1.简介

单波长反常色散（SAD）是最流行的实验阶段化技术从头开始 结构测定通过大分子晶体学（MX）。将近50%的新结构存储在蛋白质数据库（PDB；Berman）中等。, 2000)使用此方法确定。绝大多数SAD实验利用了重原子的强烈异常信号，这些信号通过浸泡重元素或表达硒代亚砜蛋白来传递（Hendrickson，2014)。然而，由于同构和衍射的损失，这些派生可能会有问题。因此，仅使用天然晶体的SAD实验非常有吸引力。这种方法称为原生SAD，它利用轻元素发出的微弱异常信号(Z轴< 20,即主要是S、P、Cl^负极，K⁺和钙²⁺)这些天然存在于生物分子中的物质具有某些挑战，直到最近才成为一种通用方法。这些光散射体的异常信号在低能时较高（<6 keV），但样品的X射线吸收，包括晶体、周围溶剂和安装介质，尤其是空气对X射线的吸收，导致衍射信号显著衰减。低能晶体学的其他困难在于探测器方面，由于布拉格反射角增加，校准不准确，典型平面结构的高角度衍射损失。为了克服这些限制，并推动本地SAD相位（Bent等。, 2016)，专门为能量低于5的本地SAD数据采集设计的特殊设置 英国钻石光源光束线I23已经开发出keV（Wagner等。, 2016)以及日本KEK光子工厂（Liebschner）的BL-1A等。, 2016)。假设衍射延伸至～2.8 在常规的大分子晶体学光束线上，使用6的能量，也可以获得高分辨率、高质量的自然SAD相位数据 keV（米勒-迪克曼等。2007年; 线路接口单元等。, 2012; 韦内特等。, 2015).

最近，对天然SAD作为一种方法的演变进行了综述（罗斯等。, 2015; Rose&Wang，2016年; Liu&Hendrickson，2017年)。第一个示例从头开始亨德里克森和蒂特于1981年使用crambin（46个含有6个S原子的残基；亨德里克逊和蒂特，1981年)。然而，由于crambin晶体的高分辨率和稳定性，这是一个特别值得注意的案例，尽管在此后的十多年里，原生SAD没有解决其他结构，但本报告为重原子SAD的逐步发展打开了大门。使SAD成为实际实验的要点是下部结构测定、溶剂压平和密度调整（Wang，1985)。早期的反常相位实验协议要求从沿均匀对称轴排列的晶体进行精心设计的测量，这对于以最小剂量差测量Bijvoet对很有用（Hendrickson，2014)。类似地，用所谓的“反向测深法”收集间隔180°的楔形数据（Hendrickson等。, 1985)。随后证明了高多样性对本地SAD阶段化的好处（Dauter等。, 1999; Dauter，1999年; Dauter和Adamiak，2001年; 德布雷克泽尼、班科奇、吉尔曼等。, 2003; Debreczeni、Bunkóczi、Ma等。, 2003; 格尔曼·德布雷克泽尼等。, 2003; 米勒-迪克曼等。, 2004); 尽管如此，在高通量第三代同步加速器MX光束线中，一种更简单、更快的协议是常见的做法。它针对基于CCD的探测器技术进行了优化，包括收集实现100%完整性所需的最小旋转范围，通常具有较高的X射线剂量。该协议使用单轴测角仪进行，也用于实验定相，虽然它可以满足硒等强散射体的实验定相要求，但辐射损伤的有害影响使其不适用于自然SAD，除非是高分辨率和高对称性的情况。与此同时，多轴测角仪是小分子晶体学领域的标准，30年前也曾是MX的标准，在MX光束线上已基本被单轴气浮测角仪所取代，该测角仪具有亚微米混乱球体和快速旋转速度，他们取得了巨大的成功。然而，随着光束线硬件的发展，而不需要多轴测角仪，很明显，较旧的测角仪设计与新的光束线不兼容，并且肯定不够精确，无法处理不断减小的蛋白质晶体尺寸。然而，失去多轴测角也意味着失去以受控方式自由重新定向样本的能力。为什么这很重要？多方向数据收集有两个主要优点，这对本地SAD至关重要。首先，从多个方向收集数据意味着在探测器的不同区域多次测量反射强度，从而平均出系统误差。其次，非球形晶体经历了方向依赖性吸收，通过收集多个方向的数据可以更有效地对其进行建模。因此，多方位数据采集可实现更准确的强度测量，这意味着更准确的异常差值估计。如果测得的异常差异小于或等于总强度的1%，就像天然SAD的典型情况一样，高精度显然非常重要。

