Defined PEG smears as an alternative approach to enhance the search for crystallization conditions and crystal-quality improvement in reduced screens

Chaikuad, A.; Knapp, S.; von Delft, F.

doi:10.1107/S1399004715007968

研究论文

结构
生物学

国际标准编号：2059-7983

第71卷| 第8部分| 2015年8月| 第1627-1639页

https://doi.org/10.107/S1399004715007968

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将PEG涂片定义为一种替代方法，以加强对结晶条件的搜索，并在减少的屏幕中提高晶体质量

Apirat Chaikuad公司,^一 ^* 斯特凡·纳普 ^a、，^b条和弗兰克·冯·代尔夫特 ^一 ^*

^一牛津大学结构基因组学联合会纳菲尔德临床医学系，英国牛津OX3 7DQ，Headington，Roosevelt Drive，Old Road Campus Research Building^b条德国梅因河畔法兰克福Max-von-Laue-Strasse 9号N240栋3.03室，约翰·沃尔夫冈·歌德大学药物化学研究所，邮编60438
^*通信电子邮件：apirat.chaikuad@sgc.ox.ac.uk,frank.vondelft@sgc.ox.ac.uk

澳大利亚生物21协同结晶中心J.Newman编辑(2014年11月28日收到； 2015年4月22日接受；在线2015年7月28日)

在大分子晶体学中，寻求一组最佳的有限有效结晶条件仍然是一个挑战，因为大量的化学物质被认为适合促进晶体生长，这一问题变得复杂。由于缺乏合理的方法来选择成功的化学空间和代表性组合，导致了大量重叠条件，目前在许多商用结晶筛中都存在这种情况。这里，建议通过使用PEG涂片对广泛使用的PEG沉淀剂进行采样的另一种方法，PEG涂膜是不同PEG的混合物，要求每个组分对晶体生长具有中性或协同正效应。四种新定义的涂片按分子量组分类，能够保存与不同聚合物尺寸相关的特定特性。这些涂片不仅可以广泛覆盖这些聚合物的特性，还可以减少PEG变量，从而能够对缓冲液和添加剂等其他参数进行更多采样。对220多种不同的重组人蛋白进行了基于涂片的筛选效率评估，总体显示出良好的初始结晶成功率近50%。此外，在一些情况下，只有使用PEG涂片才能获得成功的结晶，而各种商业筛网无法生成结晶。因此，定义的涂片提供了另一种PEG取样方法，这将有助于结晶筛的设计，该结晶筛可在该关键沉淀剂的广阔化学空间内取样。

关键词：聚乙二醇涂片;结晶筛;化学空间;蛋白质结晶.

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1.简介

结晶仍然是高分子晶体学的瓶颈步骤之一。这一过程通常包括对已知的促进结晶的有效鸡尾酒进行初步的广泛筛选。结晶实验中目前使用的大量沉淀剂、缓冲液和添加剂阻碍了在受蛋白质可用性和成本限制的实验中采用完整和系统的组合方法。这些限制导致了几种经验方法的发明，例如稀疏矩阵（Jancarik&Kim，1991）)，不完全事实（Carter&Carter，1979 )和网格公式（Brzozowski&Walton，2001 ; 麦克弗森，2001年 ; Gorrec，2009年 ). 由于大多数市面上可买到的随机筛选通常是围绕一组具有高度重叠化学性质的特殊有利试剂制定的（Gorrec，2013 )，其中一个或两个屏幕通常足以实现成功的结晶结果（Segelke，2001 ; 纽曼等。, 2005 ). 然而，在某些情况下，使用这几个筛子可能无法实现确定合适结晶条件所需的广泛化学空间采样。

由于其促进蛋白质-蛋白质结合的能力（McPherson，1976 ; Brzozowski&Tolley，1994年 ; 乔治·威尔逊（George&Wilson），1994年 ; Vivarès&Bonneté，2002年 ; 布达约娃等。, 1999 ; 田中和阿塔卡，2002年 ; 田中等。, 2003 ; 库尔卡尼等。, 2000 )聚乙二醇（PEG）已被广泛用作蛋白质结晶中最有效的沉淀剂之一（Fazio等。, 2014 ). 不同程度的聚合和附加修饰产生了分子量从200到>20的多种PEG变体 000 基于生物大分子结晶数据库（BMCD）；https://xpdb.nist.gov:8060/BMCD4/index.faces; 吉利兰等。, 2002 )，至少20个PEG（200、300、350 MME、400、500 DME、550 MME、600、750 MME、800、1K、2K、2K-MME、3350、4K、5K MME、6K、8K、10K、12K和20K）经常被用作大分子结晶中的有效沉淀剂。在初始结晶筛选中对所有种类的聚乙二醇进行取样是不切实际的，因为需要将一组添加剂和缓冲液与每种不同的聚乙二醇变体重复组合。因此，在商业筛选中主要选择了几种这种聚合物，以允许勘探其他化学品。这种方法可以通过以下概念来证明：围绕两个或三个PEG变体制定的简化屏幕足以确定后续实验所需的条件（Kimber等。, 2003 ; 高等。, 2005 ; 第页等。, 2003 )例如正交方法（Kingston等。, 1994 )或反向筛选（Stura等。, 1994 ). 因此，这种聚乙二醇取样策略无法在初始结晶过程中完全覆盖聚乙二醇化学空间，导致在中小型实验室中使用多个商业屏幕。然而，最近的一项调查表明，更多的随机筛选仍然低于样品的结晶条件（Gorrec，2013).

