2.1、。的克隆aadA公司进入pEXP5-CT

细菌菌株和质粒列于补充表S1中。这个aadA公司该基因经PCR-扩增，从肠球菌根据制造商的说明，使用Phusion高纯度DNA聚合酶（Thermo Scientific）的鼠伤寒血清型菌株LT2，带有引物aadA_start_Fwd和aadA_CT_Rev（补充表S2），并根据制造商的协议克隆到pEXP5-CT/TOPO载体（Invitrogen）中。在添加了100个 毫克 我⁻¹氨苄西林。通过PCR和使用引物T7_Forward和T7_Term_Reverse测序筛选氨苄西林耐药转化子的正确插入物（补充表S2）。产生的质粒pEXP5-CT-aadA公司编码完整的AadA序列，后跟C末端连接子和六组氨酸标签（KGHHHHH）。

2.2. 的结构美国国防部点突变

中的八个点突变aadA公司分两步生成。A类cat-sacB电缆-T0盒式磁带（GenBank KM018298）包含猫基因（导致氯霉素耐药性）和枯草芽孢杆菌基因（赋予蔗糖敏感性）插入五个目标密码子（密码子87、112、182、192和205），使用λ-红色重组（Datsenko&Wanner，2000）; 达塔等。，2006年)选择耐氯霉素菌落。在第二步中，将一个中间含有设计突变的70-mer寡核苷酸用于λ-红色转换以替换cat-sacB电缆-T0盒，选择失去sacB公司基因。通过PCR和测序验证了抗蔗糖、氯霉素敏感的转化子aadA公司基因。

2.3. 突变体的Gap修复克隆aadA公司等位基因

转移突变体aadA公司从染色体到pEXP5-CT的等位基因-aadA公司质粒，采用gap-repair克隆策略。pEXP5-CT-aadA公司含有野生型的质粒aadA公司使用StuI和PvuII（Thermo Scientific）将基因线性化aadA公司基因。5 线性化质粒的ng用作PCR反应的模板，使用Phusion DNA聚合酶（Thermo Scientific）和引物aadA_grc-r和aadA_crc-f进行PCR反应（补充表S2）。得到的PCR产物包含整个pEXP5-CT载体序列，其两侧是第一个116 的bpaadA公司基因的一端和最后68个 另一端为bp（因此留下602的间隙 bp英寸aadA公司). 在用DpnI（Thermo Scientific）消化去除任何存活的非线性模板质粒后，PCR片段被转化为带有突变株的菌株aadA公司染色体上的等位基因和λ-从pSIM5-Tet质粒表达的红色重组系统，选择修复pEXP5-CT的氨苄西林耐药细胞-aadA公司通过与染色体重组的质粒aadA公司基因。

2.4. MIC测定（E测试）

使用E试验（bioMérieux）测定链霉素、大观霉素、阿米卡星、妥布霉素、庆大霉素和卡那霉素的最低抑制浓度（MIC）。AadA在富培养基（Koskiniemi）上生长期间不表达等。, 2011)，使用最小培养基进行测试。在37°C的液体M9+0.2%甘油培养基中培养过夜的培养物稀释500倍，并使用无菌棉签将其擦拭到M9+0.2%甘油琼脂平板上。将E测试条应用于平板，平板在37°C下培养约24小时 h.最低抑菌浓度（MIC）被视为最低浓度的抗生素，在最低浓度下，没有可见细菌生长。

2.5. AadA蛋白的表达与纯化

pEXP5-CT型-aadA公司被转化为大肠杆菌BL21星形电池。为了表达天然野生型或突变型AadA蛋白 l在LB中培养100 微克 毫升⁻¹氨苄西林接种10 ml过夜培养并在37°C下培养至OD₆₀₀达到0.6，然后冷却至16°C，然后用1进行诱导 米M（M）异丙基β-D类-24小时的1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG） h.根据标准方案（Van Duyne）表达硒代蛋氨酸取代的AadA等。, 1993). 通过离心法收集细胞，并将其储存在−20°C下。

