三种参与了3Fe–4S簇的形成。

图1
BcGDH的总体结构γα(一)BcGDH的总体结构γα显示为卡通（左）和曲面（右）模型。在卡通模型中γ-亚单位显示为红色α-螺旋线和绿圈区域，以及α-亚单位用蓝色表示α-螺旋，黄色β-股线和灰环区域。在曲面模型中γ-和α-亚基分别以红色和蓝色显示，并且彼此紧密结合。绑定的FAD表示为橙色棒模型。用红色圆圈表示的半胱氨酸簇包括以球体表示的铁-硫簇。(b条)模型视图围绕x个轴。

FAD周围的结构α-亚单位如图2所示.FAD被Ala98和Ser109之间的部分长回路包围，α1,α15,β2和β6.由于在FAD和His105之间观察到连续电子密度α-BcGDH亚单位γα[图2(b条)]，一个共价键被视为在FAD和His105之间α-BcGDH亚单位。

图2
FAD结合位点和FAD共价结合到His105α-亚单位。(一)FAD与周围环境的结合点。一个长长的循环α-亚单位包括α2为青色。FAD显示为橙色棒模型。其他颜色如图1所示

(b条)野生型GDH中FAD和His105的模拟退火OMIT图γα轮廓为4σ以浅蓝色显示。FAD显示为橙色棒状模型。

在晶体中，两对BcGDHγα在非对称单元(补充图S2)。如图1所示的表面模型(一)和1(b条)，BcGDH公司γα形成具有弯曲形式的异二聚体，以及弯曲络合物(γα-亚单位）面向晶体中其他复合体的背面(补充图S2)。虽然蛋白质似乎形成了异四聚体，γαγ′α'，根据国际学生成绩评估分析(https://www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa/)该组件不稳定，形成两对γ-和α-亚单位(γα和γ′α′). 凝胶过滤色谱图发现缺乏BcGDH的低聚物形式γα溶液中（未显示数据）。因此，观察到的γαγ′α异源四聚体晶体结构是结晶的产物。因为每个分子γα和γ′α′几乎相同，C的r.m.s.偏差^α0.48个原子(α和α′）和0.89(γ和γ'），结构描述集中于γα除非另有规定。

3.2. 铁-硫簇

使用反常色散方法在铁-硫簇合物的预期位置观察到和。在每个分子的铁-硫簇中确定了三个铁原子位点[图3(一)–3(天)]。模拟的铁硫簇合物和二硫键中硫离子的退火OMIT图表明，该铁硫簇是一个由Cys212、Cys218和Cys222配位的3Fe–4S簇合物α-亚单位。相邻的半胱氨酸Cys213α-亚基与Cys152形成二硫键γ-亚单位。BcGDH独特的半胱氨酸簇γα有助于形成3Fe–4S集群电子转移和用于稳定结构的二硫键γα复杂。

图3
BcGDH的半胱氨酸簇γα独特的半胱氨酸簇由来自γ-亚单位和来自α-亚单位。Cys152和Cys213在γ-和α-亚单位。Cys212、Cys218和Cys222参与铁-硫簇（3Fe–4S）。3Fe–4S簇的确定位置以及γ-和α-亚单位如图所示。野生型BcGDH中F3S（3Fe–4S铁–硫簇）和五个半胱氨酸残基（Cys152、Cys212、Cys213、Cys218和Cys222）的模拟退火OMIT图γα在5时绘制轮廓σ以浅蓝色显示(一)–(天)。第2个F类_o个−F类_c（c）使用野生型BcGDH的合并数据集绘制电子密度图γα以1.0和1.74086的波长收集？（在首字母之后精细化以及在细化中包括F3S之前）显示为蓝色，轮廓为5σ英寸(b条)(c（c）)和(天)。S和Fe原子分别显示为黄色和橙色。确定的3Fe–4S团簇由三个Fe原子和四个S原子组成，以球体表示。