在PACT屏幕的开发过程中，引入了所谓的PEG涂片，并通过混合十种不同的PEG来涂片聚合物的分子量范围，范围从200到10 000 Da（纽曼等。, 2005). 聚乙二醇涂片（或任何组合的化学品）要求每个成分对结晶的影响要么是中性的，要么是阳性的。涂片的一个好处是，它将减少PEG变量的数量，同时潜在地保持PEG空间的大覆盖范围，这在原则上应保持每个包含聚合物的化学特性。在初步高分子结晶试验中（纽曼等。, 2005)基于涂片和单个PEG的筛查的可比成功率表明，在结晶筛查的配方中，可能会用涂片沉淀剂替代单个PEG。此外，还证明了使用涂片沉淀剂成功测定结构的例子（Aricescu等。, 2007 ; 科斯基等。, 2009 ). 尽管如此，一些研究表明同质性PEG的分子量和浓度是促进蛋白质晶体生长的重要决定因素（McPherson，1976; 瓦尔贾卡等。, 2000 ; 斯图拉等。, 1994; 斯内尔等。, 2008 )，因为它们的波动可能影响潜在的分子间相互作用（Tanaka&Ataka，2002; 库尔卡尼等。, 2000; 布达约娃等。, 1999). 因此，目前尚不清楚这种具有巨大异质性和较少保存与不同分子量相关的不同物理性质的涂片是否是对这种聚合物进行采样的最佳方法。

在本研究中，我们根据11种聚乙二醇的分子量类别，定义了四种新型的聚乙二醇涂片，作为探索这种沉淀剂在大分子结晶中的应用的扩展方法。这些包括低分子、中分子、高分子和大分子涂片，其中后者相当于先前报道的组合（Newman等。, 2005). 关于使用这些沉淀剂结晶一组32种有问题的蛋白质的初步系统测试表明，通过对聚乙二醇的广泛取样，所有四种聚乙二醇涂片的组合使用提高了结晶效率。然后，我们通过引入多重加性策略制定了一个基于涂片的随机筛查。使用结构基因组学联合会（SGC）当前项目中的191个蛋白质组测试了该筛选的结晶效力。有趣的是，基于涂片的筛查显示出与四种商业筛查共同使用的成功率几乎相似的成功率。此外，特别重要的是，基于涂片的筛选能够促进几种抗结晶蛋白的晶体生长，这些蛋白使用商业设备。

2.材料和方法

2.1、。材料

11个PEG，包括PEG 400、550 MME、600、1K、2K、3350、4K、5K MME、6K、8K和10K，可在内部使用，通常用于大多数商业屏幕（图1)在本研究中，选择了，以提供400到10的分子量（MW）覆盖范围 000 Da.储备溶液从Fluka、NeXtal和Rigaku试剂公司购买。典型浓度为50%(w个/v（v）)，除了一些低分子量类型，它们被稀释到50%(v（v）/v（v）)使用前。所有其他化学品，包括缓冲液、有机溶液和盐溶液，均为分析级化学品，从Rigaku试剂和Sigma公司购买。

图1
分析四个主屏幕中单个PEG的使用情况。(一)PEG列表及其在SGC初始结晶过程中常规使用的四种广泛使用的商业相关屏幕的基准组中的使用频率。(b条)饼图显示了在四个商业相关初级筛选的总共218种基于PEG的鸡尾酒中使用的每种PEG的比例，揭示了对一些特定PEG变体的高度偏向性采样。

2.2. 聚乙二醇涂片的定义和制备

PEG分为三类：低分子量（≤1 kDa），中等分子量（>1–5 kDa）和高分子量（≥6 kDa）。PEG涂片是通过以等体积混合PEG储备（50%浓度）制成的，以使涂片储备和总浓度达到50%。创建了四个涂片：（i）低分子量（LMW；PEG 400、550 MME、600和1K），（ii）中分子量（MMW；PEG-2K、3350、4K和5K MME），（iii）高分子量（HMW；PEG6K、8K和10K）和（iv）宽分子量。BMW涂片的配方与之前使用的涂片相似（纽曼等。, 2005).

2.3. 测试蛋白质和结晶实验

来自SGC当前项目的重组人类蛋白用作测试蛋白。为了评估四种涂片的结晶效果，配制了两种基于PEG涂片的筛选。所有结晶实验都是在277和/或293℃下，采用坐滴蒸汽扩散法，在96周、三个亚室的SWISSCI板（SWISSCI-AG）中进行的 K.20个储层 µl用于平衡150 nl定容结晶滴，分别以2:1、1:1和1:2的蛋白质与储液器体积比（Luft）制备等。, 2007 ). 使用自动检测系统（Rigaku）在两个月内定期对结晶液进行成像。在相同的实验参数下，如蛋白质浓度、蛋白质缓冲液、，跌落比和温度。

3.结果和讨论

3.1. 初步PEG涂片筛查和初步结晶试验

最初，使用我们的四个主屏幕显示出对结晶具有抵抗力的蛋白质是实验的主要重点。该战略是开发一种具有更多样化化学空间的替代室内筛网，该筛网还将提供关于液滴中蛋白质沉淀行为的进一步信息，并有望提高结晶成功率。根据我们的观察，PEG空间在我们的四个主要稀疏矩阵屏幕中覆盖得很差（图1)，我们考虑在初始结晶过程中扩大不同PEG沉淀剂的使用。这导致开发了四种PEG涂片，并对聚合物进行了等量采样。四个PEG涂片允许使用完全因子正交数组方法（金斯顿等。, 1994)用于设计初始屏幕。该筛选（以下简称为Basic ChemSpace 1（BCS1））共包含192种鸡尾酒，以四种固定浓度为22.5%的涂片为基础，八种缓冲系统涵盖pH范围4–10，五种已知促进结晶的添加剂（Snell等。, 2008)然而，在四个主屏幕中很少或从未进行过采样（图2).

图2
基于涂片的BCS1的系统设计。该图展示了初始PEG涂片筛查BCS1的完整析因系统设计。缓冲液的使用浓度为0.1 M（M）添加剂为（i）醋酸钾（KOAc），（ii）硫酸锂（Li₂SO公司₄)，（iii）硝酸铵（NH₄否_三)，（iv）氯化锂和氯化镁混合物（LiCl+MgCl₂)和（v）乙二醇，均为0.2 M（M）除乙二醇外的浓度为10%(v（v）/v（v）). 使用的PEG涂片为低分子量（LMW）、中分子量（MMW）、高分子量（HMW）和宽分子量（BMW）。

在一组32种重组人类蛋白上测试了这种基于涂片的初始筛查的效果，其中25种蛋白在用四个初级筛查进行测试时未能结晶；剩下的七个靶没有产生衍射质量的晶体。出乎意料的是，BCS1屏幕显示了其中15种蛋白质的结晶点击。结晶蛋白来自不同的蛋白家族，包括激酶（五）、磷酸酶（一）、脱氢酶（四）和其他（五）。值得注意的是，其中八种蛋白质以前从未结晶。此外，从BCS1筛选获得的这些测试蛋白的大多数晶体都成功地进行了结构测定（另请参见§3.4适用于PGAM5、MMAA和UGDH）。

