2.1. 克隆、表达和纯化

包含密码优化DNA序列的合成基因（GenScript）（根据制造商的协议）用于所有人类GemC1（UniProt ID A6NCL1）构建物。将GemC1、tGemC1（64–146）、dGemCI（29–240）、GemC1_C-ter（241–334）和全长GemC1的结构克隆到pETNKI-His-3CLIC-kan载体（Luna-Vargas）中等。, 2011)用一个可拆的他的标签表达。Geminin、全长Geminin，dGeminin（29–209）和tGeminin等。, 2013; 达·马可等。, 2009)。为了表达tGemC1–tGeminin异二聚体，我们使用了上述tGemCI结构和我们之前描述的tGemini结构（Caillat等。, 2013)并将其插入pET-22b（Novagen）载体中，以便在没有标签的情况下进行表达。由于这两种质粒分别对卡那霉素和氨苄西林耐药，因此可以进行有效的共表达实验。GemC1、L123E和L130E（tGemC1）的两个突变^L123130E型)使用QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene）生成。所有复合物均通过IMAC和尺寸排除色谱法在50个缓冲区中 米M（M）HEPES–NaOH pH 7.5，150 米M（M）氯化钠，0.5 米M（M）TCEP；Caillat中提供了详细的协议等。(2013)和德马科等。(2009)。我们注意到异二聚体是用GemC1或Idas上的标签纯化的；由于未标记的双核蛋白是我们实验中表达量较高的蛋白质，因此对含量较低的蛋白质进行纯化实际上可以确保异二聚体的纯化。所有蛋白质通过以下方法进一步纯化尺寸排除色谱法最终产品通过考马斯亮蓝染色聚丙烯酰胺凝胶进行检测电泳确认约化学计量量的络合物是最终纯化产物。

2.2。多角度激光散射

多角度激光器光散射（MALLS）实验在一个附在一个Bai KTA FPLC上的Superdex 75 HR 10/30柱上进行，并与一个miniDAWN光散射检测器（Wyatt Technology）和一个Dn-1000差分折射率index检测器（WGE Dr Bures）耦合。100 µl纯度为～2.0的tGemC1二聚体 毫克 毫升⁻¹被注射到柱子上。数据分析采用ASTRA公司使用天n个/天c值为0.185。尺寸排除色谱法tGemC1–tGeminin的运行是在附在一个KTApurifier上的Superdex 75 HR 10/30色谱柱中进行的。

2.3. 哺乳动物细胞培养、转染和免疫沉淀

将HA标记的GemC1、Geminin-GFP、Geminin（1-72）-GFP、Idas GFP和Cdt1 GFP克隆到pcDNA3.1中，用于在哺乳动物细胞中表达。U2OS细胞在含有10%胎牛血清的DMEM（Invitrogen）中培养。根据制造商的说明，使用TurboFect转染试剂（发酵剂）转染细胞。U2OS细胞转染GEMC1-HA和指示的其他构建物，收集24个 转染后h。使用抗HA抗体（12CA5，Santa Cruz）进行GEMC1-HA的免疫沉淀，如Pefani所述等。(2011)。使用抗HA（分子探针）、抗GFP和抗Geminin（Xouri等。, 2004; 伊利欧等。, 2013)抗体。

2.4。T型_米基于色氨酸荧光的测定（OPTIM 1000）

在25 米M（M）HEPES–NaOH pH 7.5，150 米M（M）氯化钠，0.5 米M（M）浓度为1的三（2-羧乙基）膦 毫克 毫升⁻¹使用Avacta的OPTIM 1000。

重心平均荧光根据

哪里λ_{十亿立方米}是重心平均值，λ是波长，F类_λ是波长下的荧光强度λ,米= 300 nm和n个= 450 纳米。

还记录了样品的静态光散射信号，以检测是否存在骨料。

2.5. 螺旋线圈稳定性分析圆二色性（CD）

在J-810分光偏振仪（Jasco）上进行了Far-UV CD实验，该仪器带有珀尔贴温控元件（Jasco.）。CD数据以220的固定波长记录 nm，线性温度梯度为10至90°C。所有样品的浓度均调整至～0.3 毫克 毫升⁻¹。实验完成后，未观察到可见沉淀。使用Greenfield（2006）中描述的公式进行数据分析)在中实施GraphPad棱镜作者的观点。