3.3. 之间的接口γ-和α-亚单位

这个γ-亚单位紧密结合α-亚单位并形成稳定的异二聚体。C末端的疏水环区域γ-亚单位（图4中黑色圆圈中的绿色)接触一个明显的长回路，包括α中的2个α-界面处的亚单位（呈青色）。二硫键位于γ-和α-亚单位（Cys152γ-中的subtunt和Cys213α-亚单位），如图4中的红色圆圈所示，与C末端区域在γ-由黑圈指示的亚基（Leu146、Val147、Ile148、Pro153、Pro156、Gly157、Phe158、Trp159、Ala160和Pro163）以及α-亚单位（Leu172、Pro173、Leu174、Phe176、Leu 333、Trp334、Pro335、Gly336、Gly388、Pro339和Met342）。3Fe–4S簇位于二硫键旁边，铁-硫簇位于上述疏水簇形成的疏水环境中α-亚单位，包括参与形成3Fe–4S簇和二硫键的四个半胱氨酸残基（Cys212、Cys213、Cys2018和Cys222），以及位于3Fe-4S和FAD异丙嗪环之间的两个丙氨酸残基。此外，α4和α第5页γ-亚单位与突出的螺旋接触，包括α11和α12个螺旋α-亚单位（蓝色圆圈所示区域）。这些疏水性接触有助于形成紧密结合的亚单位界面。

图4
紧密绑定的接口γ-和α-亚单位。高度疏水的C端尾部γ-亚单位（绿色），包括γ-亚单位覆盖接触区域，就像界面上的盖子。亚基之间的二硫键用红色圆圈表示。的一个长循环α-亚单位包括α2为青色，与γ-亚单位。其他颜色如图2所示

.α4和α第5页γ-亚单位也与突出的螺旋接触(α11和α12）的α-用蓝色圆圈表示的区域中的亚单位。

3.4. 定点突变

这个晶体结构BcGDH的γα复合物揭示了Cys213侧链之间存在亚单位间二硫键α-亚单位和Cys152γ-亚单位。如前所述（Shiota等。，2016年)，Cys213在α-丝氨酸亚基[γα（Cys213Ser）]对BcGDH动力学参数的影响有限γα在室温下合成。因此，亚单位间二硫键对酶活性。突变型BcGDHγαCys152Ser突变的复合物γ-亚单位[γ（塞浦路斯152Ser）α]构建和表征以进一步证实这一假设。表2显示了突变型BcGDH的动力学参数γα在室温下合成。在没有电子转移亚单位的情况下(β-亚单位），BcGDHγα在常规使用的初级电子受体（PMS；Yamazaki）浓度下，复合物显示出相对较低的染料介导葡萄糖脱氢酶活性等。, 1999)。因此酶活性BcGDH的γα使用6测定复合物米M（M）PMS，浓度是含有电子转移亚单位的BcGDH复合物所用条件的十倍(补充图S4)。这个V（V）_最大值的γ（塞浦路斯152Ser）α复杂度仅略低于野生型γα复杂。这个K（K）_米的γ（塞浦路斯152Ser）α复合物可与K（K）_米野生型的γα复杂。虽然这些半胱氨酸残基的取代并没有实质性影响BcGDH的动力学参数γα二硫键在室温下的络合物通常有助于第三和/或第四纪构造蛋白质。因此，我们研究了酶活性半胱氨酸取代突变体在较高温度下。野生型BcGDHγα复合物在343处表现出最大活性 K，因为它的热稳定性高，而γ（塞浦路斯152Ser）α和γα（Cys213Ser）复合物在约303–313处表现出最大活性 K（图5)。A substantial decrease in the optimal reaction temperatures of theγ（塞浦路斯152Ser）α和γα（Cys213Ser）配合物表明亚单位间二硫键在维持野生型BcGDH的热稳定性中起着重要作用γα复杂。

表2
室温下测定BcGDHγα突变体的动力学参数

计算值的测量图如所示补充图S3.