3.2. 四种新定义PEG涂片的沉淀效率比较

最初基于涂片的系统BCS1筛查具有卓越的结晶成功率，因此可以评估每个涂片的沉淀效率，这表明MMW涂片是成功率最高的沉淀剂，能够结晶12种蛋白质（占15种结晶蛋白质的80%），而LMW涂片显示沉淀效果最低，成功率仅为～20%（图3). 令人惊讶的是，尽管包含了所有11个PEG，BMW涂片仅对10个蛋白质产生了结晶点击，其结晶效率与其他三个涂片（14个蛋白质）的组合成功率不匹配。还观察到，BMW涂片不适合作为五种蛋白质的沉淀剂，只有使用特定类型的涂片才能实现蛋白质的结晶（图3). 这也被三种蛋白质所证实，这三种蛋白质只在LMW涂片中结晶，而在BMW涂片上没有结晶。尽管如此，一种仅在BMW涂片中结晶的蛋白质的独特结晶成功也表明BMW涂膜可能具有特定结晶特性，可能超出其他三种涂片。总体结果表明，每个涂片都可能具有独特的沉淀特性，这可能与其分子量、不同程度的异质性和不同浓度的有效成分有关。然而，还应该指出，这些统计数据是基于一个实验得出的。此外，由于化学性质极为相似，重复BCS1筛选并应用基于有效涂片的条件下的交叉播种可能会在含有其他涂片的对应条件下实现晶体生长，而这些涂片最初并未证明结晶能力。

图3
BCS1筛查中四种涂片的沉淀效力分析。图表显示了每个涂片的晶体点击数，调查了系统BCS1屏幕中结晶的15种蛋白质。在大多数情况下，在一种以上类型的PEG涂片中观察到晶体撞击；然而，一些蛋白质需要特殊的涂片才能成功晶体生长。

除了涂片促进结晶的效率外，蛋白质晶体的质量也是本研究中有效沉淀剂验证的重要标准。然后，我们对形态（三维形状的大小和规则性）进行了比较，在某些情况下，还对从不同涂片中获得的相同蛋白质晶体的衍射质量进行了比较。在几乎所有情况下，我们观察到不同类型涂片的晶体质量差异很大（图4). 例如，UGDH突变晶体只能在MMW、HMW和BMW涂片中获得，但只有在MMW和BMV沉淀剂中生长的晶体才能改善形貌和衍射质量。此外，LMW和MMW涂片均能使MMAA晶体生长，但只有前者产生了更大的单晶，衍射质量优于其他涂片。此外，当使用MMW、HMW和BMW涂片时，PGAM5容易结晶，但只有MMW和BMV涂片产生衍射晶体。然而，在某些情况下，不同类别的涂抹并没有导致晶体质量的显著差异，如在SMARCA4的溴结构域的情况下所观察到的，对于SMARCA4，从LMW和MMW涂抹获得的晶体尽管具有略微不同的形态，但表现出相似的衍射质量。

图4
BCS1中不同涂抹沉淀剂的晶体形态比较。具有代表性的一组蛋白质证明了不同涂片对结晶液中蛋白质行为的影响。不同有效的涂片沉淀剂之间的晶体质量和形态差异也很明显。

总的来说，初步结晶实验表明，每个涂片都具有独特的结晶特性，具有高度异质性的广泛涂片可能无法替代其他聚乙二醇组合。尽管如此，沉淀剂效率的唯一部分重叠表明，以这四种涂片的形式组合使用聚乙二醇，为初始结晶试验产生了一个有效的筛选集，最大限度地提高了聚乙二醇的多样性和效力。

3.3、。96型涂片筛查和结晶试验

经过初步的系统测试，我们认为四种涂片中的每一种都会给蛋白质结晶带来独特的特性，因此我们实现了一种更方便的96-well PEG涂片结晶筛（以下简称BCS2）。我们的目标是在有限的实验空间内生成一个具有广泛PEG和化学覆盖的屏幕，这将有利于我们当前的项目。因此，在四个主要筛查中，不是用等效涂片替换单个PEG，而是直接比较涂片的效果与单PEG，即围绕这四种沉淀剂配制的一组新鸡尾酒。筛选分为两部分，其设计基于系统或随机原则，每一部分如下所述。

3.3.1. 一组系统的简单条件

筛选的第一部分只考察了两种成分，即PEG和缓冲液，并包含了24种鸡尾酒，这些鸡尾酒是由四种涂片和六种pH值在4.5到9.5之间的不同缓冲系统之间的完全析因组合产生的（表1，设置1）。涂片的使用能够在不同pH条件下对不同类别聚合物的影响进行全面评估，这将需要更大的实验空间和单个PEG。我们还观察到，这组简单的鸡尾酒在一些情况下具有促进晶体生长的潜力，包括PGAM5、SMARCA4（Filippakopoulos等。, 2012 )、UGDH（艾格等。, 2011 , 2012 )、BAZ2B（弗格森等。，2013年 )，第38页α–表1（德尼古拉等。，2013年 )和PCAF（见§3.4）。

表1
基于涂片的BCS2筛查中96种鸡尾酒的成分

设置1。

不。	聚乙二醇涂片	%	缓冲器（0.1 M（M）)	酸碱度
1	LMW公司	30	醋酸盐	4.5
2	LMW公司	30	柠檬酸盐/磷酸盐	5.5
三	LMW公司	30	MES公司	6.5
4	LMW公司	30	HEPES公司	7.5
5	LMW公司	30	特里斯	8.5
6	LMW公司	30	比辛	9.5
7	MMW（毫米波）	25	醋酸盐	4.5
8	MMW（毫米波）	25	柠檬酸盐/磷酸盐	5.5
9	MMW（毫米波）	25	MES公司	6.5
10	MMW（毫米波）	25	HEPES公司	7.5
11	MMW（毫米波）	25	特里斯	8.5
12	MMW（毫米波）	25	比辛	9.5
13	HMW公司	20	醋酸盐	4.5
14	HMW公司	20	柠檬酸盐/磷酸盐	5.5
15	HMW公司	20	MES公司	6.5
16	HMW公司	20	HEPES公司	7.5
17	HMW公司	20	特里斯	8.5
18	HMW公司	20	比辛	9.5
19	宝马	20	醋酸盐	4.5
20	宝马	20	柠檬酸盐/磷酸盐	5.5
21	宝马	20	MES公司	6.5
22	宝马	20	HEPES公司	7.5
23	宝马	20	特里斯	8.5
24	宝马	20	比辛	9.5