2011年，Liu和Hendrickson展示了多晶体平均法增强异常信号的能力（Liu等。, 2011)并通过仔细选择和合并在容许剂量为～5时收集的多个晶体的统计等效数据集，将其应用于天然SAD MGy（刘等。, 2012, 20132014年; Liu&Hendrickson，2015年)。接下来是更具挑战性的例子（El Omari等。2014年; 阿基等。2014年, 2016; 赞德等。, 2015)。类似的方法包括收集多个低剂量数据集（<0.5 在仅使用一个晶体（Weinert）的本地SAD的挑战性案例中，证明了在多个方向上的MGy（每360°）是成功的等。, 2015)。后一种策略是使用多轴测角仪PRIGo（Parallel Robotics Inspired Gonometer；Waltersperger）实现的，本文对此进行了详细介绍等。, 2015)这是一种新型测角仪，它将机载测角仪的高精度与空间再定位的灵活性结合在一起。

可以说，在过去十年中，MX数据收集领域的最大进步是引入了混合（像素阵列）光子计数探测器（HPC）；Broennimann等。，2006年)例如PILATUS（亨利克等。, 2009)，它速度快，具有零读出噪音，彻底改变了MX数据收集协议，并允许用户利用速度和高通量第三代同步加速器。极短的死时间和读出时间，加上单光子计数灵敏度，实现了“无快门”数据收集，与以前的CCD探测器相比，大大缩短了数据收集时间（Mueller等。, 2012)。现在，360°总角度范围的高质量单一数据集通常可以在不到一分钟的时间内收集到：与～30°相比有了巨大改进 最小值或更多，这将需要CCD探测器。除了用户现在可以在单个同步加速器光束分配过程中收集数百个数据集（通常为8个 h） 这也意味着更“先进”的数据收集策略，例如多晶体或多方向策略，可以很容易地在MX波束线上实施和例行实践。探测器技术的进一步进步以及更快的探测器的出现，如EIGER和JUNGFRAU（Casanas等。, 2016; 利昂纳斯基等。，2018年)推动了数据采集速度的极限，并在同步加速器上实现了更准确的异常和连续晶体学测量（Diederichs&Wang，2017).

在这里，我们回顾了优化的本地SAD数据收集策略（Weinert等。, 2015; Olieric公司等。, 2016)在瑞士光源（SLS）的X06DA（PXIII）光束线上开发，自多轴测角仪PRIGo（Waltersperger）安装以来，我们在这项技术上取得了成功等。, 2015)。将描述实验性本土SAD的策略，以及过去四年中的成功、失败和挑战。