样品	K（K）_米（米M（M）)	V（V）_最大值（U 毫克⁻¹)
野生型	0.97±0.052	120 ± 1.5
γα（c213秒）	0.76 ± 0.036	76 ± 0.78
γ（第152页）α	0.99 ± 0.067	110 ± 1.8

图5
温度对野生型和突变型BcGDH酶活性的影响γα.染料介导的野生型葡萄糖脱氢酶活性（方形开口），γ（塞浦路斯152Ser）α（开放三角形）和γα显示了每个温度下的（Cys213Ser）（开放钻石）BcGDH。

4.讨论

A类DALI公司搜索（Holm&Rosenström，2010 ; Holm&Laakso，2016年 )发现了许多结构类似于α-BcGDH亚单位γα，高Z轴-得分在23.4–33.0之间(补充表S1)。这些酶被归类为含有FAD的葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶（GMC）家族的成员。

在GMC家族中已鉴定的酶中，吡喃糖2-氧化酶（P2Ox）与BcGDH的相似性最高α-亚单位[补充图S5(b条)和第5章(天)]. 胆固醇氧化酶（ChOx）的结构也类似于BcGDH的结构α-亚单位[补充图S5(c（c）)和第5章(e（电子）)].

负责催化反应的残留物之前已在多种GMC氧化还原酶中确定。基于晶体结构、定点突变、，pH依赖性研究或理论计算。BcGDH中的催化对可能是His/Asn，以His476和Asn519表示，对应于纤维二糖脱氢酶中的His689和Asn732。

BcGDH活性位点的结构γα与进行了比较黄孢原毛平革菌与6-羟基-FAD和抑制剂纤维双内酰胺（ABL；Hallberg）结合的纤维二糖脱氢酶（PcCDH）等。, 2003 ;补充图S6)。His/Asn催化对（BcGDH中的His476/Asn519γαPcCDH中的His689/Asn732）和识别非还原端葡萄糖部分位置的残基是保守的。PcCDH的Asn688与ABL的O3形成氢键，PcCDH中Ser687的羰基O原子与ABL的O2接触γα分别为Asn475和Asn474，能够识别葡萄糖作为底物。在PcCDH中，Glu279和Arg586识别纤维二糖[Glc(β1–4）Glc]。PcCDH中对应Arg586的残基是BcGDH中的Ser365γα，但在BcGDH中未发现与PcCDH中Glu279相对应的残基γα虽然是BcGDH最有利的底物γα是葡萄糖，BcGDH的假定活性部位有一个大空腔γα，如在BcGDH的表面模型中观察到的γα叠加在PcCDH的活性部位[补充图S6(天)]支持BcGDHγα识别麦芽糖(α1–4）Glc]作为底物（山下等。, 2013 ).

相反，结构与γ-亚单位未在DALI公司搜索。迄今为止γ-亚单位被认为是一种搭车蛋白，可以促进催化亚单位向周质的分泌。在细菌双精氨酸转位（TAT）途径中，折叠蛋白通过识别N末端信号跨细菌细胞质膜运输肽类包含双精氨酸基序。在一些典型的双精氨酸信号中肽， α-使用磅/平方英寸二级结构预测方法（帕尔默等。, 2005 )。这个γ-BcGDH亚单位包含N端信号肽中的双精氨酸基序，被认为属于Tat蛋白家族。事实上γ-BcGDH亚单位包含五个α-螺旋线。

这个DALI公司搜索发现一些同源性有限的蛋白质(补充表S2和图S7)，包括的N端域（NTD）鼠伤寒沙门菌趋化性受体甲基转移酶（CheR）与S公司-腺苷-L（左）-同型半胱氨酸（SAH）含量最高Z轴-得分（4.7）。据报道，这些酶的结构域对于催化活性，尽管它们距离催化域并且没有关于其作为搭便车蛋白的作用的报道。

BcGDH的X射线结构γα还揭示了搭车者蛋白与目标蛋白复合物的第一个结构。根据定点突变研究的结果，需要形成二硫键来稳定催化亚基。换句话说，二硫键可以阻止变性3Fe–4S簇，因此即使在高于323的温度下也能保持这种酶的稳定性因此，在催化亚基分泌到周质空间后，搭便车蛋白可能会保护铁硫簇，直到与电子转移亚基形成复合物。电子转移亚单位在周质空间折叠并形成第四纪构造催化亚基与搭车者蛋白复合。然而，酶复合体中的一个突变催化亚基或一个突变搭车蛋白被表达并发挥作用。这些结果支持在复合物的功能表达和分泌到周质空间中不需要二硫键。事实上，催化亚单位一级结构的排列[补充图S8(一)]和搭便车的蛋白质[补充图S8(b条)]FAD依赖的脱氢酶复合物显示半胱氨酸残基不保守，这表明催化亚基和搭车蛋白之间形成复合物不需要形成二硫键。因此，FAD依赖性脱氢酶复合物的搭便车蛋白可能在这些界面相互作用中主要与催化亚单位相互作用并识别催化亚单位。