所有AadA变体均使用相同的方案进行纯化。细胞重新悬浮在缓冲液中A类(50 米M（M）Tris–HCl pH值7.5200 米M（M）氯化钠，50 米M（M）咪唑，5 米M（M） β-巯基乙醇），含有DNase、RNase、溶菌酶和cOmplete蛋白酶抑制剂（罗氏），并使用细胞干扰物（恒定系统）进行裂解。16时在SS34转子中离心后 000 转速 最小值⁻¹对于30 min，将上清液加载到预先平衡的Ni-Sepharose重力柱上，并在4°C下缓慢旋转培养1 h.用缓冲液对色谱柱进行大量清洗A类和带缓冲器A类包含500 米M（M）用缓冲液洗脱NaCl和AadAB类(50 米M（M）Tris–HCl pH 7.5200 米M（M）氯化钠，500 米M（M）咪唑，5 米M（M） β-巯基乙醇）。将含蛋白质组分加载到与缓冲液平衡的HiLoad 16/60 Superdex 75凝胶过滤柱上C(50 米M（M）Tris–HCl pH值7.5200 米M（M）氯化钠，5 米M（M） β-巯基乙醇）。峰分数浓缩至10 毫克 毫升⁻¹直接用于结晶或在液氮中经冲击冷冻后储存于−80°C。

2.6. 结晶

使用坐滴法在8°C下进行结晶。晶体出现于24 h在睡眠屏幕上（分子尺寸），滴大小为2 µl和含有0.12的储层溶液 M（M） 酒精，0.1 M（M）睡眠缓冲系统1 pH 6.5和30%乙二醇/PEG 8000。大多数晶体生长为尺寸约为50×100的薄板 µm，而少数呈细棒状。直接从液滴中捞出板状晶体，并在液氮中玻璃化，以收集数据。

2.7. 数据收集和结构确定

所有数据均在法国格勒诺布尔ESRF的光束线ID14-4上收集。使用硒代蛋氨酸取代的蛋白质晶体通过单波长异常衍射（SAD）定相获得初始相，并在0.9793的峰值波长收集数据 根据荧光扫描测定的浓度。使用以下方法整合和缩放数据XDS公司（卡布施，2010年)和无AIMLESS（Evans&Murshudov，2013年)（表1)并建议每个非对称单元，溶剂含量为51%，马修斯系数为2.53 ų Da公司⁻¹（马修斯，1968年).

使用自动解决方案在中实现菲尼克斯（亚当斯等。, 2010). 优值为0.37（密度修正后为0.72）。带有R（右）_工作和R（右）_自由的分别为0.38和0.40，262个残基中的200个（44个具有未分配序列）是用自动编译在里面菲尼克斯。进一步的手动重建得到了B类-因子图锐化库特（埃姆斯利等。, 2010). 建立了一个由252个氨基酸组成的模型，并将其精炼为R（右）_工作和R（右）_自由的分别为0.29和0.35。答2.5 随后收集了奥特分辨率的本地数据集，从而完成了260个氨基酸和精炼使用菲尼克斯定义（黄嘌呤等。, 2012)到R（右）_工作和R（右）_自由的分别为0.23和0.26（表1). TLS公司精炼在上一轮精细化。原子坐标和结构因子已保存在蛋白质数据库中，并附有登录代码4个cs6.

2.8. 结构分析

详细的结构比较使用SSM公司在里面库特（埃姆斯利等。, 2010)和LSQ公司中的命令O（运行）（琼斯）等。, 1991; Kleywegt&Jones，1997年)，它们也被用作基于结构的序列比对的基础。使用ConSurf公司服务器（Celniker等。, 2013; 阿什肯纳齐等。，2010年). 结构图是使用PyMOL公司（v.1.2r3pre，薛定谔）。使用ClustalW公司（拉金等。, 2007). 这个EsPript公司服务器（Gouet等。, 2003)用于绘制序列比对图。