2.材料和方法

2.2。本地SAD阶段的数据收集策略

图1显示了本地SAD实验的数据收集策略的工作流假设用户在考虑本地SAD策略之前已经筛选了他们的晶体并识别出了良好的衍射晶体；分辨率优于～2.8 通常需要使用。如第1节所述，能源的选择对本地SAD阶段的成功至关重要.必须选择一种能提供足够异常信号的能量，同时将空气吸收降至最低，这在较软的X射线区域非常重要。在当前设置为X06DA的情况下，我们使用6的能量 keV，它为通量，异常信号和吸收（米勒-迪克曼等。, 2005; 线路接口单元等。, 2012; 韦内特等。, 2015)。能量越高，分辨率越高，但异常信号越少，而能量越低，则越来越受到空气和样品吸收的影响，因此反射强度越弱。传统尺寸的水晶(即在氮气冷冻流设置为100的情况下，安装在PRIGo多轴测角仪上 K.光栅栅格扫描可用于在晶体上找到最佳衍射位置（切列佐夫等。, 2009; 保龄球等。, 2010; 相岛等。, 2010; 希尔加特等。, 2011; 沃伊迪拉等。, 2016)。典型的本地SAD实验涉及收集360°ω以不同的值进行扫描χ和φ，通常从开始χ=0°和φ=0°，然后收集额外360°ω5°扫描χ增量。我们的目标是估计剂量为～0.5 MGy每360°ω大多数情况下扫描。警告：在视觉分析单个帧时，这通常会导致（至少乍一看是这样）看起来很弱的衍射点。这是故意的；减少剂量，从而减少辐射损伤是关键，缩放和合并单个低剂量数据集可以获得比单个高剂量数据集更高精度和质量的数据（Olieric等。, 2016)。如果晶体是均匀的，可以通过栅格扫描光栅化晶体进行检查，那么从一个晶体合并多个数据集通常很简单。以2°的速率 秒⁻¹，360°ω扫描需要3次 最小总角度为8×360°ω扫描通常不到25次 在除最具挑战性的情况外的所有情况下，从一个晶体位置获得足够的数据以获得本地SAD的高质量解决方案。如果数据证明不足以生成解决方案，并且很明显，在缩放和合并数据中存在异常信号积累，则可以收集来自同一晶体上另一个点或新同晶晶体的额外数据集，并一起缩放。由于低对称性，在具有挑战性的情况下，这可能是必要的(即单斜或三斜），分辨率不足（～3 ？），小晶体（～50 最长方向为µm）或特别容易受到辐射损伤的样品。

图1 低剂量多方向本地SAD数据收集策略流程图。

正如我们上面提到的，最好在收集期间“实时”处理数据，以便监测晶体的辐射损伤，并确定何时收集了足够的数据。虽然这远不是一个自动化过程，但新的波束线数据还原例程确实简化了它。我们开发了一个自动数据处理系统，该系统在在线模式下静默运行，并通过用户友好的基于HTML的网络跟踪器（Wojdyla等。，2018年)。我们的在线软件XDS公司（卡布施，2010年)用于处理单个数据集。处理了一些扫描后XDS公司，的XDS_ASCII。香港（HKL）每个数据集中的文件可以使用XSCALE（XSCALE）（卡布施，2010年)。监控缩放后的相对值很有用B类由XSCALE公司产出；高值表示辐射损伤和异常信号丢失，应重新定位或更换样品。如果使用缩放后获得足够的异常信号和良好的数据质量XSCALE公司,下部结构可以使用开始确定SHELXD公司（谢尔德里克，2010年)。一旦下部结构已经确定，数据可以传递给分阶段程序，例如SHELXE公司（谢尔德里克，2010年),曲柄2（斯科巴克和潘努，2013年),自动SHARP（冯海因等。2007年)或自动解决方案（特威利格等。, 2009)将密度修改和自动建模相结合。如果下部结构测定失败，这意味着需要从同一晶体（如果剂量允许）或新晶体收集更多数据。在X06DA，数据收集速度为6 keV当前限制为2° 秒⁻¹; 然后，通常在收集数据时执行数据合并和子结构确定尝试。前提是波束线可以以非常快的数据收集速度运行（>10° 秒⁻¹)，更有效地利用束流时间可能包括首先从所有晶体位置采集，然后进行合并和下部结构解决方案。

