2.1、。的序列分析α-DsbA2型

使用ProtParam公司蛋白质组服务器（Bairoch等。, 2005)来自ExPASy（瑞士生物信息学研究所，瑞士）。的序列α-DsbA2、EcDsbC、PmScsC、CcScsC和LpDsbA2在ClustalOmega公司（筛子等。2011年)并使用JPred（红色）（德罗兹德茨基等。, 2015). UniProt加入代码如下：EcDsbC，P0AEG6；PmScsC，B4EV21；CcScsC，Q9A747；α-DsbA2、Q73FL6；LpDsbA2、Q5WVK9。催化结构域的基于结构的序列比对α-DsbA2、PmScsC和EcDsbC用促销3D类（裴等。2008年; 使用的PDB坐标为6欧元,4xvw（四驱车）和1个）。

2.2. 蛋白质表达和纯化

佛罗里达州α-DsbA2（基因座WD1312；GenBank AE017196）从W.皮皮因蒂斯 w个使用前向引物5′-TAC TTC CAA TCC AAT GCG ATG AGC TTG CCG ATA ATA ATA-3′和反向引物5’-TTA TCC ACT TCC AAT-GCT GCT GCT-TGT GAC TTA A-3′，通过PCR扩增梅尔基因组DNA，其中包含用于连接非依赖性克隆（LIC）的悬挑。截断（Truncated）α-DsbA2型Δ用正向引物5′-TAC TTC CAA TCC AAT GCG GCT CGA GAT AAT GTA ACC-3′和反向引物5’-TTA TCC ACT TCC AAT-GCT AGC CTT GCT TGT GAC TTA A-3′扩增N。不含信号肽和α-DsbA2型ΔN被克隆到含有His的LIC载体pMCSG7中₆tag是一个包含八个氨基酸的连接子区域，在插入基因的N末端有一个TEV蛋白酶裂解位点。该构造被转换为大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）pLysS（美国生命科技公司），以使α-DsbA2在30°C的ZYP-5052培养基中使用自感应（Studier，2005). 使用Avanti J-25I离心机（澳大利亚Beckman Coulter）于12时收集细胞 000克在4°C下保持10 min，并在−80°C下冷冻。α-DsbA2变体的表达和纯化如Kurz所述等。(2009)裂解缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液的变化很小。裂解缓冲液由25个 米M（M）Tris–HCl pH值7.5，150 米M（M）氯化钠；25 米M（M）添加咪唑作为洗涤缓冲液，并添加250 米M（M）蛋白质洗脱包括咪唑。

2.3. 蛋白质二硫还原酶测定

外语能力α-DsbA2和α-DsbA2型Δ测定DTT存在时促进胰岛素减少的N在体外（霍姆格伦，1979年). 胰岛素由两条链A和B组成，通过两个二硫键连接。通过高还原酶活性催化剂还原二硫键后，链B变得不溶并沉淀。佛罗里达州α-DsbA2、，α-DsbA2型ΔN、 将EcDsbC（阳性对照）或EcDsbA（阴性对照）稀释至最终浓度10 µM（M）在由100组成的缓冲区中 米M（M）磷酸钠pH 7.0，1 米M（M）乙二胺四乙酸（EDTA），0.33 米M（M）数字电视。胰岛素（最终浓度为0.13 米M（M）)在进行测量之前，立即将其添加到试管中，并通过测量光学密度650 50 nm 最小值：使用同一批蛋白质测量三个实验重复，数据显示数据[平均值±标准偏差（SD）]来自所有三个测量值。

