2.1、。总结

对于一种被称为目标结构的待测大分子结构，我们首先进行了美国金融服务贸易协会搜索（Pearson&Lipman，1988)对于每个多肽链建模师（Šali和Blundell，1993年). 与目标结构具有较高序列一致性、长度较长且分辨率较高的模板更可取（补充表S2）。在此选择的模板上构建了五个候选同源结构，其中离散优化蛋白质能量（DOPE）得分最低的模板（Shen&Sali，2006)被选为该链的参考模型。不同链的参考模型可以从不同来源生成，并采用任何相对位置和方向，包括重叠。在目标结构中的所有或大多数链（对于多链系统）都构建了参考模型后，每个参考模型的位置和方向由以下公式确定分子置换使用相位器（麦考伊等。, 2007)，并将生成的坐标合并到PDB格式的单个坐标文件中，作为整个分子的唯一参考结构。DCN在定义可变形角网络和弹性网络时排除了链间相互作用。DCN模型和相应的约束是根据角网络三元组和弹性网络对的预设标准自动生成的。这些约束促成了下文所述总目标函数中的术语。

这个精炼目标函数采用以下形式

在这里，E类_立体声是通常的立体化学能E类_经验是实验衍射数据的贡献w个_一是重量。通常，基于振幅最大似然函数（MLF）用于E类_经验在实验阶段信息可用的情况下精炼使用最大似然Hendrickson–Lattman（MLHL）目标函数，其中实验阶段的贡献以Hendricgson–Latt man系数的形式并入（Hendriccson&Lattman，1970).w个_DCN公司，的重量E类_DCN公司，由特定的三维网格搜索方法确定（图1). 上学期，E类_DCN公司，是由于目标结构中选定的原子对和三元组偏离其相应的平衡值而产生的谐波能量。这些值是从当前目标结构和参考结构中得出的。模拟退火被用作精炼协议，起始温度为3000 K，冷却速度为50 K/步。扭转角度分子动力学用于动力学仿真。精炼对于每个参数组，使用不同的随机种子重复十次，以进行初始速度分配和DCN约束选择。

图1 优化参数组的三维网格搜索(γ,w个DCN公司,μ). 搜索超过180个网格点：（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1）γ，（3、10、30、100、300）用于w个DCN公司和（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1）μ。提供最低服务的特定集合R（右）自由的因为最终的结构是最优的，并保留相应的结构以供后续分析。

2.2. DEN模型简介

可变形弹性网络（DEN；Schröder等。, 2007, 2010)是一组随机选择的原子对，受到谐波势的影响

求和覆盖约束列表中的所有原子对。术语d日_我是瞬时距离我目标结构中的第对。这个平衡距离 d日_我⁰(γ,n个)与参考结构和目标结构都相关。在这里，n个表示精炼步骤和γ是在三维网格搜索过程中确定的常数（图1).

2.3. DAN和DCN模型简介

为了定义DCN精炼方法中，我们首先引入了可变形角度网络（DAN）模型。DAN模型由一系列角度组成，每个角度由原子三重态中的两个键跨越。三个原子，其中一个被指定为顶点，另两个被指定为尾原子，必须存在于参考结构和目标结构中。它们还需要满足以下附加标准：（i）所有三个原子都应位于同一多肽链内，（ii）三联体中的第一个和最后一个原子应位于与中间顶点原子的截止距离内，通常设置为15 与DEN中相同，（iii）顶点原子和尾部原子之间的距离不应超过10个残基，（iv）跨越的顶点角应在60°到120°之间。最终角度限制精炼从候选名单中随机选择，限制数量设置为目标结构中原子总数的倍数（在我们的研究中为1）。所有这些参数，包括截止值、残留物分离、角度范围和限制数倍数，都设计为可定制并允许微调。我们还提供了两种模式（定向模式和任意模式）来构建约束列表（图2).