我们之前的报告显示，BcGDH（Shiota）存在3Fe–4S集群等。，2016年)。催化亚基的X射线结构清楚地表明了位于催化亚基表面的3Fe–4S簇的位置。FAD的N5与3Fe–4S集群之间的距离约为12–13 ？，这是一个足够的距离电子转移。这些结果支持了我们的假设，即3Fe–4S簇在分子内起作用电子转移来自FAD并介导分子间电子转移从3Fe–4S簇到电子转移亚单位。3Fe–4S集群负责电子转移并与多血红素相互作用c（c）电子转移亚单位。

如电子密度图所示共价键可能在FAD的C8M和His105之间形成α-BcGDH亚单位[图2(b条)]。His105的位置在GMC氧化教育酶家族中是保守的，例如在P2Ox中（Bannwarth等。, 2004 ; 哈拉达等。, 2003 ; 哈尔伯格等。, 2004 ; 哈桑等。, 2013 ; 西班牙等。, 2010 ; 棕褐色等。, 2013 )、COxs（码头等。, 2008 )和富马酸还原酶B（艾弗森等。, 1999 , 2003 ; 兰卡斯特等。, 2001 ; 马德伊等。, 2006 )该残基与FAD形成共价键。

接下来，我们试图通过比较CDH和富马酸还原酶的结构来预测电子转移亚单位的位置，考虑到先前阐明的分子内和分子间电子转移途径（Shiota等。，2016年; 山下等。, 2018)以及电子转移亚单位（Okuda-Shimazaki）的性质等。, 2018 ).

在补充图S9，的结构催化域CDH（闭合状态）叠加在α-BcGDH亚单位γα[补充图S9(天)]. 3Fe–4S集群γ-和α-BcGDH（红色虚线圈）的亚单位位于左侧，与血红素相反b条-CDH的电子转移畴类型（品红棒）。考虑到主要电子受体FAD是3Fe–4S簇合物，下一步是分子间的电子转移发生在3Fe–4S簇和电子转移亚基之间，BcGDH的电子转移亚单位的位置与血红素的位置相反b条-闭合状态下CDH的类型电子转移畴。

可溶性黄细胞色素c（c）富马酸还原酶腐烂沙瓦氏菌是周质四丝黄细胞色素c（c）由N-末端四血红素细胞色素组成c（c）结构域和包含三个C-末端结构域的催化区域。包含四素部分的N末端结构域通过α-FAD绑定的螺旋连接器催化域具有非共价结合的FAD。膜结合二氢喹啉：富马酸还原酶（QFR）琥珀酸Wolinella succiogenes由三个亚单位（A、B和C）组成，其中亚单位A包含富马酸还原的催化位点和与His43共价结合的FAD。亚单位B包含三个铁硫簇，亚单位C是一种二血红素细胞色素b条（兰卡斯特等。, 2001; 马德伊等。, 2006).