2.6. 结晶

使用之前描述的程序进行筛选（Newman等。, 2005)96 W坐式蒸汽扩散板（瑞士制造的MRC 2孔结晶板）。优化后，用于衍射研究的晶体在4°C下生长，混合200 挪威10 毫克 毫升⁻¹t宝石C1^L123130E型带200 数值0.1 M（M）HEPES缓冲液pH 7.5，7%乙醇，10%2-甲基-2,4-戊二醇（MPD），0.01 M（M）乙二胺四乙酸二钠盐二水合物。将晶体浸泡在补充了MPD的储液溶液中，使最终浓度达到32%(w个/v（v）)并通过注入液氮进行玻璃化。

2.7. 数据收集、结构解决和细化

在0.8726波长的ESRF光束线ID23-2上收集衍射数据 Å. 使用XDS公司一揽子计划（Kabsch，2010年)。该结构由分子置换具有相位器（麦考伊，2007年)使用二聚双核蛋白的多胺模型（PDB入口2瓦阀; 达·马可等。, 2009)作为搜索模型。tGemC1的一个同源二聚体^L123130E型在每个非对称单元的对2₁2₁2₁ 单位单元格。该模型在分子重定位溶液生成的图中重建，使用ARP协议/弯曲（兰格等。, 2008)并在中手动调整库特（埃姆斯利等。, 2010).精炼使用执行菲尼克斯定义（黄嘌呤等。, 2012)在后期使用PDB_REDO公司web服务器（Joosten等。2014年)合并REFMAC公司（穆尔舒多夫等。, 2011)。数据简化和结构统计精炼如表1所示.

3.1. GemC1螺旋线圈的结构

全长GemC1（1–334）和包含“长”预测螺旋结构域（29–208；dGemC1）的扩展构建的表达试验产生了不溶性蛋白质。结构体的表达略长于预测的线圈结构域（64–146；tGemC1），导致蛋白质在浓度低于1时可溶 µM（M）。多个标签（GST、SUMO和触发因子）没有改善溶解度。通过检查GemC1线圈-线圈同二聚体的螺旋轮预测图，我们发现一些疏水残基不在核心界面（寄存器位置一和天)而是暴露在溶剂中。特别是，在螺旋线圈的C端，残基Leu119、Val120、Leu123、Ala127、Leu130和Leu131构成疏水性斑块。我们假设这种疏水性斑块可能导致GemC1蛋白聚集。因此，我们决定将残基Leu123和Leu130突变为谷氨酸盐以增加溶解度。应该注意的是，一些预测将这些残留物放在天螺旋线圈的位置；然而，这些预测假设113-114区域的卷曲线圈不规则，根据Geminin和Idas同源卷曲线圈的结构，这是不可能的。我们的突变产生了tGemC1结构^L123130E型高可溶性蛋白（>2 米M（M）)。该蛋白在尺寸排除色谱法耦合到多角度激光器光散射（MALLS）实验（图1一).

图1 GemC1二聚体的结构。(一)尺寸排除色谱法tGemC1同二聚体的多角度激光散射测量。单位体积的平均分子量（红线）和归一化UV280 纳米图中显示了洗脱曲线（蓝线）。二聚体的理论分子量用灰色虚线表示。图表代表了至少两个实验。(b条,c（c）)该结构显示为一幅橙色卡通，其中包含一个厚胶带模型，用于跨越正式螺旋线圈的区域，而不符合螺旋线圈形式的区域则显示为一条薄带状。(b条)和(c（c）)沿水平观察轴相互旋转90°。在一和天位置显示为棍子（氧气，红色；氮气，蓝色）。Lys97并没有形成“旋钮-孔”的相互作用，它被描绘成带有绿色C原子的棒子。L123E和L130E可溶性增强突变体朝向C末端的位置也显示为带有浅蓝色C原子的棒状物。