图2 DAN/DCN的两种模式的图示。(一)定向模式（D模式）。顶点原子的原子序列号的值总是小于两个尾部原子的值。例如，对于三元组3–4–5，在定向模式下，唯一可以选择的角度是∠435，其中原子3是顶点。因此，对于给定的原子三重态，可以限制的角度不超过一个，而定向模式往往会“扩散”到整个结构上，导致最终的DAN限制列表中包含更多的原子。(b条)任意模式（A模式）。拾取原子三重态后，对角度选择没有限制。对于三元组3–4–5，除了方向模式可以瞄准的∠435外，任意模式还允许角，例如∠354，其中原子5是顶点，∠345，其中原子4是顶点。任意模式包括结构中存在的所有可能角度。如果DAN的截止标准足够灵活，则同一三元组内的两个或三个角度可能是选择最终约束的合格候选。因此，在任意模式下，可以首先瞄准定向模式排除的角度，但可能会产生较少的原子多样性。生成的DAN约束文件按顶点-第一个尾巴-第二个尾巴的顺序列出了三元组。对于这两种模式，第一个尾部的原子序列号根据定义低于第二个，以避免重复。

DAN中的谐波弯曲能量定义为

这里，求和取所有角度三元组，θ_j个是瞬时角度j个目标结构中的第三个三元组和θ_j个⁰(μ,n个)是特定情况下对应的平衡角(n个第个）精炼步骤。

结合DEN和DAN建立DCN。应该注意的是，DEN和DAN的参考结构可以独立建立，例如从不同的同源模型。这些约束被视为用于总计的统一DCN约束精炼目标函数。

DCN电位是DEN的谐波拉伸能与DAN的谐波弯曲能之和，

我们设置系数k个至0.01，角度单位为度。

我们更新了d日_我⁰和θ_j个⁰模拟退火中每六个扭角分子动力学（MD）步骤（当温度也下降50 K） 根据以下方程式：

下一步中距离和角度的平衡值，d日_我⁰(γ,n个+1）和θ_j个⁰(μ,n个+1）是其当前平衡值的函数，d日_我⁰(γ,n个)和θ_j个⁰(μ,n个)，它们的实际瞬时值，d日_我和θ_j个，以及参考模型中等效三元组和对的值，d日_我^裁判和θ_j个^裁判通常，原子对的初始平衡值d日_我⁰(γ，0）和三联体θ_j个⁰(μ，0）在起始结构中设置为这些值。系数κ和φ是控制连续平衡之间变化速率的权重。对于初始松弛，κ和φ在前三个宏循环期间设置为0（细化协议）。之后，κ和φ设置为固定值0.1。的值γ和μ与DCN电位的权重一起优化w个_DCN公司(1), 通过三维网格搜索（图1). 的值w个_DCN公司在最后两个宏循环中重置为0，以减少目标函数最小值的偏差。

2.4. 一种优化参数集的三维网格搜索方案(γ,w个_DCN公司,μ)

参数集(γ,w个_DCN公司,μ)已优化通过通过180个网格点进行三维网格搜索：（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1）forγ，（3、10、30、100、300）用于w个_DCN公司和（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1）μ（图1)在每一点上，用不同的随机种子进行十次精炼，结果最低R（右）_自由的表示该网格点的最终优化结构。种子控制了原子动力学模拟中初始速度的分配，以及从成对和三重态池中选择DCN约束。应该注意的是，最终精炼结果取决于随机数种子的选择；因此，为了确保一致性，我们在整个工作中使用了从1到10的精确整数作为十个随机种子。