设置2。

不。	聚乙二醇涂片	%	缓冲液，pH（0.1 M（M）)	添加剂1	添加剂2
25	LMW公司	35
26	LMW公司	28	醋酸盐，4.6	0.2 M（M）醋酸铵	5%(v（v）/v（v）)乙二醇
27	MMW（毫米波）	28		0.15 M（M）氯化钠
28	MMW（毫米波）	25	Cacodylate，5.5版	0.2 M（M）硫酸铵
29	MMW（毫米波）	25	柠檬酸盐，5.5	0.1 M（M）磷酸钠/钾	0.1 M（M）氯化铷
30	HMW公司	22.5		0.2 M（M）KCl公司
31	HMW公司	15	柠檬酸盐，5.0	0.15 M（M）醋酸铵
32	宝马	25		0.05 M（M）精氨酸/谷氨酸盐混合物	5%(v（v）/v（v）)甘油
33	宝马	20	柠檬酸盐5.6	0.15 M（M）醋酸镁
34	宝马	25	醋酸盐，4.6	0.2 M（M）硫酸铵
35	LMW公司	22.5	人工编码站，6.0	0.2 M（M）酒石酸钠/钾
36	MMW（毫米波）	22.5	管道，7.0	0.1 M（M）氯化钙₂	0.1 M（M）氯化镁₂
37	LMW公司	22.5	Cacodylate，5.3版	0.2 M（M）硝酸铵
38	LMW公司	22.5	MES，6.5毫米	10%(v（v）/v（v）)异丙醇
39	MMW（毫米波）	20	人工编码站，6.0	0.2 M（M）硝酸铵	5%(v（v）/v（v）)甘油
40	MMW（毫米波）	20	磷酸盐，6.2	0.2 M（M）甲酸钠	10%(v（v）/v（v）)甘油
41	MMW（毫米波）	30	ADA，6.5	0.2 M（M）锂₂SO公司₄
42	HMW公司	12	人工编码站，6.5	0.1 M（M）KSCN公司	0.1 M（M）溴化钠
43	HMW公司	18	ADA，6.5	0.2 M（M）硫酸铵
44	宝马	15	人工编码站，6.2	0.15 M（M）氯化钙₂	5%(v（v）/v（v）)甘油
45	宝马	15	Cacodylate，5.3版	5%(v（v）/v（v）)塔西马特	10%(v（v）/v（v）)乙二醇
46	宝马	28	磷酸盐，6.2	0.2 M（M）氯化钠
47	MMW（毫米波）	22.5	柠檬酸盐，5.5	0.1 M（M）硫酸铵	0.05 M（M）硫酸镁
48	MMW（毫米波）	22.5	双三丙烷，8.0	0.2 M（M）氯化镁₂, 0.01 M（M）氯化钴₂	10%(v（v）/v（v）)甘油
49	LMW公司	25	人工编码站，6.5	0.08 M（M）醋酸镁	0.02 M（M）氯化镁₂
50	LMW公司	12.5	HEPES，7.5级	0.1 M（M）KCl公司	5%(v（v）/v（v）)乙二醇
51	MMW（毫米波）	20	三个，7.5	0.1 M（M）乙酸锌	0.1 M（M）氯化锌₂
52	MMW（毫米波）	20	管道，7.0	0.1 M（M）氯化镁₂	0.1 M（M）KCl公司
53	MMW（毫米波）	28	HEPES，7.5级	0.05 M（M）硫酸镁₄
54	HMW公司	15	HEPES，7.5级	0.1 M（M）磷酸钠/钾	10%(v（v）/v（v）)乙二醇
55	HMW公司	25	管道，7.0	0.1 M（M）氯化铷	0.1 M（M）甲酸镁
56	宝马	25	HEPES第7.2节	0.2 M（M）锂₂SO公司₄
57	宝马	20	HEPES，7.5级	0.2 M（M）硝酸铵
58	宝马	30	HEPES，7.5级	0.1 M（M）氯化镁₂	0.1 M（M）氯化铷
59	HMW公司	22.5	双三丙烷，7.8	0.05 M（M）柠檬酸钠	0.05 M（M）氯化镁₂
60	HMW公司	22.5	比辛，9.0	7%(v（v）/v（v）)塔西马特	10%(v（v）/v（v）)乙二醇
61	LMW公司	25	庚烯，7.8	0.15 M（M）柠檬酸钠
62	LMW公司	28	特里斯，8.5	0.2 M（M）氯化钠	5%(v（v）/v（v）)甘油
63	MMW（毫米波）	15	特里斯，8.0	0.15 M（M）氯化钠	0.075 M（M）醋酸钠
64	MMW（毫米波）	25	双三丙烷，8.5	0.1 M（M）甲酸钠	0.1 M（M）氯化钠
65	MMW（毫米波）	20	比辛，9.0	0.2 M（M）硫酸铵	0.05 M（M）硫酸镁
66	HMW公司	18	双三丙烷，8.5	0.2 M（M）硝酸铵	10%(v（v）/v（v）)甘油
67	HMW公司	25	特里斯，8.0	0.2 M（M）氯化镁₂	0.01 M（M）氯化钙₂
68	宝马	28	特里斯，8.5	0.15 M（M）醋酸铵
69	宝马	25	比辛，9.0	10%(v（v）/v（v）)2-丙醇
70	宝马	18	特里斯，8.0	0.2 M（M）硫酸铵
71	宝马	22.5	比辛，8.8	0.2 M（M）KCl公司	0.02 M（M）硫酸镁
72	宝马	22.5	Cacodylate，5.5版	0.1 M（M）酒石酸钠/钾	10%(v（v）/v（v）)乙二醇
73	LMW公司	10	人工编码站，6.2	0.1 M（M）甲酸镁	0.01 M（M）氯化钴₂
74	LMW公司	25	双三，6.8	0.05 M（M）氯化镁₂	0.15 M（M）硫酸锂
75	MMW（毫米波）	25	庚烯，7.5	0.2 M（M）硫酸铵	0.01 M（M）氯化镉₂
76	MMW（毫米波）	18		0.1 M（M）氯化镁₂	0.1 M（M）氯化钾，10%(v（v）/v（v）)乙二醇
77	MMW（毫米波）	12	人工编码站，6.5	0.1 M（M）醋酸镁	10%(v（v）/v（v）)乙二醇
78	HMW公司	12	人工编码站，6.2	0.1 M（M）醋酸镁	0.1 M（M）KCl公司
79	嗯	8	管道，7.0	0.04 M（M）氯化钙₂	0.04 M（M）甲酸钠
80	宝马	18	双三，6.0	0.075 M（M）柠檬酸钠	0.075 M（M）氯化镁₂
81	宝马	15	双三，6.5	0.1 M（M）醋酸钠	0.1 M（M）氯化镁₂
82	宝马	25	HEPES，7.0级	0.1 M（M）硫酸铵	0.1 M（M）甲酸钠
83	MMW（毫米波）	22.5	HEPES，7.5级	0.2 M（M）磷酸钠/钾	10%(v（v）/v（v）)甘油
84	宝马	22.5	三个，7.5	0.3 M（M）氯化钠	0.05 M（M）精氨酸/谷氨酸混合物
85	LMW公司	25	特里斯，8.0	0.04 M（M）氯化钙₂	0.04 M（M）甲酸钠
86	LMW公司	20	管道，7.0	0.1 M（M）氯化镁₂	0.1 M（M）氯化铷
87	MMW（毫米波）	15	HEPES，7.5级	0.2 M（M）氯化镁₂	5%(v（v）/v（v）)2-丙醇，10%(v（v）/v（v）)乙二醇
88	MMW（毫米波）	12	HEPES，7.0级	0.15 M（M）硫酸镁	0.05 M（M）醋酸铵
89	MMW（毫米波）	20	HEPES第7.2节	7%(v（v）/v（v）)塔西马特
90	HMW公司	15	特里斯，7.2	0.1 M（M）醋酸铵	0.1 M（M）氯化锌
91	HMW公司	20	HEPES，7.8级	0.05 M（M）氯化镁₂	0.15 M（M）硫酸锂
92	宝马	25	特里斯，7.8	0.1 M（M）KSCN公司	0.1 M（M）溴化钠
93	宝马	28	双三丙烷，8.5	0.05 M（M）硫酸铵	0.05 M（M）硫酸锂
94	宝马	15	管道，7.0	0.2 M（M）硫酸铵	10 米M（M）氯化镉₂, 10%(v（v）/v（v）)乙二醇
95	宝马	22.5	双三，7.5	0.2 M（M）锂₂SO公司₄	0.05 M（M）乙酸锌
96	宝马	22.5	HEPES，7.5级	0.075 M（M）NaBr和NaI混合物	0.05 M（M）氟化钠