2.9. 等温滴定法热量测定法（ITC）结合实验

使用MicroCal iTC200仪器（GE Healthcare）在25°C下进行结合研究。野生型或突变型AadA在20–30 µM（M）将浓度透析过夜，对照50 米M（M）Tris–HCl pH值7.5200 米M（M）氯化钠，5 米M（M）氯化镁_2,1 米M（M）三（2-羧乙基）膦并用500–1000滴定 µM（M）每次实验前，将ATP、链霉素（西格玛）或大观霉素（西格马）新鲜溶解在同一批透析缓冲液中。对于在有ATP存在的情况下滴定链霉素/大观霉素，首先用ATP将AadA滴定至饱和，然后在含有与细胞中相同浓度ATP的缓冲液中用链霉素/大观霉素进行第二次滴定。这样就避免了ATP的稀释热。至少36次连续注射2次 在2 最小间隔。使用MicroCal分析插件原产地。假设一组结合位点，对所有ITC数据进行分析。每个实验至少进行两次。对于大观霉素，用于拟合数据的浓度被调整为与AadA结合的估计活性浓度，假设1:1结合。

2.10. SAXS测量和分析

SAXS数据收集在德国汉堡EMBL的PETRA同步加速器的光束线P12上（Blanchet等。, 2015). 对于数据收集，1 毫克 毫升⁻¹对照缓冲液透析AadAC并进一步浓缩至10 毫克 毫升⁻¹。使用鲁道夫研究分析J357折射计测定浓度。

在浓度为1、2、5和10时测量数据 毫克 毫升⁻¹并归一化为透射光束的强度，并减去缓冲器的散射。使用ATSAS公司软件包（Petoukhov等。, 2012). 根据PDB坐标计算理论散射曲线，并将其拟合到5 毫克 毫升⁻¹浓度使用CRYSOL公司（斯维尔贡等。1995年). 这个回转半径使用计算GNOM公司（斯维尔贡，1992年). 以牛血清白蛋白为标准，根据多孔体积估算分子量。

3.1.结构确定AadA的

AadA晶体生长在空间组 P（P）2₁2₁2，衍射到2.5 分辨率（表1). 要执行的试验分子置换使用低序列同一性的搜索模型失败，使用硒代蛋氨酸取代的AadA晶体进行SAD定相求解结构。为了帮助建立模型DALI公司搜索（Holm&Rosenström，2010)使用不完整的自动构建的N-末端域执行。最热门的，r.m.s.d.为2.6 Å超过96摄氏度^α原子，是来自流感嗜血杆菌（PDB条目1个5; 莱曼等。, 2005)被归类为双蛋白核苷酸转移酶的核苷酸结合域。尽管该结构作为分子置换搜索模型并不成功，但其连通性相似，可用于指导人工构建AadA N末端结构域的其余部分。最终的模型包含3–262个残基，只缺少前两个N末端残基和His标签。回路区域97–103和235–240显示出弱密度，表明存在灵活性。

3.2. AadA的总体结构

AadA由两个域组成，这两个域共同形成一个双链55×40×35 结构（图2一). 根据SCOP数据库（Murzin等。1995年)中央五股混合股β-六围一张α-螺旋线。这个β-股β2和β3个是平行的，其他的是反平行的。长α-螺旋线α1,α2,α4和α5个环绕中心β-表，而α3是单圈螺旋线β3和α6是另一个短螺旋β5，然后继续C端子域。C末端结构域（残基158–262）包括五个α-形成上下螺旋α-螺旋束。

图2 (一)AadA的整体结构为彩虹色，从蓝色的N末端到红色的C末端。两个视图相距90°。(b条)AadA和KNTase的叠加（PDB条目1公里; 佩德森等。1995年)基于N端域。KNTase以灰色显示。