t宝石C1^L123130E型（从这里开始，为了简单起见，我们将此构造称为tGemC1）结晶，结构确定为2.2 Å分辨率并细化为R（右）_自由的24.9%，具有良好的几何形状（表1)。该结构显示出典型的二聚体平行卷曲-卷曲同型二聚体（图1b条和1c（c）)，有两个α-聚集在一起形成左手超螺旋的螺旋线。这两条链在C端约有20个无序残基，在N端约有5个无序残留，因为在每条链中，只有残基69–132和69–129的电子密度能够很好地分解。残留物71–129和70–124在α-每条链的螺旋构象。两个突变的亮氨酸残基确实指向溶剂，正如我们的序列分析所预期的那样，与上面讨论的其他预测相反。虽然我们不能正式排除我们的突变改变了螺旋线圈，但这是不太可能的，因为我们观察到规则的螺旋，螺旋线圈停在与双核蛋白同源结构（PDB入口）大致相同的位置1个uii; 塞鲍特等。, 2004)和Geminin–Idas（PDB条目4bry公司; 卡亚等。, 2013)螺旋线圈。根据我们的结构数据，我们得出结论，将暴露于疏水性溶剂中的Leu123和Leu130转变为亲水性谷氨酸残基，可以在不影响整体结构的情况下提高溶解度。

使用插座软件（Walshaw&Woolfson，2001)结果表明，线圈-线圈区域从残基73延伸到115，跨越六个七肽（从技术上讲，存在七个七肽的一个残基）。就位天₄，Lys97不会形成“旋钮-孔”相互作用，在螺旋线圈长度上的一系列相互作用中形成微小但具有特征性的不规则性（图1c（c）).

杰米宁卷曲螺旋同源二聚体的结构以及杰米宁-Idas卷曲螺旋异二聚体的结构先前已经确定（Thépaut等。, 2004; 卡亚等。, 2013)。将这些结构与tGemC1同源二聚体的结构进行比较（图2)显示了几个有趣的功能。首先，所有三个结构都由长度相似的螺旋线圈组成，Geminin有一个更长的螺旋线圈（六个全七肽，四个残基N末端延伸和一个残基C末端延伸）Idas–Geminin是一个较短的卷曲线圈（五个七肽核，两个N端和C端侧翼区域各有四个残基）；GemC1长度适中。用程序分析线圈参数CCCP公司（Grigoryan&Degrado，2011年)显示GemC1螺旋线圈具有ω₀每个残基的角度为−4.1°，表明与Geminin同源二聚体相比，左手超螺旋相对紧密(ω₀=−3.9°/残留物）和Idas–Geminin(ω₀=−3.7°/残渣）。GemC1的超螺旋半径（从超螺旋轴到链条螺旋轴的距离）在5.1处更长 奥比4.7 对于Geminin和Idas–Geminin，均为“o”。埋在GemC1（1370）界面的表面 Ų)略低于Idas–Geminin（1463） Ų)和Geminin–Geminin（1572年 Ų).

图2 比较GemC1二聚体（橙色）、Geminin二聚物（绿色）和Idas–Geminin异二聚体的结构（蓝色和绿色）。使用RAPIDO公司服务器。我们在这里提出的最佳对准使用链中单体的卷绕-线圈区域A类.卡通表示如图1所示图中还显示了三个二聚体的序列比对，线圈区域中的残基为粗体大写字母，残基为α-螺旋构象为大写字母，螺旋外的残基为小写字母。

与Geminin和Geminin–Idas类似，GemC1在一和天寄存器位置：天₁,天₂,一₁,天₄和一₆此外，GemC1在位置处有非常罕见的半胱氨酸残基一₁（Geminin和Idas中的丙氨酸）。位置上的残留物天₁是GemC1中带负电的Glu76，后面是Glu77；这与Geminin中的Arg106和Arg107残基的正电荷对以及Idas中的Asn189和Gln190极性对截然相反（图3一)。GemC1中的Glu76与来自GemC1第二单体的Glu77产生静电排斥，导致线圈的两个螺旋比其他结构中的螺旋相距更远。就位天₂，GemC1在其他两个结构中用Gln代替Ala。该Gln83参与了一个非对称的侧链相互作用网络，该网络还涉及位置上保守的Asn87一₁位置上的Lys97残基天₄，在Geminin和Idas中完全保守，在位置上与Glu98相互作用e（电子）₄相对链条的；在Geminin和Idas结构中，这是Asp128（图3b条)。显然，保持与较长Glu98的氢键相互作用使GemC1中Lys97的构象更为延伸，这与螺旋线圈的“旋钮-孔”几何结构的定义不相容（见上文），但仍保持单体之间的氢键交互作用，这表明这种残留物对线圈的形成并不重要，而缺乏“旋钮-孔”结构是一种异常现象，不是GemC1线圈的一个决定性特征。最后，Asn108就位一₆在家族中是保守的，参与两个链之间稳定的氢键。