2.4. 氧化还原电位测量

2 µM（M）氧化FLα-DsbA2和α-DsbA2型ΔN在100个完全脱气的缓冲液中培养 米M（M）磷酸钠pH 7.0，1 米M（M）乙二胺四乙酸二乙酯，1 米M（M）氧化谷胱甘肽（GSSG；Sigma–Aldrich，美国）和不同浓度的还原谷胱甘苷（GSH；20 µM（M）–5 米M（M）)24小时 室温下h。孵育后，用10%三氯乙酸（TCA；Sigma–Aldrich，USA）停止反应，并在16 000克用于10 4°C时最小值。用冷丙酮清洗颗粒，并将其溶解在由50 米M（M）Tris–HCl pH 7.0，1%十二烷基硫酸钠，4 米M（M）4-乙酰胺-4′-马来酰二苯乙烯-2,2′-二磺酸（AMS；Molecular Probes，美国）。还原态和氧化态在12%SDS Bis–Tris PAGE上分离（Invitrogen，澳大利亚）。还原蛋白质的分数，R（右），由染色凝胶的扫描图像确定，使用图像J（阿布拉莫夫等。, 2004). 这个平衡常数 K（K）_等式通过计算得出R（右）={[GSH]²/[GSSH]）/(K（K）_等式+（[GSH]²/[GSSH]）}，以及氧化还原电位通过能斯特方程计算E类⁰=E类⁰_{谷胱甘肽/GSSG}− (RT公司/纳法)在K（K）_等式，其中E类⁰_{GSH/GSSG公司}= −240 毫伏，R（右）= 8.314 J型 K（K）⁻¹ 摩尔⁻¹,T型= 298 K、，n个=2和F类= 9.649 × 10⁴ C 摩尔⁻¹（库尔茨等。, 2009). 使用不同批次的蛋白质测量了三个实验重复，给出的数据是重复测量的平均值±SD。

2.5. 二硫醇氧化酶活性测定

在Synergy H1多模平板阅读器（BioTek，USA）上进行分析，激发频率为340 nm和615时的发射 纳米。对于时间分辨荧光，100 读取前的µs延迟和200 采用µs读取时间。在白色384孔板（PerkinElmer）中进行分析。A 25个 µl溶液，由3.2组成 µM（M）EcDsbA和2 米M（M）GSSG（阳性对照）或3个 µM（M）佛罗里达州α-DsbA2或α-DsbA2型ΔN和2 米M（M）50年GSSG 米M（M）人工编码站，50 米M（M）氯化钠，2 米M（M）向微孔中添加pH 5.5的EDTA。通过添加25 16微升 µM（M）肽（50 米M（M）人工编码站，50 米M（M）氯化钠，2 米M（M）EDTA pH 5.5）。肽底物为CQQGFDGTNSCK，铕与1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸（DOTA）基酰胺结合到N末端，甲基香豆素酰胺与∊-C-末端赖氨酸的氨基（AnaSpec，美国）。肽底物溶液的重组在Walden中描述等。(2012). 使用三个不同的蛋白质批次进行了三次测量，所示数据为这三次测量的平均±SD误差。

2.6. 蛋白质二硫异构酶测定

用干扰RNase A检测FL的异构酶活性α-DsbA2、，α-DsbA2型ΔN和EcDsbC通过监测干扰RNase A（Hillson）的重折叠等。, 1984). 当四个随机氧化的二硫化物正确配对时，RNase天然折叠并具有活性，可以将环胞苷-3,5′-单磷酸（cCMP）转化为3′CMP，可以用比色法监测。在这些实验中，FLα-DsbA2、，α-DsbA2型ΔN或EcDsbC（10 µM（M）最终浓度）用于含有100 米M（M）磷酸钠，1 米M（M）EDTA pH 7.0，10 µM（M）二硫苏糖醇（DTT）和40 µM（M）扰民核糖核酸酶A。扰民核糖核酸酶A如前所述产生（Kurz等。, 2009). 在不同的时间点，50 将反应的µl与150混合 µl胞苷3′，5′-环磷酸（3 米M（M）)296，使用Biotek H1平板读取器（美国千年科学公司）监测水解活性 nm和298 K.未添加酶的天然核糖核酸酶A和搅乱核糖核糖核酶A样品分别作为阳性和阴性对照。使用三个不同批次的蛋白质进行一式三份的测量，所提供的数据是三次测量的平均值±标准差。