3.3.2. 屏幕的随机集

筛选条件的第二部分旨在结合多种因素，如盐和添加剂，以及沉淀剂和缓冲液，因此采用随机方法配制72种鸡尾酒（表1，设置2）。通常在这样一个有限的实验空间中，化学空间的扩展以减少PEG空间或反之亦然，因为条件的复制仅在不同的PEG中不同。我们使用聚乙二醇涂片法克服了这一限制。我们还在一些鸡尾酒中使用了多种盐/添加剂，以进一步拓宽化学空间。这种方法可能会提供一种从多组分中随机搜索有效试剂的方法，类似于银弹法（McPherson&Cudney，2006）)或筛选晶体生长可能需要的多种小分子/添加剂组分。

3.3.3. 结晶效率

使用一组191个重组人蛋白测试BCS2筛选的性能，并与我们的四个主要筛选的组合成功率进行比较。基于涂片的筛查证明了80种蛋白质能够产生初始结晶，成功率为42%。相比之下，当仅考虑基于聚乙二醇的条件时，这略低于四个初级筛选的组合成功率，即～64%（122个蛋白质）或59%（113个蛋白质）（图5). 尽管如此，考虑到结晶鸡尾酒的有限设置，80种蛋白质的结晶命中率是显著的（表2和图6). 我们还观察到多盐/添加剂方法对一些蛋白质结晶的有用性。ETV1–DNA复合物、CDKL5和RASSF3等案例的详细信息在§3.4.