图3 不同的异常残留物天1(一)和天4(b条)GemC1、Geminin和Idas–Geminin的位置。表示和着色如图1所示和2.

3.2. GemC1和Geminin通过线圈域相互作用

我们之前已经证明，与同二聚体相比，Idas更喜欢与双核蛋白相互作用并形成异二聚体（Caillat等。, 2013; 佩法尼等。, 2011)。为了确定GemC1是否也是如此，我们首先共同表达His标记的GemC1和Geminin，并能够纯化这两种蛋白质之间的化学计量复合物（图4一)。这也是值得注意的，因为GemC1在我们的表达试验中从未溶解。此外，Geminin（tGeminin）的螺旋线圈足以溶解GemC1（tGemC1）和较长dGemC1的螺旋线圈结构域，但不足以溶解全长GemC1。这些结果表明，GemC1和Geminin通过它们的线圈域相互作用，但可能有更广泛的相互作用，因为全长GemC1需要全长Geminin来稳定。值得注意的是，即使GemC1在细胞裂解物中比Geminin更丰富，通过GemC1上的His标签进行纯化，也会在GemC1和Geminin之间形成约1:1的化学计量络合物（图4一)表明至少在这些特定条件下，GemC1–Geminin复合体是首选。最后，tGemC1–tGeminin复合物的表达和纯化（由IMAC在GemC1上的His标签上单独表达）产生了一个复合物，随后在尺寸排除色谱法柱（图4b条)，保留体积与tGemC1–tGemC1-同二聚体的保留体积直接相当（图1一)表明tGemC1和tGeminin折叠为稳定的化学计量异二聚体。

图4 GemC1与Geminin异二聚。(一)His标记的dGemC1（29-240）和未标记的dGeminin（29-209）在大肠杆菌GemC1是总细胞裂解物（lane T）和上清液（lane S）中最好的过表达蛋白。然而，镍净化2+亲和性仅产生近似化学计量比的GemC1–Geminin复合物（车道E）。车道M包含分子量标记（标记单位为kDa）。(b条)尺寸排除色谱法tGemC1–tGeminin异二聚体显示归一化UV280 纳米洗脱曲线（蓝线）。(c（c）)HA标记的GemC1在U2OS细胞中过表达，并且能够共同沉淀内源性Geminin，这表明这两种蛋白质在人类细胞中也相互作用；在下面的面板中，灰色的星形标记存在于抗HA免疫沉淀物中的IgG的大链；上面板中的白色星号标志着一条与Geminin抗体交叉反应的带。(天)HA-标记的GemC1在U2OS细胞中过度表达，存在GFP标记的Geminin或缺乏螺旋线圈结构域Geminin的Gemini结构体（1-72），表明Geminin螺旋线圈是U2OS与GemC1相互作用所必需的；灰色星标记了抗HA中存在的IgG大链；Geminin（1-72）-GFP下面的未标记带很可能是降解产物。

为了测试GemC1是否也与人类细胞中的Geminin相互作用，我们用表达GemC1-HA的构建物转染U2OS细胞。转染的GemC1-HA能够共同沉淀内源性双核蛋白（图4c（c）)表明GemC1和Geminin也在人类细胞中相互作用。为了进一步确定这种相互作用是否依赖于Geminin的螺旋结构域，我们构建了一个包含Geminin N末端72个氨基酸且缺少螺旋结构域的Geminin（1-72）构建体，并将Geminin和Geminin作为GFP融合体与GemC1-HA一起转染到U2OS细胞中。转染的GemC1-HA能够共同沉淀GFP-Geminin，但不能共沉淀GFP-Geminin（1-72）（图4天)，表明双子座螺旋线圈对相互作用是必要的。