2.7. 结晶和晶体结构确定α-DsbA2型ΔN个

晶体筛选和优化α-DsbA2型ΔN晶体在UQ ROCX设施（澳大利亚昆士兰大学）进行。结晶采用悬挂滴气相扩散法。晶体α-DsbA2型ΔN通过混合1生长 20µl蛋白质溶液 毫克 毫升⁻¹和1 µl结晶溶液，含100 米M（M）Tris pH值7.5200 米M（M）氯化钠，20%(w个/v（v）)PEG 3350。使用蓝冰软件（McPhillips等。, 2002). 在中处理了反射XDS公司（卡布施，2010年)，分析并转换为MTZ标量（埃文斯，2006年). 通过以下方法获得相位分子置换使用由折叠和功能分配(金融流量账户; 雅罗斯基等。2011年). 顶部FFAS公司击中，肠炎沙门氏菌伤寒血清型ScsC（SeScsC；PDB条目4gx赫兹; 牧羊人等。, 2013)，与共享23%序列身份α-DsbA2型ΔN.使用SeScsC的完整PDB坐标作为模型进行初始搜索失败。取而代之的是，一个修剪过的聚醚模板，它保留了在SeScsC与α-DsbA2型ΔN用于确定α-DsbA2型ΔN使用相位器（麦考伊等。, 2007). 这两种结构之间的均方根偏差为1.8 124当量C的^α原子。进一步精炼使用执行菲尼克斯（亚当斯等。, 20102011年)和库特。分子图生成于PyMOL公司（v.1.2r3pre；薛定谔）。R.m.s.d.计算和结构定线使用PyMOL公司以及DaliLite公司（霍尔姆等。2008年). 数据收集和细化统计如表1所示.改进的模型α-DsbA2型ΔN在非对称单元，带链条A类,B类,C和D类分别用185、189、180和180个残渣进行精炼。分子A类和B类两者在电子密度上都有很好的定义，但在分子中密度较低的区域C（残基188-197）和分子D类（残留量92-98和193-197）在精炼(例如。只有C^α对这些区域中的任何其他原子进行细化并将其占用率设置为0）。从平均值来看，这些分子的不同质量是显而易见的B类链的因素A类和B类（46和41 Ų和链条C和D类（63和70 Ų，分别）（见图3b条). 分子中的催化二硫键A类和B类在混合氧化还原状态下建模（图3），而在分子中C和D类它们被建模为简化的。

2.8. 静电表面电位疏水表面的计算与可视化

这个自适应泊松-Boltzmann解算器(APBS公司)用于计算表面静电势α-使用非线性泊松-玻尔兹曼方程（Baker）的DsbA2、PmScsC和EcDsbC等。, 2001). 在进行计算之前，对结构进行了叠加和类似定向。我们使用了PARSE部分原子电荷和半径，内部和外部介电常数值分别为2和78，溶剂和离子探针半径分别为1.4和2 Å。使用离子强度对应于150 米M（M）310℃下的单价反离子浓度 英国。

可视化疏水表面补丁α-DsbA2、PmScsC和EcDsbC（图4），我们使用UCSF奇美拉（佩特森等。, 2004). 氨基酸残基被映射到Kyte和Doolittle（1982）的疏水性等级). 在图4中，极性最强的残基显示为紫色，疏水性最强的残留物显示为棕色。

2.9. FL的小角X射线散射α-DsbA2和α-DsbA2型ΔN个

的SAXS数据α-DsbA2型ΔN和FLα-DsbA2是在澳大利亚同步加速器（Kirby）的SAXS/WAXS光束线上采集的等。, 2013). 数据缩减使用分散的大脑（v.2.71；澳大利亚同步加速器；https://archive.synchrotron.org.au/aussyncbeamlines/saxswaxs/software-saxswax)并对数据进行了溶剂散射、样品透射和检测器灵敏度校正。对于α-DsbA2型ΔN、 an～5的系列稀释 毫克 毫升⁻¹库存被装载到96英尺的钢板中，而FLα-使用内联SEC–SAXS设置测量DsbA2（见表2). 使用由蛋白质序列确定的对比度和部分比体积来计算估计的分子量（Whitten等。2008年). 数据处理和吉尼亚分析使用普里默斯（v.3.2；科纳列夫等。, 2003). 对距离分布函数[对(第页)]根据实验数据生成，使用GNOM公司（v.4.6；Svergun，1992年)，从中我（0）中，R（右）_克和D类_最大值已确定。达明（v.5.3；Svergun，1999年)用于为每个蛋白质生成16个虚拟原子模型（假设C₁的点群对称性α-DsbA2型ΔN和C₃的点群对称性α-DsbA2型ΔN） ，其平均值使用达马弗（v.2.8.0；Volkov和Svergun，2003年)，平均结构的分辨率使用SASRES公司（图克卡宁语等。, 2016). 所有16个哑原子模型均用于α-DsbA2型ΔN、 但在16个哑原子模型中，只有9个（扁圆）模型是FL的平均值α-DsbA2。使用珊瑚（v.1.1；弗兰基等。, 2017). 对于α-DsbA2型ΔN、 残留物Asp68–Leu247取自晶体结构并作为刚性单元处理，而N和C末端包含五个额外的残基，并作为柔性连接体处理。对于FLα-DsbA2，C₃假设对称，Leu17–Arg27（三维建模程序生成的模型螺旋段I-TASSER公司; Zhang，2008年)，Asp34–Glu57（由I-TASSER公司)和Ala65–Leu247（来自α-DsbA2型ΔN晶体结构）被视为刚性亚基，而在N和C末端添加的五个额外残基以及刚性段之间的中间区域被视为柔性连接物。作为齐聚发生在N末端区域，模型螺旋为两性恋，Leu17、Ile20、Trp23、Ile36、Leu40、Ile44、Phe48、Val52和Leu55被限制在15以下 来自对称相关链中的相同残基。