表2
BCS2筛网中结晶的蛋白质示例

蛋白质	缩写	UniProt ID	兆瓦（kDa）	点击示例	Smear沉淀剂	来自主筛网的单PEG沉淀剂
乙酰-CoA羧化酶1（C末端结构域）	ACACA公司	问题13085	87.4	23, 65, 89, 92	MMW、宝马	3350，5000万MME
双歧杆菌素（棒状结构域）	AMPH公司	第49418页	24.2	2, 14, 20, 37, 39, 40, 42, 45, 66, 68, 78, 80, 96	LMW、MMW、HMW、宝马	3350
邻锌指结构域蛋白2B的溴代多巴胺	BAZ2B公司	问题9UIF8	13.6	三	LMW公司	600、1K、6K
ATP酶家族AAA结构域蛋白2（溴代多巴胺）	ATAD2公司	Q6PL18号机组	15.4	12, 14, 22, 31, 40, 41, 43, 44, 45, 47, 50, 54, 57, 61, 62, 63, 65, 66, 74, 78, 79, 80, 81, 92, 93	LMW、MMW、HMW、宝马	1公里、3350公里、6公里、8公里、20公里
桥接积分器2（N-bar域）	银行标识代码2	问题9UBW5	28	3, 9, 10, 11, 15, 17, 21, 23, 26, 27, 33, 27, 33, 38, 39, 47, 49, 59, 82, 84	LMW、MMW、HMW、BMW	3350万
细胞周期素依赖性激酶样5（激酶域）	CDKL5型	O76039号	35.2	12, 18, 27, 38, 39, 48, 63, 65, 67, 83, 89	LMW、MMW、HMW	20公里
DNA交联修复1A蛋白	DCLRE1A公司	问题6PJP8	41.3	92	宝马	1公里、3350公里、10公里
5′核酸外切酶apollo	DCLRE1B公司	第9小时816分	37.8	50, 53, 61, 66	LMW、MMW、HMW	400
双特异性酪氨酸磷酸化调节（激酶1A激酶域）	DYRK1A公司	问题13627	41.9	39, 94	MMW、宝马	300, 400, 3350
锌磷酸二酯酶ELAC蛋白1	ELAC1系统	Q9H777型	40.7	85, 5, 80, 35, 65	LMW、MMW、宝马	3350，4K
丝裂原活化蛋白激酶1及其抑制剂	ERK2–VTX-11e复合体	第2882页	41.5	28, 47	MMW（毫米波）	—
ETS易位变体1	ETV1–DNA复合物	第50549页	12.4	5, 31, 39, 40, 49, 52, 53, 55, 57, 62, 68, 73, 78, 79, 81, 83, 84, 85, 89, 92, 93, 96	LMW、MMW、HMW、宝马	—
鸟苷酸环化酶可溶性亚基β-1个	GUCY1B3型	企02153	24	40、83	MMW（毫米波）	1公里，3350
糖原1	GYG1公司	第46976页	29.6	1, 4, 8, 11, 13, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 25, 32, 33, 37, 43, 46, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 91, 92, 93, 94, 95, 96	LMW、MMW、HMW、宝马	1500、3350、2K MME、8K
Kelch样蛋白2	KLHL2型	O95198号	30.3	9, 20, 43, 65, 66, 70, 74, 79, 80, 86, 88, 89	LMW、MMW、HMW、宝马	400、3350、4公里、5公里、6公里、8公里
β-类内酰胺酶蛋白2	LACTB2区域	Q53H82型	32.9	21, 27, 41, 52, 59, 64, 76	MMW、HMW、宝马	2千MME、3350、4K、5K MME、6K、10K
蛋氨酸腺苷转移酶I	材料1A	Q00266号	43.7	33, 85	LMW、宝马	3350
甲基丙二酰辅酶A差向异构酶，线粒体	MCEE公司	Q96PE7型	14.4	3, 4, 5, 8, 10, 12, 14, 15, 20, 24, 26, 28, 32, 33, 38, 39, 40, 46, 47, 59, 60, 64, 68, 72, 82, 83, 89, 92, 96	LMW、MMW、HMW、宝马	3350、4K、8K、10K
丙二酰辅酶A脱羧酶，线粒体	MLYCD公司	O95822号	50.4	3, 9, 22, 80, 81, 82, 92	LMW、MMW、宝马	3350、5K MME、6K、8K、10K、20K
P300/CBP相关因子（溴代多巴胺）	PCAF公司	Q92831问题	14.2	11	MMW（毫米波）	3350万
膜相关酪氨酸和苏氨酸特异性CDC2抑制激酶	PKMYT1型	Q99640问题	32	9, 41, 50, 62, 65, 67, 70, 76, 79, 85, 88, 89, 94	LMW、MMW、HMW、宝马	1K、3350
肿瘤蛋白p73样（四聚体结构域）	TP73升	问题9H3D4	7.4	10, 87, 32, 53, 40, 19, 68, 76, 4, 25, 87, 3, 82, 54, 81, 56, 27, 26, 37	LMW、MMW、HMW、宝马	550毫米、1公里、3350毫米、4公里、5公里
国内生产总值-L（左）-岩藻糖合酶	TSTA3公司	问题13630	35.3	3, 15, 38, 60	LMW、HMW	3350、4K、6K、10K
MAP激酶14与TAB1激活肽复合	第38页α–TAB1复合物	问题16539	44.4	9, 75	MMW（毫米波）	3350
细胞周期蛋白G相关激酶（激酶域）	GAK–纳米复合物	O14976号	53.8	15, 22	HMW、宝马	3350、5K MME、10K
RAS相关结构域蛋白3	RASSF3系统	Q86WH2号机组	16.2	47	MMW（毫米波）	4000
RASSF5和MST2的SARAH域复合体	RASSF5–莎拉女士2	Q8WWW0和Q13188	12.3	5, 6, 11, 12, 18, 24, 36, 44, 48, 52, 60, 62, 64, 67, 71, 74, 76, 84, 87, 92, 93	LMW、MMW、HMW、BMW	3350
布鲁姆综合征蛋白	BLM–纳米复合物	第54132页	92.1	79	HMW公司	20公里
Cullin-3和Kelch-like蛋白11	CUL3–KLHL11综合体	Q13618和Q9NVR0	77.3	10, 15, 22, 43, 56, 68, 70, 74	LMW、MMW、HMW、宝马	3350万、10K
含溴多巴胺蛋白9（溴多巴胺）	第9步	Q9H8M2型	14.2	5, 11, 34, 45, 90	LMW、MMW、HMW、宝马	1K、2K MME、3350、6K、8K
溴多巴胺和WD重复序列蛋白1（溴多巴胺）	西部数据报告9	问题9NSI6	14.4	4, 5	LMW公司	3350

图5
四个初级筛选和基于涂片的BCS2筛选在191人重组蛋白结晶测试中的成功率比较。该图显示了四个主屏幕和BCS2屏幕中结晶的蛋白质数量。对于四个主屏幕，蓝色区域表示在基于聚乙二醇的条件下结晶的蛋白质，而粉红色区域表示仅在基于盐的条件下晶化的蛋白质。