然后我们想检查GemC1是否也与Idas交互。为此，我们使用GemC1-HA和GFP标记的Idas联合转染U2OS细胞。在这些条件下，观察到GemC1和Idas之间的弱相互作用（图5)其中GemC1-HA只能共沉淀Idas-GFP总蛋白的一小部分。然而，我们无法从细菌中产生任何GemC1–Idas复合物在体外研究。在一个平行实验中，我们还检查了GemC1是否与Geminin的主要伴侣Cdt1结合，但我们无法观察到相互作用。

图5 GemC1与Idas交互，但不与Cdt1交互。如图所示，U2OS细胞与表达GemC1-HA和Idas-GFP或Cdt1-GFP的载体共转染。对于每个通道，在用抗HA特异性抗体进行免疫沉淀后，用抗GFP（上面板）和抗HA（下面板）特异性抗体通过Western blotting分析总细胞裂解物和免疫沉淀。在下面板中，灰色星形标记了抗HA免疫沉淀物中存在的IgG大链。上面板中未标记的带是GPA与Idas-GFP弱相互作用的非特异性带，但未检测到与Cdt1-GFP的相互作用。

接下来，我们想研究GemC1同源二聚体和异二聚体的稳定性，并与由类双核蛋白家族形成的其他二聚体进行比较。

3.3. 双子座家族螺旋线圈的稳定性

我们已经共同证明，Geminin、Idas和GemC1这三个家族成员可以形成同二聚体，Idas和GemC1可以通过其线圈结构域与Geminin形成异二聚体。虽然我们能够在人类细胞中观察到弱Idas–GemC1相互作用，但我们无法生产任何形式的重组复合物来检查其稳定性。我们之前已经研究了Idas和Geminin线圈-线圈二聚体的稳定性，并得出结论：tIdas–tIdas-二聚体在生理条件下不稳定，而tGeminin–tGemini和tDas–tGemin是稳定的蛋白质（Caillat等。, 2013).

我们首先使用OPTIM 1000仪器检查了所有五种二聚体（tGeminin–tGeminin、tIdas–tIdas、tGemC1–tGemC1、tIdas–tGeminin和tGemC1–Geminin）的稳定性，监测色氨酸荧光以估计二聚体的稳定性。虽然我们能够准确地重现之前的结果（表2)，得到了含有tGemC1配合物的意外曲线（图6一)。结构信息可以为这种意外行为提供生物物理解释：Geminin和Idas中Trp99和Trp182残基的疏水表面很好地埋藏在螺旋线圈的相邻侧链之间（图6b条)，但在GemC1中Trp75是表面暴露的。值得注意的是，虽然这个色氨酸在所有三个卷曲螺旋序列的N末端是唯一的，但它实际上并不保守，也不在同一个七肽或同一个卷曲寄存器中(天在Geminin和Idas以及c（c）在GemC1中）。因此，GemC1中Trp75的环境在展开时几乎不会改变，并且在熔化曲线中不应该看到任何信号。对熔化曲线的仔细分析支持了这一理论：虽然tGemC1同二聚体的信号在没有明确偏转点的情况下稳定下降，但tGemC1-tGeminin复合物的信号在大约65°C时增加，类似于tGeminin同二聚物的去折叠，这可能是因为双子蛋白链在这个温度下完全融化。

图6 杰米宁系列线圈的热稳定性。(一)重心荧光作为温度的函数，在OPTIM 1000仪器中测量，显示了五种可用同二聚体和异二聚体的熔点。(b条)GemC1、Geminin和Idas–Geminin二聚体的球体模型，其中N末端色氨酸在GemC1中已经是溶剂可获得的，以黄色突出显示。(c（c）)220时的摩尔椭圆度 nm作为温度的函数，由圆二色性（CD），显示了五种可用同二聚体和异二聚体的熔点。细长的黑线表示拟合的模型。