2.2.1. 链球菌亲和素-生物素：制备和结晶

链球菌抗生物素阿维迪尼链霉菌是52.8 kDa蛋白（不对称单元中的四个单体），共有508个残基（不对称单元内的4×127个残基），没有S原子。Strept­avidin购自IBA Lifesciences。生物素是一种含硫配体，根据Chatterjee合成等。(2016)。通过混合13.25获得链霉抗生物素-生物素复合物（SavB） mg野生型strept­avidin，含0.610 500中的mg生物素 µl小时₂O.静滴中的蒸汽扩散通过混合1进行 1µl SavB溶液 µl由80%MPD和100组成的溶液 米M（M）MMT pH 5.5（分子尺寸），并与500 µl储液罐，含50%MPD。平均尺寸为50×150×200的晶体 在以下条件下获得µm空间组 对2₁两天之内。采集晶体并在液氮中快速冷却，以便在数据收集之前进行储存。本工程中SavB的坐标和结构因子已作为条目保存在PDB中6米9磅.数据收集和细化统计总结见表1.

表1 链球菌亲和素-生物素（SavB）的数据收集和处理统计数据，使用5.975 keV（本地SAD）和12.398 SLS处X06DA波束线上获得的keV数据 括号中的值表示最后一个shell。   SavB，本地SAD，5.975 千电子伏 萨瓦B，12.398 千电子伏 数据收集  光子能量（keV） 5.975 12.398  光束尺寸（µm） 90 × 50 90 × 50  通量（光子 秒−1) 1.5 × 1010 3 × 1011  “空间”组 对21 对21  一,b条,c（c）(Å) 50.9, 98.3, 52.7 50.9, 98.3, 52.7  α,β,γ(°) 90, 112.6, 90 90, 112.6, 90  振荡角（°） 0.2 0.2  暴露时间（s） 0.1 0.1  晶体到探测器的距离（mm） 120 120  每个数据集的剂量（MGy） 0.54 1.64  总振荡（°） 位置1，7×360；位置2，7×360 1×360  χ角度（°） 0–30;Δ= +5 0  分辨率（Ω） 50–2.10 (2.19–2.10) 49.16–1.55 (1.60–1.55)  独特反射次数 46906 (1276) 69231（6500）  反射次数 1830538 (7044) 46604 (42076)  多重性 39.02 (5.52) 6.70 (6.50)  完整性（%） 100 (100) 99.33 (93.55)  R（右）测量(%) 6.0 (18.30) 5.702 (61.40)  科科斯群岛1/2(%) 100 (97.40) 99.99 (82.10)  〈我/σ(我)〉 57.4 (7.38) 22.30 (2.95)  镶嵌度（°） 0.18 0.18  异常散射体数量 4 不适用  分辨率截止SHELXD公司(Å) 2.6 不适用  相关系数（全部/弱） 28.32/21.66 不适用  溶剂含量（%） 46.6 49.8 精炼  分辨率（Ω）   49.16–1.55 (1.60–1.55)  R（右）工作(%)   15.36 (23.70)  R（右）自由的(%)   18.34 (26.34)  非H原子数量   总计   4187   大分子   3617   配体   64   水   506  蛋白质残留物数量   477  R.m.s.偏差   粘结长度（Ω）   0.009   结合角（°）   1.37  威尔逊B类(Å2)   16.73  平均值B类(Å2)   总体   24.90   大分子   23.40   配体   15   水   36.70  冲撞得分   1.67  拉马钱德兰阴谋   有利（%）   98   允许（%）   2   异常值（%）   0  PDB代码   6米9磅