3.3. AadA与类似结构的比较

使用DALI公司服务器（Holm&Rosenström，2010). 在一个DALI公司搜索整个AadA分子，最热门的，用Z轴-得分9.5，是来自金黄色葡萄球菌（PDB条目1节; 佩德森等。1995年; 有效值s.d.为4.8 187℃时为^α原子），其显示出与AadA 14%的氨基酸序列同一性。几个假设预测的核苷酸转移酶蛋白也与AadA相似Z轴-得分从8.9到6.7。其中，最相似的是假设蛋白HI0073（PDB条目1个5; 莱曼等。, 2005)，用于指导构建AadA的N末端结构域。林可酰胺核苷酸转移酶LinB来自屎肠球菌（PDB条目3jz0型; 莫拉尔等。, 2009)与AadA的相似性较低Z轴-得分为6.7，r.m.s.d.为5.6 173 C时为^α原子，只有9%的序列一致性。其他可用的ANT结构与AadA的结构相似性较低。属于DALI公司击打，金黄色葡萄球菌KNTase（Chen-Goodspeed）公司等。, 1999; 佩德森等。1995年)和屎肠杆菌LinB（莫拉尔等。, 2009)其生化特征为作用于药物底物上的核苷酸转移酶，其结构可与ATP类似物AMPCPP和药物底物形成络合物。对这两种结构进行了进一步的比较，这两种结构都由N末端核苷酸转移酶结构域和C末端螺旋束结构域组成。然而，这两种蛋白质都以同二聚体的形式结晶，并且这两个结构域之间的取向与AadA中的取向不同。AadA和KNTase之间仔细的逐域叠加显示，在N端结构域螺旋中α1和中央β-板材由β1–βAadA的5与KNTase中的等效二级结构元素很好地重叠（有效值s.d.为1.59 81 C时为^α原子；图2b条)和C端域螺旋α8–α11个AadA叠加在其等效物上（有效值为2.23 57℃时为^α原子；补充图S1）。在AadA与LinB的叠加中，在N-末端结构域螺旋中α1股和股β1–β3来自AadA叠加在LinB上（有效值s.d.为2.05 73℃时为^α原子）和C端畴螺旋α7,α8和α11叠加在LinB上（有效值s.d.为2.02 49℃时为^α原子）。螺旋α2和αAadA N末端结构域中的4在KNTase或LinB结构中没有任何等效物。此外β2和β3，以及β4和β5，AadA与其他两种结构不同。

3.4. AadA的寡聚状态

3.4.2. 溶液中AadA的SAXS研究

为了确认溶液中AadA的寡聚状态，我们对载脂蛋白AadA进行了SAXS实验。在1-5时没有浓度依赖性蛋白质聚集的迹象 毫克 毫升⁻¹浓度。产生的结果吉尼亚阴谋呈线性，与单分散蛋白制剂一致（图3一). 根据SAXS数据计算的分子质量为29 千帕。SAXS实验数据与散射曲线的比较晶体结构（图3b条)用一个χ值为1.9，而KNTase单体和二聚体（PDB入口）的预测散射曲线1节)不合适χ值分别为11.3和35.5。这个回转半径(R（右）_克)根据吉尼亚阴谋当时23岁 奥，这与R（右）_克第页，共20页 根据AadA计算出的Δ晶体结构。因此，SAXS数据证实AadA确实是溶液中的单体晶体结构与解决方案结构非常吻合。

图3 SAXS数据。(一)吉尼亚阴谋显示用于推导的线性拟合R（右）克. (b条)实验数据与PDB条目计算的散射曲线叠加4个cs6（AadA），1节（KNTase二聚体；Pedersen等。1995年)和1节链A类（KNTase单体；Pedersen等。1995年).

3.5. 多序列比对

A类爆炸对UniRef90数据库的搜索确定了肠球菌AadA主要存在于肠杆菌、蛋白杆菌和硬壁菌中。其中一组具有代表性的序列对搜索序列显示了36-81%的序列一致性，用于多序列比对（图4一). 在N末端结构域中，参与疏水包装的残基β-薄片和四个长螺旋都很守恒，螺旋之间的界面也是如此α8,α9和αC末端域中为10。在AadA、Ser36和Asp47的保守残基中β1–β2回路，Asp49英寸β2、Glu87和Thr89英寸β3，Trp112英寸α4、Asp182和Arg192英寸α9和Lys205α9–α10个环暴露在表面并指向畴间空间。