3.1. 的N末端沃尔巴克氏体 α-DsbA2预计为螺旋形

原型二硫键异构酶EcDsbC的87位N-末端区域采用β-带有连接到催化域（麦卡锡等。, 2000). 存在可检测的DsbA-like结构域和扩展的N末端区域沃尔巴克氏体 α-DsbA2序列表明，与EcDsbC一样，50个残基的N末端区域可能充当二聚结构域。然而，预测的α-DsbA2 N端区域与EcDsbC的等效区域没有结构关系（图1一).

图1 细菌二硫键异构酶序列和结构的比较。(一)顶部面板：对齐α-DsbA2（不包括信号肽残基1–15）和EcDsbC。二级结构由EcDsbC（PDB入口）的结构确定1个)或使用预测JPred（红色）（德罗兹德茨基等。, 2015)的α-DsbA2。蓝色，螺旋形；红色，发丝。中间面板：α-DsbA2、LpDsbA2，CcScsC和PmScsC。二级结构α-DsbA2、LpDsbA2和CcScsC的预测方法如下JPred（红色）PmScsC的值由结构（PDB条目）确定四驱大众). 蓝色，螺旋形；红色，线束；橙色，在PmScsC（Furlong）中采用不同构象的变形肽等。, 2017)，尽管预测为螺旋形JPred（红色）.深蓝色字母表示所有四种蛋白质的变形区中的谷氨酰胺残留。在这种比对中，一个残基在所有四种蛋白质的N末端区域保守，并标记为“*”，另一个残基则在所有蛋白质的N端区域保守α-DsbA2、LpDsbA2和CcScsC，标记为“@”，九个残基在LpDsfA2、CcScs和PmScsC之间保守，标记为‘&’。底部面板：的N末端区域的序列对齐α-DsbA2和紧密同源物。同源物是通过以下方法获得的比对（Altschul&Koonin，1998年)根据序列匹配将和对齐α-DsbA2。在这一排列中，完全保守的残基被标记为“*”，并且在13个残基中至少有7个被保守α-DsbA2同源物标记为“&”。(b条)基于结构和序列的C末端结构域对齐α-DsbA2、LpDsbA2，CcScsC、PmScsC和EcDsbC。的二级结构α-DsbA2、PmScsC和EcDsbC来自它们的结构；LpDsbA2和CcScsC的二级结构预测如下JPred（红色）.CXX年C活性部位和顺式-脯氨酸环残基通过阴影框识别。顺序颜色键：蓝色，螺旋形；红色，股；橙色斜体，变形肽；深蓝色，谷氨酰胺残留在形状移动肽区域。在这个复合序列中，所有五种蛋白质中保守的十个残基被标记为“*”，另外七个残基跨四种蛋白质保守α-DsbA2、LpDsbA2，CcScsC和PmScsC（但不是EcDsbC）标记为“^”，这是三种蛋白质中保守的十个残基α-DsbA2、LpDsbA2和CcScsC（但不是PmScsC）标记为“@”，并且LpDsbA2、CcScsC和PmScsC之间保守的七个残基（但不是α-DsbA2）标记为“&”。在所有比对中，结构已知的序列被标记为“#”。