3.结果和讨论

过去四年来，我们和我们的用户一直在使用我们的本地SAD策略，我们已经报告了一些重大成功（Weinert等。, 2015; Olieric公司等。, 2016)。根据我们的档案（2014年11月至2019年1月），该档案仅反映了我们与用户一起跟踪的项目，我们在总共97个尝试案例中确定了75个本地SAD结构。这包括成功确定45从头开始结构（图2)其中13本已经出版（Campagne等。2014年; 冈查连科等。, 2015; 尼瑟等。, 2016; Brandmann&Jinek，2015年; 江等。, 2017; 欧点等。, 2017; 列奥奈特等。, 2017; 2016年，罗兹和吉内克; 赫尔曼斯等。，2018年; 西耶蒂等。，2018年; 霍曼等。，2018年; 线路接口单元等。, 2019; 王等。, 2019)。在这97个案例中，有27个结构（如图2中的“方法开发”所示)我们的解决方案旨在展示我们本土SAD战略的潜力。不同用户提供的75个已解结构中，大多数具有高对称性（正交或更高），衍射良好(< 2.5 分辨率）和相对较小（<100 kDa）。对于这种情况，常规解决方案需要平均4.5×360°ω在不同方向进行扫描，15年完成 最小值或更小。

图2 低能分布（6 过去四年在X06DA（PXIII）光束线上进行的keV）实验。原生SAD成功解决了75个结构，其中45个是新结构(`从头开始'). 之前通过其他方式解决了27个问题，例如分子置换或Se-SAD（“方法开发”）。在三种情况下，由于大肠杆菌净化过程中的污染（“污染物”）。有两种情况下部结构解决方案是成功的，但不是分阶段的（“只有子结构”），还有20个失败的案例（“没有子结构””）。为了获得光散射体在结构中的位置并帮助建立模型（“序列标记”），进行了七项实验。

在PDB中报告的157个原生SAD结构中，约15%在低对称空间群中结晶（Olczak&Cianci，2018)。同时，PDB中约30%的总沉积结构以单斜或三斜空间群结晶，这表明存在已被天然SAD解决的低对称性蛋白质晶体的缺陷。事实上，只有两份关于本土SAD（Banerjee）解决的三斜晶结构的报告等。, 2016; 米勒-迪克曼等。2007年)。在我们的97例病例中，约22%在单斜晶系中结晶空间组，其中66%可以解决。

因为它是一个从头开始方法中，本地SAD的数据不依赖于初始模型的知识，这可能会导致一些令人惊讶的结果。我们最近解决了三个这样的案例（图2)用户携带了他们想要的蛋白质晶体，但无法使用分子替换。在早期分析单元间参数时（伯曼等。, 2000; 麦吉尔等。2014年; 拉姆拉吉等。, 2012)或使用Contaminer公司（饥饿等。, 2016)或辛巴德（辛普金等。，2018年)可能是有用的，后来被确定为大肠杆菌6点采集本地SAD数据时的污染物 keV使用我们的策略。它们是两种不同的四方晶体形式的葡糖胺-6-磷酸脱氨酶和碳酸酐酶(对4₂2₁2和对4_三22).

有两种情况下下部结构可以识别，但相位调整失败（图2)由于分辨率低或溶剂含量低。另外18个结构（图2)由于辐射损伤（晶体<40 尺寸为µm），本征分辨率低（≥4 奥），一个非常大的下部结构（>200个位点），大分子（>300 kDa）或观测到的反射次数与下部结构（特威利格等。, 2016)或其组合。一般来说，我们建议衍射为3的晶体使用天然SAD 分辨率或更好。低于此值的分辨率将非常具有挑战性，因为异常信号将更加微弱。

下面我们用几个具有挑战性的例子来报告我们的成功。这些案例涵盖了低Bijvoet比、低对称性和大下部结构。此外，我们还描述了天然SAD数据在基于微弱异常信号识别正确离子方面的重要性，以及在帮助建立低分辨率晶体结构模型方面的重要性。该模型将蛋氨酸和半胱氨酸残基的硫异常峰用作序列标记。