图4 (一)的序列对齐肠球菌AadA与从不同细菌中检索到的一组具有代表性的同源物爆炸搜索（UniProt登录号在括号中给出）：乍得沙门氏菌（F8VG00），斯图亚蒂普罗维登西亚（I0E075），黄色粘球菌（Q1DBM4），大肠杆菌（C4NV14），臭沙雷氏菌（D4E6F0），争论产碱菌（C5CZ95），孟氏假单胞菌（A4XUC2）和粪肠球菌D6（C7UVI9）。严格保守的残基用红色突出显示，保守替代用红色字体。的二级结构肠炎沙门氏菌AadA显示在对齐上方。经过诱变的残基在排列上方用星号表示。(b条)静电表面电位AadA的。光谱范围为深红色（−7千吨)至深蓝色（+7千吨). 方向如图2所示(一). (c（c）)由绘制的曲面保护ConSurf公司（塞尔尼克等。, 2013; 阿什肯纳齐等。, 2010). 光谱范围从品红（最高保守性）到青色（最低保守性”）。方向如图2所示(一).

3.6. AadA的配体结合和催化位点

我们试图将AadA与其底物链霉素或大观霉素以及不可水解的ATP类似物AMPCPP和镁共同结晶并浸泡，但没有成功。AadA的pI为5，静电表面电位表明两个磁畴之间的缝隙显示出强烈的负电荷（图4b条). 使用绘制表面保护图ConSurf公司（阿什肯纳齐等。, 2010; 塞尔尼克等。, 2013)表明这也是AadA序列表现出最高保守性的地方（图4c（c）; 见下文）。负电荷可以模拟氨基糖苷在核糖体中结合的核酸环境（罗曼诺夫斯卡等。, 2013)并且是正电荷药物分子结合所必需的。

3.6.1. 配体结合位点的比较分析

KNTase的结构在卡那霉素A（Pedersen）的存在下得到了解决等。1995年)与克林霉素（莫拉等。, 2009)在这两种情况下都存在AMPCPP和镁，因此可以将这些结构与AadA的apo结构进行比较。在这两种结构中，配体结合在二聚体中一个单体的N末端结构域和第二个单体C末端结构域之间。

在KNTase中，两个亚基的残基构成核苷酸结合位点（图5一). 从一个亚基来看，Ser39和Ser49与γ-AMPCPP、Arg42的磷酸盐与β-AMPCPP的磷酸盐和核糖、Asp50和Glu52与Mg配位²⁺离子和Thr187与β-磷酸盐。从另一个亚单位，Glu145和Lys149形成氢键到α-AMPCPP的磷酸盐。KNTase还可以使用其他核苷酸作为底物，KNTase和碱（Pedersen等。1995年). LinB的核苷酸结合囊与KNTase的非常相似（图5b条)由来自一个亚基的Ser29、Ser39、Asp40、Glu42和Glu89以及来自另一个亚单位（Morar）的Arg165和Arg170组成等。, 2009). KNTase和LinB（Morar）中的磷酸配位丝氨酸残基和镁螯合酸残基等。, 2009; 佩德森等。1995年; 图5一和5b条)在AadA中保守，其中可能具有相同作用的相应残基为Ser36、Ser46、Asp47、Asp49和Glu87（图4c（c）). 除了这些残基，AadA和LinB之间几乎没有序列守恒。因此，仅在AadA和KNTase之间进行了基于结构的序列比对（补充图S3）。

图5 KNTase的核苷酸结合位点(一)、LinB(b条)和AadA(c（c）). 根据基于N端域的叠加，所有图形的方向都相同。镁2+离子显示为绿色球体。答2F类o个负极F类c（c）AadA中Asp47、Asp49、Glu87和Lys205的图谱如所示(c（c）)1的等高线σ(0.23 e（电子） Å−3). KNTase和LinB中的等效残留物如所示(一)和(b条). 卡那霉素和克林霉素的腺苷酸化位点用星号表示。KNTase的两种单体(一)显示为灰色和淡蓝色，以及LinB的两个单体(b条)以鲑鱼和灰色显示。