2.5.精炼协议

扭转角度分子动力学（TAMD；Rice&Brünger，1994年)结合传统模拟退火（柯克帕特里克等。, 1983)被用作主要精炼协议（Schröder等。, 2010). 动力学仿真的时间步长为4 财政司司长。对于退火过程，初始温度设置为3000 K、 下降速度为50 每六个TAMD步骤K。每六个TAMD步骤可以定义为一个“微循环”，它决定了退火温度和DCN约束平衡值的更新频率。温度从3000降至0的时期 K形成了一个“大循环”。每个精炼这项工作中的任务，包括常规精细化，兽穴精炼和DCN精细化，使用了八个宏循环。在它们的前三个期间，φ和κ设置为零而不是0.1以允许初始松弛。在几个初始宏循环期间，范德瓦尔斯半径减小至原始值的75%，同时减小范德瓦尔力常数以便于取样，随后在最后两个宏循环中完全恢复。此外，在最后两个宏循环中，DCN约束权重被设置为零，以减少目标函数全局最小值的偏差。

总体各向异性B类-因子修正和体积-固体修正（Jiang&Brünger，1994）; 布伦格尔等。, 1998)应用于所有优化，没有使用位置最小化。对于16个重新定义任务，50个步骤B类-因子最小化，目标增加10倍σ的值B类-进行因子主链/侧链键/角度约束，初始值为B类因子重置为50 Ų。默认情况下无法识别的配体中枢神经系统（布伦格尔等。, 1998; Brunger，2007年)被明确定义为组的组B类-因素最小化。为了进行适当的比较精炼所有测试系统的参数设置保持一致。需要注意的是，某些参数，例如初始退火温度、冷却速度或目标的倍数σ组的值B类因素，也可能进一步优化精细化。完成后精细化，所有精细结构都根据它们的值进行排序R（右）_自由的并且选择具有最低值的进行后续分析。

2.6. 计算

此方法的源代码(DCN_参考)是在结晶和核磁共振系统(中枢神经系统; v.1.3；Brunger，2007年; 布伦格尔等。, 1998). 计算在莱斯的共享大学网格上进行(SUG@R（右）)共享计算资源（ShareCoRe）的集群平台。

3.1.精炼烟草PR-5d蛋白（PDB条目1安)以三个较低的分辨率

在这个测试中，我们使用了晶体结构烟草PR-5d蛋白（PDB条目1安, 1.8 分辨率；科瓦等。, 1999)以便对DCN方法进行系统评估。它的完整衍射数据是从PDB获得的，然后使用中央处理器4（优胜者等。2011年)给出三个分辨率较低的集，分别为3.5、4.0和4.5 Å. 这三组数据被视为独立的原始低分辨率实验数据，用于后续研究精细化。同源模型（PDB条目1立方英尺; 2.3 分辨率；分钟等。, 2004)用作起始结构，其位置和方向由分子置换使用相位器（麦考伊等。, 2007)针对三个低分辨率数据集中的每一个。来自分子置换作为DCN细化的参考结构。

为了评估DCN方法的性能，我们还对这三个低分辨率数据集进行了另外两个改进。其中一个使用了结合立体化学势的传统靶函数（Engh&Huber，1991)实验数据项（形式为最大似然能量；Bricogne&Gilmore，1990年). 另一种方法除了使用DEN势外，还使用了传统的目标函数。

依据R（右）_自由的值，用于测量结构模型和X射线衍射数据之间的一致性（图3一)与DEN方法相比，DCN方法取得了实质性改进：DCN改进的结构模型分别降低了0.94和1.12%R（右）_自由的比DEN在3.5和4.0时精炼的 分别为？分辨率。4.5时 分辨率，DCN和DEN细化的结构模型具有相似性R（右）_自由的值（DCN精细结构的值比DEN结构的值高0.24%）。与传统方法细化的结构相比，DCN细化的结构在R（右）_自由的在3.5、4.0和4.5时分别减少2.21、6.85和13.16% 分别为？分辨率（表1，图3一).