3.1. 低Bijvoet比率结构：链球菌亲和素-生物素

即使在很少出现异常散射体的特别困难的情况下，本征SAD也可能是一种成功的方法。链球菌亲和素，a 52.8 kDa蛋白（不对称单元中的四个单体）阿维迪尼链球菌这是其中的一个例子：这个508-残基四聚体蛋白既没有含硫残基，也没有任何其他显著的异常散射体。然而，每个单体单元链球菌亲和素与一种含硫配体生物素分子强烈结合。事实上，链球菌亲和素与生物素的相互作用是生物学中已知的最强的非共价相互作用之一，这对下部结构决心。链球菌亲和素-生物素复合物在6时的Bijvoet比率为0.6% keV是目前测试的最低值之一，在单斜晶系中结晶空间组 对2₁使用上述低剂量、多方位的方法，从一个大的（50×150×200） µm）链球菌亲和素-生物素单晶，位于晶体的两个不同区域和不同方向（见表1对于χ/φ设置）。按照第2.2节所述处理数据处理.在6点 keV能量和120的样品到探测器距离 mm，所收集的本地SAD数据的分辨率为2.1 Å. 大量数据被证明对成功分阶段实施至关重要，但对下部结构测定；收集到的总数据中约有一半很容易找到这四个S原子（图3一)，但在没有收集更多数据的情况下，阶段化被证明是不成功的。几轮精炼和密度调整夏普（冯海因等。2007年)最终生成适合精细化，和相位扩展鹦鹉（Cowtan，2010年)使用12.4从同一晶体收集的360°数据集 keV将相位分辨率提高到1.55 奥（图3b条和3c（c）)。相位扩展图用于建模ARP协议/弯曲（兰格等。, 2008)、和精炼具有菲尼克斯定义（黄嘌呤等。, 2012)此后进展顺利。完成模型建筑和精细化，而是显示将低能SAD数据与高能量收集的数据相结合以提高分辨率的实用性。

图3 用天然SAD测定链球菌亲和素-生物素复合物的结构。(一)抄送全部的与CC对比虚弱的情节，显示成功下部结构确定依据SHELXD公司. (b条)实验定相（2如果o个负极如果c（c）)地图轮廓为1.0σ级别，显示Cα模型自动生成后的跟踪自动SHARP. (c（c）)透明灰色SavB复合体二级结构的卡通表示；四个S原子(即异常散射体）显示为绿色球体。

3.3. 使用本地SAD数据进行序列标记和离子分配

为了基于现有模型可视化新的结构特征，结构生物学家可以使用低能数据来定位轻元素，如Cl^负极，K⁺和钙²⁺以及半胱氨酸和蛋氨酸残基中的S原子，或在结构中发现DNA/RNA的磷酸骨架（Weiss等。, 2001)。这在建模低分辨率结构时特别有用。低电平的异常信号-Z轴散射体有时还与从重原子衍生物获得的反常数据或部分分子置换模型相结合，以获得更好的相位（斯科巴克等。，2018年)。最近，我们追踪了七个不同的案例（图2)其中低能数据被用作序列标记，从中已经发表了五个结构（Markovic-Mueller等。, 2017; Fédry餐厅等。, 2017; 恩格尔等。, 2017; 马佐尔等。, 2017; 德涅卡等。，2018年).

低能数据也有助于分配离子（米勒-迪克曼等。2007年; 拉夫等。, 2008; 线路接口单元等。, 2013)。在某些情况下，本地SAD数据中的未知异常峰出现在先前被确定为水或某些轻元素的位置，提供了高能实验中无法获得的额外信息。硫和钾不是唯一自然发生的异常散射体：离子（例如Cl^负极，加利福尼亚州²⁺，K⁺ 等。)蛋白质中的这些也可能导致总的异常信号。钙在6时是一种特别强的反常散射体 keV，带（f）〃=2e^负极然而，虽然在非蛋白质位置出现异常峰表明存在较重的离子，但明确的分配可能需要更多信息。在Cas9–RNA–DNA复合物的情况下，我们在Mg的位置观察到异常峰值²⁺离子（图4)，然后可以指定为K⁺使用X射线吸收光谱的附加信息的离子（Olieric等。, 2016)。因此，如果有足够高的分辨率，结合光谱方法和键长信息，本地SAD数据可用于分配正确的轻元素离子，这些离子经常被错误地分配为水分子或不正确的离子。