在KNTase中，来自第二亚单位的Glu145被认为是催化碱（Pedersen等。1995年)，但AadA中没有结构上等效的残留物（补充图S3）。在LinB中，Glu89被提议作为催化碱，并通过诱变证实该残基对催化至关重要（Morar等。, 2009). AadA中的等效残基Glu87是严格保守的（图4一)，使其成为催化碱的良好候选。在KNTase中，这与Glu76相对应，Glu76位于底物卡那霉素附近，但没有明确的作用。然而，在基于N-末端结构域的重叠中，KNTase的Glu145的羧基O原子在2.5–5之间 表明这些残基可能在这些酶中发挥相同的作用，在不同底物的不同位置催化相同的反应。活性位点比较（图5)提示Lys205可能用于与ATP的磷酸盐相互作用。AadA同源物（Thr89、Trp112、Asp182和Arg192）中其余严格保守的暴露残基在KNTase或LinB中不保守。因此，这些残基更有可能负责底物的相互作用和特异性。

在AadA结构中，一些预计参与ATP结合的残基与C末端结构域相互作用：Ser36与Asp206形成氢键，Ser46与Lys43的氨基形成氢键；Asp47和Asp49与Lys205形成盐桥。因此，在apo-AadA结构中观察到的构象中，核苷酸结合位点被域间相互作用阻断。

3.6.2.体外使用ITC的配体结合研究

为了测试ATP和氨基糖苷配体对AadA的结合亲和力，进行了ITC实验（表3）。我们观察到ATP与野生型AadA结合时K（K）_d日第页，共13页 µM（M）（图6一)而非水解ATP类似物AMPCPP未表现出任何可检测的结合。这表明，与KNTase和LinB的观测结果相反，与O原子的相互作用将α-和β-ATP的磷酸盐可能对AadA中的ATP结合至关重要。在缺乏ATP的情况下，链霉素和大观霉素未显示与AadA的可检测结合（数据未显示）。在存在ATP的情况下，链霉素和大观霉素都与AadA结合，估计K（K）_d日第页，共0.5页 µM（M）（图6b条和6c（c）). ATP和链霉素以大约1:1的化学计量比与AadA结合。而大观霉素的效价为603 微克 毫克⁻¹（根据细菌生长试验估计），大观霉素ITC数据的拟合表明，其与AadA结合的活性仅为假定活性浓度的31%。数据只表明了一种类型的结合位点，并且没有迹象表明AadA或任何相关的腺苷酸转移酶与每种酶的一个ATP和一个腺苷酸底物具有不同的化学计量。因此，根据粉末的干重将大观霉素浓度调整为31%，以符合数据，从而得出N个值为1。对于为什么只有大约一半的强大的大观霉素分子与AadA结合，我们没有明确的化学解释，但它可能与药物在水溶液中的羰基-二醇平衡有关（Bryskier，2005).

图6 滴定的ITC曲线(一)ATP、(b条)链霉素和(c（c）)大观霉素与野生型AadA。顶部面板显示原始数据，底部面板显示结合等温线。

这些结果表明，ATP和镁在AadA的两个结构域之间的结合将使两个结构区定向，从而使氨基糖苷底物与亚单位间的口袋结合，而在AadB的两个功能域之间的O原子将定向于氨基糖苷基底物与子单位间口袋的结合α-和β-磷酸盐与AadA形成关键的相互作用。因此，AadA在氨基糖苷底物之前结合ATP，而KNTase则相反，其中卡那霉素首先与亲和力较低的非特异性结合位点结合，然后在存在核苷酸时重新定位到最后的结合间隙（Matesanz等。, 2012). 这也与二聚体apo-KNTase结构中预先形成的ATP-结合位点和当前apo-AadA结构的封闭ATP-连接位点相一致。最有可能的是，ATP结合将诱导结构的开放构象，其中来自两个域的残基被正确定位以进行底物识别。

3.7. AadA的突变研究

为了验证我们关于保守氨基酸Glu87、Trp112、Asp182、Arg192和Lys205在配体结合和催化中的作用的假设，我们通过突变染色体产生了以下AadA突变体aadA公司基因：E87A、E87Q、W112A、W112F、D182A、D182N、R192A和K205A。