为了在不使用色氨酸荧光信号的情况下检测GemC1复合物的稳定性，我们采用了公认的方法圆二色性（CD）。由于螺旋线圈是螺旋的，我们选择研究变性监测222的椭圆度 纳米。从熔化曲线可以明显看出（图6c（c）)当三个同二聚体以单一状态展开时，两个异二聚体则以两种状态展开，每个螺旋大概具有不同的熔点。通过分析数据，我们假设螺旋线圈以二聚体的形式展开（Greenfield，2006）)因为它们不通过共价键在一个步骤或两个步骤中相互连接，这取决于它们的同二聚体或异二聚体状态。该分析清楚地表明，tGemC1T型_米34.6°C时，其稳定性不如tGeminin（65.3°C），但比Idas（26.9°C）更稳定。然而，这个值表明tGemC1同型二聚体在生理环境中应该相当不稳定；由于我们无法获得可溶性全长tGemC1来进行此实验，因此我们无法确定此结论是否可以推广到野生型蛋白质。然而，我们的数据表明，GemC1本身可能不稳定，在生理条件下可能不太可能以同源二聚体的形式存在于细胞中。我们推测GemC1可能与Geminin以异二聚体的形式存在于细胞中，而与其他伙伴形成复合物或翻译后修饰可能需要稳定GemC1同二聚体。tGemC1–tGeminin复合物显示出两种状态的展开：第一个事件在42.6°C，第二个事件在62.6°C。假设两个事件之间的比率等于tGemC1和tGeminin之间展开椭圆度的总变化比率，我们得到了一个很好的拟合，我们将第一个事件解释为tGemCI的展开（由于与Geminin的相互作用，它已经稳定了约8°C）第二个事件是tGeminin的展开，它受到了适度的破坏。这一结果表明，当GemC1和Geminin在细胞中共同表达时，GemC1的主要形式可能与Geminin复合，正如之前对Idas的建议。有趣的是，CD数据还显示了tDas–tGeminin复合物的双事件曲线。然而，在这种情况下，第一个事件的相关摩尔椭圆度变化很小，我们认为这很可能是tDas C末端的展开，它不是螺旋线圈的一部分；tDas–tGeminin复合体中的两条螺旋在相似的温度下展开，但数据无法反褶积。tGemC1–tGeminin展开的情况也是如此，但程度要小得多，因为在那里我们更清楚地看到两种状态，它们更可能对应于两个螺旋。

通过比较OPTIM和CD实验，可以提取出一些有趣的假设：由于色氨酸残基的定位，OPTIM监控着卷曲线圈N末端区域的展开，而CD则给出了更全面的图像。对于tGeminin和tDas，很明显T型_米从OPTIM（对应于N端部分）获得的结果高于从CD（对应于完整的螺旋线圈）获得的值：这可能意味着这些螺旋线圈从C端向N端展开。假设折叠与我们在这里研究的展开采用相同的路径，这反过来意味着这些线圈也从N端折叠到C端，支持我们之前关于异二聚体Idas–Geminin复合体（Caillat等。, 2013)并引导我们提出，GemC1–Geminin复合体也是如此。围绕线圈折叠的生物物理问题是相当大的（有关综述，请参阅Lupas&Gruber，2005)并且已经使用了复杂的方法来研究这些问题。因此，应谨慎对待上述推测。然而，我们相信，通过我们在这种情况下使用的两种不同信号来监测展开情况（据我们所知，这是第一次），可以对杰米宁家族的线圈如何折叠提供新的见解。

总之，我们的GemC1螺旋线圈的结构以及生物物理数据表明，GemC1卷曲线圈可能是不稳定的，并且（对于Idas而言）GemC1–Geminin二聚体可能是细胞中更稳定的结构。因此，我们的结果加强了这样一个概念，即当Idas和GemC1在细胞中共同表达时，它们可能调节双核蛋白二聚体的丰度。GemC1–Geminin和Idas–Gemini异二聚体可能是共同表达Geminin的细胞（如增殖细胞）中Idas和GemC1的主要池，并可能调节Geminin、Idas和JimC1在增殖和分化中的多种功能。