最近，凝胶过滤显示，其他三种DsbA-like蛋白因其N末端残基而低聚；这三种都是功能性二硫键异构酶。这些是嗜肺军团菌DsbA2（LpDsbA2；可能是二聚体，具有约50个残基的N末端区域，预计为螺旋；Kpadeh等。, 2015),C.新月ScsC（CcScsC；可能是二聚体，具有约60个残基的N末端区域，预计为螺旋；Cho等。, 2012)和奇异PScsC（PmScsC；一种已证实的三聚体蛋白；～60残基螺旋N末端区域；Furlong等。, 2017). 基于这四种蛋白质的预测或已知二级结构的比对(α-DsbA2、LpDsbA2，CcScsC和PmScsC）如图1所示(一)，表明它们都被预测为螺旋形，并且这些螺旋区域可以对齐。我们知道，PmScsC有一个变形基序，预测为螺旋，但实际上可以采用螺旋、股线或线圈结构（该区域在图1中以粗体橙色斜体显示一和1b条). 有趣的是，在这个区域中，LpDsbA2、CcScsC和PmScsC的序列比在α-DsbA2。这包括在PmScsC变形区内或附近对齐的区域中谷氨酰胺残基的优势（图1一和1b条). 富含谷氨酰胺的区域通常与蛋白质的内在紊乱有关（Dyson&Wright，2005). 图1的中间面板(一)还表明，LpDsbA2、CcScsC和PmScsC的序列在这个N末端区域的～40个残基中有10个保守残基，而α-DsbA2只有两个在LpDsbA2和CcScsC中保守的残基。此外，该区域没有谷氨酰胺残留α-二级结构预测的相似性和谷氨酰胺富集的差异性表明，与PmScsC、LpDsbA2和CcScsC一样，它们可能具有形状移动区域。然而，α-DsbA2似乎是个例外；其N末端区域不同，不太可能发生形状变化。综上所述，这些数据表明LpDsbA2、CcScsC和PmScsC的N末端区域彼此相似，可能具有PmScscC的形状移动特征。然而，这种变形特征，以及与此主题相关的动态运动，在α-DsbA2及其近同源物。

的C端域对齐α-DsbA2（包括硫氧还蛋白折叠和插入的螺旋结构域）与其他细菌蛋白二硫化物异构酶的DsbA2（包括硫氧还蛋白折叠和插入的螺旋结构域）如图所示。1(b条). 这种排列表明α-DsbA2、LpDsbA2和CcScsC彼此之间的相似性（螺旋域中有四个螺旋，与EcDsbA中的数量相同）大于PmScsC（在螺旋域中具有三个螺旋）或EcDsbC（在螺线域中具有两个螺旋）。

3.2.α-DsbA2具有氧化还原活性，并且由于其N末端残基具有二硫键异构酶活性

我们研究了FL的氧化还原特性α-DsbA2和截断α-DsbA2型ΔN氧化还原电位提供了有关蛋白质从底物获取电子并因此被还原的倾向的重要信息。我们测定了FL的标准氧化还原电位α-DsbA2和α-DsbA2型ΔN相对于氧化还原电位谷胱甘肽（-240 毫伏；图2一). 根据这些数据K（K）_等式对于FLα-DsbA2计算为2.16±0.15×10⁻⁴ M（M），对应于氧化还原电位共−131个 mV，pH值7.0。计算的K（K）_等式对于α-DsbA2型ΔN氧化性稍高，8.71±0.12×10⁻⁵ M（M），对应于氧化还原电位第页，共−122页 mV。相比之下氧化还原电位对于沃尔巴克氏体 α-DsbA1的降幅更大：E类⁰= −163 mV（库尔茨等。, 2009). 因此，FL和截断α-DsbA2蛋白具有类似于单体EcDsbA的氧化还原电位(E类⁰= −122 毫伏；莫斯纳等。, 1998)和二聚体EcDsbC(E类⁰= −129 毫伏；扎普等。1995年).