图4 Cas9–RNA–DNA复合物的卡通表示，具有4.7的异常差异傅里叶图σ轮廓水平。Cas9蛋白的螺旋以灰色显示，DNA主干以橙色显示。P原子高亮显示为橙色球体。K（K）+和S原子分别显示为洋红色和绿色球体。4.7处的异常图σ水平仪被涂成浅蓝色，追踪每个散射体的位置。

4.总结

在过去的四年里，我们为原生SAD开发并建立了一种低剂量、多方位的数据收集策略，从一种小众技术变成了一种标准技术，任何用户都可以在20岁以下轻松完成 分钟。由于速度快且实验非常简单，X06DA用户通常在6点进行实验 keV在指定的光束时间内。事实上，既没有改变实验设置，也没有事先了解晶体系统是必需的。光束线仪器的进步，特别是高精度多轴测角仪和快速光子计数探测器，使这些本地SAD实验成为可能。虽然我们的本地SAD数据收集策略在配备多轴测角仪的束线上随时可用，例如流行的迷你卡帕（Brockhauser）等。, 2011)正在开发新的多轴测角仪，如SmarGon（SmarAct GmbH的多轴测角仪），将实现多方位数据采集的完全自动化。我们的策略具有广泛的适用性、简单性和快速性，应该鼓励结构生物学界自行尝试本地SAD，将其作为实验阶段的首选：成功的可能性很高，大约为75-80%。

在～20%的本地SAD实验中，我们的策略是不够的（“没有下部结构'如图2所示)。它们主要包括大型子结构（>200个位置）、低衍射分辨率（>3 Å）、三斜和单斜空间群，以及在晶体寿命内可能无法达到足够异常信号的小晶体。为了成功应对这些情况，需要获得较低的X射线能量（5–2.5 keV）可能是有益的。这就需要一种新型的光束线设计，能够更好地校准低X射线能量范围的探测器，以及具有氦室或真空的采样环境。目前，世界上只有两条专用的低X射线能量光束线：日本KEK光子工厂的BL1A和英国钻石光源的I23光束线。这些光束线配备了先进的采样环境(即氦或真空）和特殊探测器配置（V形布置或弯曲探测器），以观察高分辨率反射。这可以推动本地SAD相位的限制，并克服一些主要挑战，如低衍射分辨率（Bent等。, 2016)。考虑到天然SAD较低的X射线能量，晶体厚度引起的X射线吸收是一个主要问题（Arndt，1984; 瓦格纳等。, 2016; 利布施纳等。, 2016)。这可以通过球形激光晶体（北野等。, 2004; 渡边，2006年; 奥利克·巴苏等。, 2019)或者使用微米大小的晶体，这些晶体现在通常用于结构生物学领域。从微米级（<30 µm）单晶，但已经表明，可以使用连续晶体学方法（Huang等。, 2015, 2016，2018年; Diederichs&Wang，2017年; 韦内特等。, 2017)。串行晶体学是一项新技术，但它正在成熟并扩展到大多数现代设施的实验阶段，具有可调X射线能量、可变光束尺寸和更快的无噪声探测器（例如EIGER或JUNGFRAU），以及用于数据收集和处理的相关软件（Axford等。, 2012; 赞德等。, 2015; Sanishvili&Fischetti，2017年; 山本等。, 2017; 郭等。，2018年; 巴苏，卡明斯基等。, 2019)。一个未来有希望的本地SAD实验需要将串行晶体学方法与一种新的更快的无噪声、低能量的方法相结合(即4–2.5 keV）在真空或氦气环境下校准的探测器。