图6
从基于涂片的BCS2屏幕获得的示例晶体库。

由于BCS2筛查并不是通过用等效涂片替代初级筛查中的单个PEG来制定的，因此很难直接比较结晶成功率。BCS2筛网和四个主筛网的成功率之间的差距可能是由于实验规模不同，因为与四个主筛中的384种条件相比，BCS2筛只包含96种鸡尾酒。此外，化学空间分析进一步证明，尽管包括11种PEG、14种pH值在4.5至9.5之间的缓冲液和30种添加剂，但仍有一些化学品未在BCS2筛网中取样，但存在于四个主筛网中（图7). 事实上，对仅在四个初级筛选中结晶的49种蛋白质结晶条件的化学分析表明，BCS2筛选中的大多数缺失成分是促进这些情况下晶体生长的基本因素。因此，BCS2筛选对这49种蛋白质无效的一个原因可能是缺乏这种化学空间覆盖，包括（i）不同pH值下的缓冲液，如柠檬酸盐、三元、双三元和双三元丙烷（15种情况），（ii）盐/添加剂，如柠檬酸铵、氯化镍、柠檬酸钾、，丙二酸钠、硝酸钠、硫酸钠和丁二酸（七种情况），（iii）盐/添加剂和缓冲液的正确组合（十种情况）；（iv）PEG，如PEG 300和20K（两种情况）。考虑到前三个因素，在当前的BCS2筛查中实施另一个独立的基于涂片的筛查，扩大化学空间覆盖范围，可能会缩小基于涂片筛查和四个主要筛查之间观察到的成功率差距。总的来说，结果表明，新定义的涂片可能会降低PEG变量和偏差，在有限的一组实验中，通过增强PEG和化学空间，有助于形成初始结晶筛。

图7
BCS2和四个主屏幕之间的化学空间覆盖率比较。

3.4. 案例研究

3.4.1. 晶体生长的新条件

磷酸甘油变位酶5人磷酸甘油酸变位酶5（PGAM5）是一种线粒体蛋白，属于磷酸甘油酸变位酶（PGAM）家族，具有Ser/Tr磷酸酶活性（武田等。, 2009 ). 未能结晶催化域使用这四个主要筛查导致了随后的基于涂片筛查的试验，在pH值为6.5–8.0的MMW、HMW和BMW涂片条件下，意外地获得了大量点击。只有MMW和BMW鸡尾酒中生长的晶体发生衍射；然而，衍射没有超过3的改善通过改变涂抹浓度和pH范围，在几轮典型的优化过程中获得Å分辨率。我们假设这可能是由于沉淀剂的异质性造成的，因此尝试去卷积涂片中单个PEG成分的影响。我们发现实际上只有PEG 3350和PEG 5K MME促进了晶体生长（图8一). 虽然我们能够稍微提高晶体质量，但衍射分辨率的限制仍然存在，这可能是由于液滴中大量成核位置导致的晶体尺寸较小（图8b条). 然后，我们将两个单一的PEG混合，形成一个特定的涂片，有趣的是，该涂片是最有效的沉淀剂，能够可靠地生成衍射到高分辨率的大晶体（图8b条和8c（c）). 此外，这种特异性涂片也适用于野生型和突变配体复合物（PDB条目）的结晶3倍和30万吨; 结构基因组学联合会，未出版作品；图8b条).

图8
使用PEG涂片结晶PGAM5。(一)MMW和BMW涂片被确定为有效沉淀剂后，使用单个PEG进行反褶积筛选，确定两个PEG，即PEG 3350和PEG 5K MME，作为涂片中促进晶体生长的有效成分。与两个单一PEG相比，混合这两个PEG获得的特定涂片显示出对野生型（WT）蛋白、野生型配体复合物和突变的结晶生长更大的功效，晶体形态的变化证明了这一点(b条)以及收集的X射线衍射数据的质量和分辨率(c（c）).

ETV1与DNA复合物ETS易位变异体1（ETV1）的DNA结合域在各种条件下容易结晶，但很难获得ETV1与DNA复合物的晶体，从我们的四个主要筛选中没有发现令人信服的结果。包含LMW涂片的基于涂片的疾病，0.1 M（M）Tris pH值8.5,0.2 M（M）NaCl和5%甘油生成了衍射质量的晶体复合物，导致结构测定第2.9页分辨率（PDB条目40亿; 库珀等。, 2015 ). 对这种有效条件的成分分析表明，在主筛的几杯鸡尾酒中使用了类似的化学品，即低分子量聚乙二醇、碱性pH值和单价盐，尽管结晶结果不成功。这表明在一级筛选中对PEG特性进行了不充分的取样，并对PEG涂片和/或多种盐/添加剂的益处进行了正确的组合。

3.4.2. 改善衍射质量的PEG涂片条件识别

MMAA公司线粒体甲基丙二酸尿症A型（MMAA）的晶体在四个主要筛网中存在的多种条件下容易生长，这四个筛网含有PEG 6K或PEG 10K作为沉淀剂、pH值为6–7的双三缓冲液和二价或一价氯盐。然而，超过3.5的衍射没有改善 Å分辨率是在经过精心设计的优化策略后获得的（图9一). 基于涂片筛选的试验表明，LMW和MMW涂片是有效的沉淀剂，前者产生的初始晶体将X射线衍射至～3.2 奥分辨率。对最佳条件进行简单优化，包括添加硝酸铵的LMW涂片，并用二甲氨基甲酸盐缓冲至pH 5.0，得到衍射为2.6的晶体分辨率（图9一; 弗罗泽等。, 2010 ). 有趣的是，该结构揭示了蛋白质-蛋白质界面上许多低分子量PEG分子的相互作用，表明低分子量聚乙二醇组分（PDB入口）的稳定和成核特性第二个网址).

图9
改善涂抹式屏幕中生长的晶体的衍射质量。MMAA晶体的形貌与X射线衍射质量的比较(一)和CDKL5(b条)从单一聚乙二醇基础和涂片基础条件中获得。(c（c）)在有效的涂片条件下生长的RASSF3晶体的质量与单个PEG条件下的晶体的质量相比，无论是否加入涂片鸡尾酒中的柠檬酸缓冲液。详见正文。