图2 的氧化还原属性α-DsbA2(一)氧化还原电位。还原FL和氧化FL之间的平衡α-DsbA2（三角形）和α-DsbA2型Δ显示了N个（圆圈）。数据表示为两次测量的平均值±SD。(b条)蛋白质二硫还原酶活性。进行胰岛素还原试验以测量α-DsbA2变体可降低胰岛素。在650℃下监测由蛋白质或非催化（空白）催化的胰岛素减少 50 nm以上 最小值。显示了三次重复测量的平均值（黑线）和标准偏差误差（浅灰色线）。显示二硫醇氧化酶（EcDsbA）和二硫键异构酶（EcDsbC）的活性进行比较。(c（c）)蛋白质二硫键异构酶活性。在EcDsbC（钻石）、FL存在下杂乱RNase A的异构化α-DsbA2（三角形）或α-DsbA2型ΔN（圆圈）、阳性对照组（RNase A；倒三角形）和空白对照组（不含酶的RNA酶A打乱；正方形）。数据表示为三次重复测量的平均值±SD。(d日)二硫醇氧化酶活性。显示EcDsbA（阳性对照；正方形）氧化模型肽二硫醇（在GSSG存在下）的荧光曲线，α-？DsbA2ΔN（圆圈），FLα-DsbA2（三角形）、GSSG（不含酶，即阴性对照；星形）和α-不含肽的DsbA2（空白；钻石）。数据以三次重复测量的平均值±标准差表示。

在标准二硫化物还原酶分析中，DSB酶具有不同程度的活性。我们发现，FL减少了溶液中一半的胰岛素α-~15后的DsbA2（由于溶液中的DTT而呈简化形式） 最小值（图2b条). 相比之下，EcDsbC在～6内减少了一半的胰岛素 min和氧化酶EcDsbA（由于溶液中的DTT而呈还原形式）在～35后减少了一半的胰岛素 最小活性α-DsbA2型Δ该试验中的N可忽略不计，与阴性对照组相当。这些数据表明FLα-DsbA2具有氧化还原活性，N末端残基对二硫还原酶活性至关重要。

接下来我们评估了FL的蛋白质二硫键异构酶活性α-DsbA2和α-DsbA2型Δ通过在在体外化验。佛罗里达州α-～5天后，DsbA2恢复了73±3%的RNase A活性 h、 与阳性对照组相比，EcDsbC在同一时间段内恢复了85±5%的RNase A活性，尽管在100 最小值，然后稳定（图2c（c）). 相比之下，被截断了α-DsbA2型Δ在此期间，N仅恢复了相对于天然重折叠RNase A的35±3%的RNase A-活性，与氧化酶EcDsbA（Shouldice等。2011年). 因此，我们的结论是α-DsbA2是一种蛋白质二硫键异构酶，其二硫键异构酶活性需要存在N末端残基。

我们还调查了FL是否α-DsbA2或α-DsbA2型ΔN通过测量其催化二硫键形成的能力，证明了二硫醇氧化酶的活性在体外化验。具体来说，我们测量了FL的能力α-DsbA2或α-DsbA2型ΔN在氧化谷胱甘肽（GSSG）存在下氧化模型肽的半胱氨酸。与EcDsbA介导的肽氧化相比，FLα-DsbA2表现出可忽略不计的肽氧化活性（与GSSG对照相当），而α-DsbA2型ΔN的活性较弱（图2d日)在本试验的实验条件下。EcDsbC活性低于EcDsbA，并且在本试验中活性低于PmScsC（Furlong等。, 2017).

3.3. 这个晶体结构属于α-DsbA2型ΔN揭示了规范的DsbA体系结构

我们无法生成全长成熟的晶体α-然而，截短的晶体α-DsbA2型ΔN确实增长了晶体结构由解决分子置换分辨率为2.25 Å（表1，图3一).

图3 的结构α-DsbA2型ΔN(一)的功能区表示α-DsbA2型ΔN（链条B类显示蓝色硫氧还蛋白结构域，催化半胱氨酸S原子为黄色球体。螺旋插入以灰色显示，截短蛋白的N末端以浅绿色显示。(b条)中的四个分子非对称单元。链条B类以与中相同的方式定向(一)并显示为深蓝色。精细坐标的相对晶体学温度因子由主链厚度（低到高表示为薄到厚）和链的主链厚度表示A类,C和D类按颜色（从蓝色到红色从低到高）。(c（c）)链的活性位点半胱氨酸Cys107和Cys110B类在混合氧化还原状态下建模（显示链B类，使用2F类o个负极F类c（c）1.0等高线下的电子密度图σ).