关注可溶性黄细胞色素之间的同源性c（c）富马酸还原酶腐败链球菌和膜结合富马酸还原酶琥珀酸生成拟南芥以及可溶性黄细胞色素之间的同源性c（c）富马酸还原酶腐败链球菌和α-BcGDH亚单位，膜结合富马酸还原酶的结构琥珀酸生成拟南芥叠加在α-BcGDH亚单位γα（图6)。如膜结合富马酸还原酶所示，电子从FAD转移到含有血红素的跨膜蛋白b条P和血红素b条D通过2Fe–2S、4Fe–S和3Fe–4S集群。有趣的是，富马酸还原酶的FAD和第一个Fe–S簇2Fe–2S的位置，距离为12.3 与FAD和BcGDH的3Fe–4S集群相比γα，距离约为12–13 Å. Fe–S团簇之间的距离为11.0 Å（2Fe–2S和4Fe–4S）和9.1 （4Fe-4S和3Fe-4S），而Fe-S簇到血红素结构域的距离为17.6 Å（3Fe–4S和细胞色素b条P）和15.6 细胞色素b条P和细胞色素b条D） ●●●●。虽然膜结合富马酸还原酶含有三个铁硫簇和两个血红素结构域β-BcGDH亚单位包含三种血红素c（c）其电子转移亚基中的部分。完整的BcGDH复合物包括膜结合β-含有三个血红素的亚基c（c）部分可形成与富马酸还原酶类似的整体结构，以有效电子转移。有趣的是，我们之前对β-亚单位表明，来自Fe–S簇的电子最初被转移到β-亚单位（β-然后转移到第二个血红素，再转移到第一个血红素酶（血红素的N末端结构域β-亚单位），并最终转移到外部人工电子受体。然而，当完整的BcGDH固定在电极上时，电子从第三血红素转移到第二血红素，然后直接转移到电极。BcGDH的第三个血红素γαβ可能对应于富马酸还原酶的4Fe–4S和3Fe–4之间的位置，第二个血红素对应于血红素b条P和第一个血红素对应血红素b条D。

图6
的结构(一)BcGDH公司γα, (b条)琥珀酸生成拟南芥膜结合富马酸还原酶（PDB入口2bs2个; 马德伊等。, 2006

)黄蛋白在(b条)叠加在BcGDH结构上γα英寸(c（c）)。BcGDH的颜色γα与图2相同

。3Fe–4S集群用红色虚线圆圈表示。可溶性腐败链球菌富马酸还原酶首先叠加在α-BcGDH亚单位γα具有3.0 r.m.s.d.，和来自琥珀酸生成拟南芥叠加在可溶性富马酸还原酶的结构上腐败链球菌（具有1.8 r.m.s.d.）。因此，直接将膜结合富马酸还原酶的结构与BcGDH的结构进行比较γα通过去除可溶性富马酸还原酶的结构。(b条)富马酸还原酶的两分子形式如晶体结构（兰卡斯特等。, 1999

)。富马酸还原酶分子以浅粉红色表示（右）。在另一个分子中，A亚基（含FAD的黄素蛋白共价结合到His43）、B亚基（铁硫蛋白包括2Fe–2S、4Fe–4S和3Fe–4簇）和C亚基（跨膜蛋白包括二血红素细胞色素）b条分子）分别为浅绿色、浅橙色和深绿色。结构中结合的FAD分子显示为橙色棒状模型。结合的FAD和血红素b条分子分别显示为橙色线条和品红棒模型。铁-硫团簇显示为球体模型。富马酸还原酶的另一个分子在(c（c）)阐明FAD、铁硫簇和血红素的位置b条分子，与电子转移。 b条P是近端血红素b条D是远端血红素。

总之，本研究报告了一种具有代表性的DET型FAD依赖性脱氢酶复合物的第一个X射线结构：BcGDH催化亚基与搭车蛋白复合。BcGDH的结构γα揭示了一个保守的GMC氧化还原酶型支架和一个His/Asn催化对，具有独特的3Fe–4S簇结构，作为电子受体同时作为FAD的电子施主对于电子转移多血红素c（c）亚单位。这些发现对于提高我们对分子内和分子间的理解至关重要电子转移通过DET型FAD依赖性脱氢酶复合物，以及为开发未来生物电化学设备而设计DET型酶。

5.相关文献

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支持信息

3D视图

PDB参考：γα-亚基复合物洋葱伯克霍尔德菌FAD葡萄糖脱氢酶，6a2u

补充图表。内政部：https://doi.org/10.107/S2059798319010878/dw5200sup1.pdf

致谢

作者感谢东京农业科技大学工程研究生院生物技术与生命科学系的Kentaro Hiraka先生提供的技术援助。作者还感谢美国国立卫生研究院国立癌症研究所癌症研究中心大分子晶体学实验室高级研究员亚历山大·瓦洛达尔博士在英文审稿中所做的努力。本研究是在获得光子工厂项目咨询委员会的批准后进行的（提案编号：2015G534和2017G610）。

资金筹措信息

本研究部分得到了JSPS KAKENHI向KS提供的JP16H04175拨款的支持。

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