图3 烟草PR-5d蛋白在三种不同的低分辨率下的精制。比较R（右）自由的(一)，r.m.s.d(b条)，GDT（<1 Å) (c（c）)和TMscore(d日)使用传统的精炼（绿色）、DEN方法（蓝色）和DCN方法（红色）。

除了R（右）_自由的值，使用1.8 奥数分辨率晶体结构 1安作为“真正的答案”，可以使用其他标准来评估精细结构的质量，包括全原子r.m.s.d.、GDT（<1 欧）分数（Zemla，2003)和TMscore（Zhang&Skolnick，2004）). 根据r.m.s.d.（图3b条，表1)在所有三种分辨率下，DCN始终优于DEN。对于GDT（<1 ？）得分（图3c（c），表1)和TMscore（图3d日，表1)，DCN在所有三家公司中始终提供了最有利的价值精炼方法。需要注意的是，一般来说，DCN提供的最大改进是在最低分辨率（4.5 Å); 因此，DCN有望在以下方面表现最佳精炼分辨率极限为4.0的X射线数据 ？或更低（表1).

3.2. 16个随机选择的低分辨率结构的重新定义

我们还随机选择了16种低分辨率全原子结构（4.0–4.51 ？分辨率，1–14条多肽链，304–10 941个观察到的残留物；补充表S1和S2）并进行了重新定义。对于某些结构，非标准配体、离子和修饰残基的拓扑和参数文件来自瑞典乌普萨拉异化合物信息中心（HIC-Up；Kleywegt&Jones，1998）). 为了测试DCN的性能，我们在没有任何手动调整的情况下进行了自动重定义。为了最小化偏差，我们在总共八个DCN电位中的最后两个将其重置为零精炼大环（参见§2). 作为对照，在DEN和16次重新定义的每一次常规改进中使用了相同的协议和设置。与之前的工作相比，它们通常会在本工作中产生更好的结构模型（补充表S3）。这些重新定义是评估新DCN方法性能的基础。

3.2.1. 这个R（右）_自由的值

R（右）_自由的（布伦格，1992年)作为实验数据与精细结构之间拟合的交叉验证参数，被广泛用作大分子晶体学中结构质量的主要衡量指标。在我们对16个随机选择的低分辨率结构进行的测试中R（右）_自由的DCN获得的数值大大低于使用独立DEN方法获得的数值（范围在0.15–1.95%之间），高于使用传统方法获得的值（0.41–6.75%）（表2，图4一).