最终优化的结构α-DsbA2型ΔN在不对称单元（链条A类,B类,C和D类; 图3b条)，每一个都具有TRX折叠的经典DsbA结构，该结构具有插入的四螺旋结构域和连接螺旋。与其他类DsbA晶体结构一样，Cys-Gly-His-Cys活性位点位于螺旋的N末端αTRX域中的3（呈现为还原和氧化形式的混合物；图3一).

使用此晶体结构作为探针DALI公司匹配（截至2018年3月1日）是三聚体蛋白PmScsC（PDB条目5idr（国际存托凭证），分子A类; 弗隆等。, 2017)，带有Z轴-得分为25.8，r.m.s.d.为1.5 178℃时为^α原子和24%的序列一致性。PmScsC之后，第二高DALI公司hit是一种来自波梅罗伊硅杆菌（来自红杆菌科；PDB条目3吉克，分子A类; 中西部结构基因组学中心，未出版作品）Z轴-得分为24.8，r.m.s.d.为1.5 169 C时为^α原子和30%的序列一致性。第三大热门是单体蛋白SeScsC（PDB条目4gx赫兹，分子C; 牧羊人等。, 2013)，带有Z轴-得分为24.1，r.m.s.d.为1.6 166 C时为^α原子和25%的序列一致性（这被用作分子置换模型来解决晶体结构属于α-DsbA2型ΔN） ●●●●。

通过比较α-DsbA2型Δ原型二硫键异构酶EcDsbC（PDB条目）的N结构1个，分子A类; 麦卡锡等。, 2000)使用DALI公司给出了一个Z轴-得分为13.5，r.m.s.d.为3.3 147℃时为^α原子（Maiti等。, 2004). 这些数据表明，这两种二硫键异构酶在结构上非常不同。

3.4. 的表面特征α-DsbA2揭示了与其他细菌二硫化物异构酶的差异

我们生成了催化域的静电表面电位和疏水表面α-DsbA2和其他两种具有结构特征的二硫键异构酶：三聚体PmScsC和二聚体EcDsbC。图4对这些进行了比较值得注意的是，PmScsC和EcDsbC的催化位点附近有一个基本区域，该区域在α-这种差异表明酶对底物的偏好不同，或者对氧化还原特性的贡献可能不同。图4还显示了α-催化位点附近的DsbA2主要是疏水性的。PmScsC和EcDsbC中也存在疏水区域，该特征的保留表明这是未折叠蛋白底物的结合位点。

图4 表面特性的比较。静电表面电位α-DsbA2、PmScsC和EcDsbC（顶面板）。静电表面势的非线性计算自适应泊松-Boltzmann解算器(APBS公司)以及PARSE部分原子电荷和半径。静电表面电位分布在−6之间千吨 e（电子）−1（红色）和+6千吨 e（电子）−1（蓝色）。表面疏水性α-DsbA2、PmScsC和EcDsbC显示在底部面板中。蛋白质表面被映射到Kyte–Doolittle疏水性等级，从紫色（最亲水）到白色到棕色（最疏水）。这些结构的排列方向与α-图3中的DsbA2(一). 活性位点半胱氨酸的位置由黄色圆圈表示。

3.5. SAXS表明α-DsbA2是一个同源三聚体，因为它的N末端区域

虽然我们无法结晶全长蛋白质，但我们能够使用来自两个FL的SAXS数据获得低分辨率结构信息α-DsbA2和α-DsbA2型ΔN（表2). 吉尼亚曲线（插入图5一)呈现线性趋势，与两个样本的单分散性一致。