CDKL5型PEG 20K和MES缓冲液pH 5–6的混合物被确定为从四个初级筛选中结晶周期素依赖性激酶样5（CDKL5）的最有效条件。然而，薄片状单斜晶体的衍射质量仍然很差，分辨率极限为3.0 奥（图9b条). 从基于涂片的筛查的几杯鸡尾酒中也发现了结晶现象，其中包括（i）MMW涂片，0.1 M（M）Tris pH 8.0，0.075 M（M）醋酸钠，0.15 M（M）氯化钠；（ii）MMW涂片，0.1 M（M）双三丙烷pH值8.0，0.01 M（M）氯化钴₂, 0.2 M（M）氯化镁₂，2%甘油；（iii）MMW涂片，0.1 M（M）bicine pH 9.3；（iv）MMW涂片，0.1 M（M）HEPES pH 7.2，7%丁二酸盐；和（v）HMW涂片，0.1 M（M）Tris pH 8.0，0.2 M（M）氯化镁₂，10%甘油。对以往单一PEG基础和涂片基础条件的比较表明，PEG的MMW类别和基本pH值是与主要筛查确定的初始条件的主要差异。有趣的是，这些基于涂片的鸡尾酒改变了晶体的形态，使其成为具有正交结构的棒状Bravais晶格并将衍射大大提高到2 分辨率（PDB条目4bgq码; 图9b条; 结构基因组学联合会，未发表的工作）。这种情况支持使用含有多种盐/添加剂的PEG涂抹物在初始结晶中对更大的化学空间进行采样的实用性。

RASSF3系统RASSF3的RAS相关结构域有两个结晶点，包括（i）PEG 4K，0.2 M（M）硫酸铵和（ii）MMW涂片，0.1 M（M）柠檬酸盐pH 5.5，0.1 M（M）硫酸铵，0.05 M（M）硫酸镁₄从这两种条件下获得的晶体的形态不同：含有PEG 4K的条件下的针状晶体和MMW涂片中的棒状晶体（图9c（c）). 在基于PEG 4K的条件下进行了几轮优化后，尽管补充了柠檬酸缓冲液（涂片条件下的主要不同成分之一）后形态有所改善，但衍射质量仍然很差。为了进行比较，从涂片条件下获得的棒状晶体产生了约2.6的X射线衍射分辨率（图9c（c）). 这个例子进一步证明了PEG涂片作为一种定义的沉淀剂用于改善晶体质量。

3.4.3. 增强的化学空间有助于寻找替代的晶体形式

无人值守地面传感器UDP-葡萄糖脱氢酶（UGDH）在菱形和单斜晶格中的两个初始三元结构揭示了六聚酶在封闭状态下的两个结构域（Egger等。, 2011). 以开放状态载脂蛋白形式或仅结合辅因子或底物的形式结晶蛋白质的尝试不仅在以前使用的条件下失败，而且在四个主要筛选中也失败。有趣的是，这些形式的酶在两种基于涂片的条件下容易结晶，这两种条件都包含混合了MES pH 6.0或HEPES pH 7.5和5%甘油的BMW涂片，导致蛋白质在两个新的正交晶格中的不同堆积，显示出两种稍微不同的开放状态（PDB条目3itk公司和3千赫; 艾格等。, 2011, 2012).

第38页α与TAB1肽复合TAB1是一种衔接蛋白，据报道可结合MAP激酶p38并诱导其自身磷酸化α（锗等。, 2002 ). p38晶体α与TAB1肽的复合物在多种条件下容易生长，包括在基于涂片的筛选中，但它们都属于四方Bravais系统（PDB条目4个lop和4个loq). 尽管该结构对激活片段的构象转换提供了一些见解，但由于异常的二聚体组装和潜在的晶体填充偏倚，涉及激活片段介导的接触，结构分析变得复杂。对替代晶体形式的搜索确定了基于涂抹的条件，包括MMW涂抹和0.1 M（M）MES pH 6.5，促进单斜晶体的生长（PDB进入4个厕所). 在这种晶体形式中观察到的单体复合物捕获了蛋白质的生理状态，因此可以对TAB1诱导的自磷酸化机制进行结构解释，没有任何歧义（De Nicola等。，2013年).

ERK2与特定VTX-11e抑制剂复合体野生型ERK2激酶与抑制剂复合体可以在各种条件下容易结晶，包括一些基于涂片的鸡尾酒。晶体通常属于正交晶或单斜晶空间组。然而，我们试图用特定抑制剂VTX-11e使复合物结晶，但在之前已知的条件和四个主要筛选中失败了。有趣的是，这种复合物的晶体是在含有MMW涂片、pH 5.5的二甲氨基甲酸盐和硫酸铵的涂片条件下获得的，这导致了新的六角形堆积空间组（PDB条目第4季度; 柴库德等。, 2014 ). 这些案例证明了基于涂片的筛查在有限的实验空间内识别不同包装和空间组的替代结晶条件的有效性。

4.结论

在确定几种蛋白质的结晶条件方面缺乏成功，这鼓励我们分析在初始筛选过程中常规使用的标准初级筛选的化学空间，揭示了筛选条件化学方面的重大重叠，以及市面上可买到的多种聚乙二醇取样不足。由于对PEG变体进行全面和系统的采样需要较大的筛查小组，因此我们采用了PEG涂片策略，并开发和分析了四种新定义的PEG涂膜类型。我们观察到，使用单一PEG筛选装置无法结晶的蛋白质，结晶成功率很高。所有四种涂片的高结晶效率与之前描述的宽范围涂片相比，表明了在结晶中利用这些混合物的改进方法。此外，减少的涂片筛选对220多种人类重组蛋白的合理结晶成功率证明了这四种定义的涂片的优点，它不仅提供了广泛的聚乙二醇覆盖范围，而且允许通过较少的聚乙二醇变量在有限的鸡尾酒中对其他化学品进行更多采样。在一些情况下，PEG涂片不仅提供了独特的化学性质，还产生了衍射质量更好的晶体和替代晶体填充。利用定义的涂片可以在有限的实验空间内提供一种在初始结晶中进行PEG采样的替代方法。

致谢

SGC是一家注册慈善机构（编号1097737），接受来自AbbVie、拜耳制药公司、Boehringer Ingelheim、加拿大创新基金会、Genome Canada、GlaxoSmithKline、Janssen、Lilly Canada，诺华研究基金会、安大略省经济发展与创新部、辉瑞、，武田和威康信托（092809/Z/10/Z）。AC由欧盟第278568号FP7拨款“PRIMES”（致癌EGF受体信号中的蛋白质相互作用机器）支持。作者感谢珍妮特·纽曼博士深思熟虑的评论和建议，感谢查尔斯·阿勒斯顿博士对手稿的校对。

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