表2 三种方法重新定义16个低分辨率结构的比较 精炼16个低分辨率结构的结果。R（右）自由的及其改进，R（右）自由的负极R（右）工作，以及Ramachandran的统计数据。据统计，在总共16个测试系统中，DCN在以下方面的16个案例（100%）优于DENR（右）自由的，16（100%）关于R（右）自由的负极R（右）工作拉马钱德兰统计数字为13（81.25%）。与常规精炼相比，这些比率分别为100、87.5和93.75%。补充表S1和S2中列出了每个测试系统的结构特性、实验数据和参考模型。     R（右）自由的(%) DCN改善（%） R（右）自由的负极R（右）工作(%) Ramachandran统计 PDB代码 分辨率（Ω） 常规 兽穴 DCN公司 ΔR（右）自由的超过常规 ΔR（右）自由的超过DEN 常规 兽穴 DCN公司 常规 兽穴 分布式控制网络 DCN–传统 DCN−DEN公司 1个isr 4 22.37 21.64 21.10 1.27 0.54 6.6 6.4 6.1 0.833 0.863 0.878 0.045 0.015 1jl4公司 4.30 37 36.39 35.25 1.75 1.14 10.9 11.5 11.1 0.567 0.712 0.718 0.151 0.006 1r5单位 4.50 31.65 30.48 29.83 1.82 0.65 5.6 5.2 4.8 0.646 0.730 0.748 0.102 0.018 1xxi个 4.10 38.21 32.24 31.46 6.75 0.78 11.2 9.9 9.4 0.631 0.806 0.800 0.169 −0.006 1是1 4.50 33.77 30.24 29.36 4.41 0.88 13.8 13.1 12.5 0.781 0.853 0.905 0.124 0.052 1个月7 4.50 27.64 27.39 27.23 0.41 0.16 3 3.4 3.3 0.703 0.781 0.751 0.048 −0.030 2a62页 4.50 36.22 35.48 33.53 2.69 1.95 9.6 8.6 6.9 0.568 0.651 0.670 0.102 0.019 2bf1型 4 48.66 44.31 42.66 6 1.65 8.6 5 4 0.383 0.453 0.523 0.140 0.070 第二章37 4.15 36.46 33.20 32.57 3.89 0.63 3.7 1.2 0.3 0.737 0.851 0.848 0.111 −0.003 第2季度第7季度 4 26.49 26.21 26.06 0.43 0.15 2.1 1.9 1.8 0.774 0.768 0.770 −0.004 0.002 2qag型 4 40.52 38.81 38.52 2 0.29 3 2.2 2 0.483 0.551 0.573 0.090 0.022 2伏赫兹 4 31.17 29.88 29.64 1.53 0.24 8.1 8.1 8 0.723 0.822 0.830 0.107 0.008 2年 4 37.34 35.73 34.42 2.92 1.31 9.5 8.6 8.2 0.728 0.746 0.836 0.108 0.090 3alz公司 4.51 25.01 24.61 23.67 1.34 0.94 1.9 1.6 0.9 0.667 0.712 0.721 0.054 0.009 3个保险丝 4 41.87 40.57 40.07 1.80 0.50 5.9 4.4 3.9 0.537 0.563 0.576 0.039 0.013 3我们2 4.20 45.97 43.11 42.39 3.58 0.72 12.9 10.9 9.8 0.399 0.543 0.555 0.156 0.012 平均 4.20 35.02 33.14 32.36 2.66 0.78 7.3 6.4 5.8 0.635 0.713 0.731 0.096 0.019 最小值 4 22.37 21.64 21.10 0.41 0.15 1.9 1.2 0.3 0.383 0.453 0.523 −0.004 −0.030 最大值 4.51 48.66 44.31 42.66 6.75 1.95 13.8 13.1 12.5 0.833 0.863 0.905 0.169 0.090

图4 16个随机选择的低分辨率结构的优化。的绘图R（右）自由的(一),R（右）自由的负极R（右）工作(b条)和拉马钱德兰统计(c（c）)显示了16个由传统测试系统改进的测试系统精炼（绿色）、DEN方法（蓝色）和DCN方法（红色）。

3.2.4. 电子密度图

DCN方法的重新定义也导致了电子密度图的改进（图5). 相结合的σ-加权2F类_o个负极F类_c（c）根据实验振幅和模型相位计算的电子密度图如图5所示两个示例：PDB条目1jl4公司（图5一, 5b条和5c（c）)和2bf1型（图5d日, 5e（电子）和5（f）). 在PDB条目示例中1jl4公司，的σ-加权2F类_o个负极F类_c（c）由传统方法改进的结构模型得到的电子密度图（图5一)或DEN方法（图5b条)两者在Thr23的主链原子周围都显示出断裂密度。与此形成鲜明对比的是，通过DCN方法细化的结构模型图在Thr23附近具有清晰的密度（图5c（c）). 在第二个示例中，PDB条目2bf1型，书房精炼导致了R（右）_自由的该值比传统方法的值低4.35%，并且DEN重新定义的结构相对于传统方法优化的结构在主链原子上的几个位置显示出较大的位置偏移。然而，有些区域的大结构位移不受电子密度图的支持（比较图5d日和图5e（电子）). 与此形成鲜明对比的是，DCN改进了结构R（右）_自由的与DEN方法相比（1.65%），显示出更好的地图坐标一致性（图5（f）).

图5 不同方法细化的结构及其相应相组合的比较σ-加权2F类o个负极F类c（c）电子密度图。(一,b条,c（c）)PDB条目1jl4公司, (d日,e（电子）,（f）)PDB条目2bf1型.精细结构（棒模型）和相应的相结合σ-加权2F类o个负极F类c（c）电子密度图（网格）轮廓为1.5σ显示为传统精炼（绿色）、DEN方法（蓝色）和DCN方法（红色）。