图5 小角度X射线散射数据α-DsbA2型ΔN和FLα-DsbA2(一)测量的散射数据α-DsbA2型ΔN（红色；为了清晰起见，乘以10倍）和FLα-DsbA2（蓝色）。刚体模型的散射轮廓显示为覆盖在散射数据上的实心黑线α-？DsbA2ΔN个[χ2= 3.88; CorMap测试（Franke等。, 2015)，294分，C= 66,P（P）=0.000]和FLα-DsbA2型(χ2= 1.37; CorMap测试，320分，C= 13,P（P）= 0.037). 插图：吉尼亚阴谋对于α-DsbA2型ΔN（红色；R（右）2=0.999）和FLα-DsbA2（蓝色；R（右）2= 1.000). (b条)对距离分布函数，对(第页)，由散射数据导出，表示最大尺寸为～63的球状结构 为α-DsbA2型ΔN（红色）和～87 佛罗里达州的奥数α-DsbA2（蓝色）。作为参考，实验对(第页)还显示了三聚体PmScsC（虚线）。(c（c）)可能的形状α-DsbA2型Δ从16个哑原子模型的过滤平均值中获得的N（单体）（红包）：χ2= 1.038 ± 0.002; NSD=0.446±0.021；分辨率=17±2 Å. (d日)FL的可能形状α-从九个哑原子模型的过滤平均值获得的DsbA2（蓝色信封）：χ2= 1.202 ± 0.003; NSD=0.602±0.027；分辨率=30±2 Å. 中的图像(c（c）)和(d日)是使用生成的PyMOL公司（v.1.2r3pre；Schrödinger），其中灰色形状表示对齐的哑原子模型所包含的总体积，相应的刚体模型与过滤模型对齐（柔性区域由黑色球体链表示）。

迄今为止，已报道细菌二硫键异构酶为二聚体（EcDsbC、CcScsC和LpDsbA2）或三聚体（PmScsC）。因此，我们有兴趣测定全长蛋白的分子量，并确定它是二聚体还是三聚体。使用SAXS数据，截断的α-DsbA2型ΔN估计为～23 kDa来自我（0）（奥塔贝尔等。, 2000)多孔体积（Fischer等。, 2010)，非常接近α-DsbA2型ΔN单体（21 kDa），并与晶体结构我们在这里报道。然而，FL的分子质量α-DsbA2估算自我（0）和多孔体积（75和87 kDa）与同三聚体（81）的质量一致 kDa）而不是同二聚体（54 kDa）。

这个对(第页)对于FLα-DsbA2显示最大尺寸为～87的单个峰值 奥（图5b条)，而α-DsbA2型ΔN表示一个单峰，最大尺寸明显较小，为63 Å. 中峰值位置的较大尺寸和偏移对(第页)对于FLα-DsbA2与高阶低聚物的形成一致。虽然这些数据表明FLα-DsbA2低聚物是三聚体，这种同三聚体不同于PmScsC（Furlong等。, 2017)，具有双峰对距离分布函数（图5中的虚线b条).

采用虚拟原子和刚体模型来确定FL的低分辨率溶液结构α-DsbA2和α-DsbA2型ΔN.的平均和过滤哑原子模型α-DsbA2型ΔN表示与α-DsbA2型ΔN刚体模型（由晶体结构加上N端和C端的缺失残留物；图5c（c）). 散射数据与刚体模型散射剖面的比较（图5中的红色曲线和黑线一)显示出良好的对应性，尽管两条曲线之间存在微小的系统差异，这可能表明样品杂质水平较低，或者溶液和晶体结构之间可能存在微小差异。

FL的平均和滤波哑原子模型α-DsbA2显示了一个在中心有一个小突起的盘状结构。此模型与FL对齐α-DsbA2刚体模型（图5d日)表现出出色的通信能力；N端子齐聚刚体模型的畴与哑原子模型的突起相吻合，催化畴位于主圆盘周围。FL的散射数据α-DsbA2与刚体模型散射剖面（图5中分别为蓝色数据点和黑线一).

两种同三聚二硫异构酶沃尔巴克氏体佛罗里达州α-然而，DsbA2和PmScsC具有不同的解决方案结构。佛罗里达州α-DsbA2是盘状的，三个原聚体紧密排列成紧凑的形状（图6一和6b条)，而PmScsC具有更开放的布置（图6c（c）和6d日; 弗隆等。, 2017).

图6 FL刚体模型的比较α-DsbA2和PmScsC。FL型号α-来自的DsbA2(一)侧面和(b条)底部视图。PmScsC模型（SASBDB代码SASDB94标准)来自(c（c）)侧面和(d日)底部视图。对于两个FLα-DsbA2和PmScsC N端三聚化域显示为绿色带状催化域作为白色丝带和活性中心残留物作为黄色球体。刚体模型中被视为柔性连接体的区域未显示，这是N末端三聚化域中出现明显间隙的原因，如(一).