2.1. 蛋白质表达和纯化

编码N末端截断形式（残基42–403；Csd3）的基因_Δ41)第页，共页幽门螺杆菌利用NdeI和XhoI限制性酶位点对Csd3（来自26695菌株的HP0506）进行PCR扩增并克隆到表达载体pET-21a（+）（Novagen）中。该重组蛋白在其C末端与含有六组氨酸的标签（LEHHHHH）融合，在大肠杆菌Rosetta 2（DE3）pLysS细胞。细胞在37°C下在含有50 微克 毫升⁻¹氨苄西林。蛋白表达由0.5诱导 米M（M）异丙基β-D类-1-硫代吡喃半乳糖苷和细胞再培养15个 30°C时为h。细胞在5600℃离心收集克用于15 在4°C条件下保持最小值，然后在冰镇缓冲液中通过超声波进行溶解A类[20 米M（M）Tris–HCl pH值7.9500 米M（M）氯化钠，50 米M（M）咪唑，10%(v（v）/v（v）)甘油]，补充1 米M（M）苯甲基磺酰氟，60 米M（M）氯化铵和15 米M（M）醋酸镁。裂解液在36℃离心 000克对于1 将上清液涂在HiTrap螯合HP亲和色谱柱（GE Healthcare）上，该色谱柱之前与缓冲液平衡A类用咪唑线性梯度从50洗脱柱 米M（M）缓冲区内A类至500 米M（M）缓冲区内B类，包括20个 米M（M）Tris–HCl pH值7.9500 米M（M）氯化钠，500 米M（M）咪唑，10%(v（v）/v（v）)甘油。Csd3蛋白在125−150洗脱 米M（M）通过在HiLoad 16/60 Superdex 200预颗粒色谱柱（GE Healthcare）上的凝胶过滤，在两种不同的盐条件下，使用缓冲液进一步纯化咪唑浓度C类(20 米M（M）Tris–HCl pH值7.9400 米M（M）氯化钠）或缓冲液D类(20 米M（M）Tris–HCl pH值7.9200 米M（M）氯化钠，0.1 米M（M）氯化锌）。两个不同批次的Csd3产生不同的晶体形式，如下所述。经SDS-PAGE分析，纯化的蛋白质是均一的。将含有重组Csd3的组分合并并浓缩至10 毫克 毫升⁻¹(0.24 米M（M）)使用Amicon Ultra-15离心过滤装置（Millipore）进行结晶。

2.2. 结晶

使用蚊子机器人系统（TTP Labtech），采用坐滴式蒸汽扩散法在23°C下生长晶体。在不同的结晶条件下，我们获得了两种类型的天然晶体（形式1和形式2）。对于形态1晶体，通过混合0.4制备坐液 µl储液罐溶液[160 米M（M）硫酸铵，80 米M（M）醋酸钠pH 4.6，20%(v（v）/v（v）)聚乙二醇4000，20%(v（v）/v（v）)甘油]和0.4 缓冲液中的µl纯化蛋白C类.长方形晶体伸长，尺寸约为0.3×0.3×0.3 几天内。对于形态2晶体，重组Csd3_Δ41缓冲液中纯化的蛋白质D类用缓冲液预先培养D类补充1 米M（M）氯化锌在冰下30分钟 结晶设置前的min。通过混合0.3制备坐液 µl储液罐溶液[200 米M（M）磷酸氢二铵，pH 7.9，20%(v（v）/v（v）)PEG 3350]和0.3 µl蛋白质溶液。六角双锥晶体的尺寸约为0.2×0.2×0.3 几天内。

2.3. X射线数据采集和结构测定

使用ADSC Q315 CCD探测器在日本Photon Factory的光束线BL-5A上收集本地X射线衍射数据，使用DIP6040成像板/CCD混合探测器在日本SPring-8的光束线上收集本地X光衍射数据（表1). 形态1晶体在100的氮气气流中闪蒸冷却 K.他们衍射到2.0 Å分辨率，属于空间组 对2₁2₁2₁，带有晶胞参数一= 62.6,b条= 112.1,c（c）= 112.9 Å. 假设在非对称单元，马修斯系数和溶剂含量为2.33 Å^三 Da公司⁻¹分别为47.2%。将2型晶体在由补充25%的储液器溶液组成的冷冻保护剂溶液中浸泡数秒(v（v）/v（v）)甘油和在100的氮气气流中闪蒸冷却 K.形态2晶体衍射至1.98 Å分辨率，属于空间组 对6₅22，带单元间参数一=b条= 91.5,c（c）= 187.0 Å. 假设在非对称单元，马修斯系数和溶剂含量为2.65 Å^三 Da公司⁻¹分别为53.6%。

表1 数据收集和精细化统计学 括号中的值表示最高分辨率外壳。 数据集 表格1 表格2 Pt（峰值） 数据收集  光束线和光源† BL-5A、PF BL-44XU，S型环-8 BL-7A、PLS  “空间”组 对212121 对6522 对6522  单位-细胞参数   一(Å) 62.6 91.5 92   b条(Å) 112.1 91.5 92   c（c）(Å) 112.9 187 186.5   α=β(°) 90 90 90   γ(°) 90 120 120  X射线波长（Ω） 1 0.9000 1.0720  分辨率范围（Ω） 50.0–2.00 (2.03–2.00) 50.0–1.98 (2.01–1.98) 30.0–2.95 (3.00–2.95)  总反射/唯一反射 264154/54371 350996/33042 480902/18708‡  完整性（%） 99.5 (100.0) 99.9 (100.0) 100.0 (100.0)‡  〈我〉/〈σ(我)〉 27.5（2.9） 41.9 (3.5) 64.0 (13.0)‡  R（右）合并§(%) 8.3 (66.9) 8.8 (87.7) 12.9 (58.2)‡  科科斯群岛1/2¶(%) 99.7 (75.9) 99.9 (91.6) 99.9 (92.6) SAD分阶段  优值（密度修改前后）     0.39/0.73 模型细化  PDB代码 第四年 4毫米    分辨率范围（Ω） 50.0–2.00 50.0–1.98    R（右）工作/R（右）自由的††(%) 20.3/25.6 20.8/23.9    非H原子数量   蛋白质 5822 2919     金属离子‡‡ 2 三     水-氧气 225 148     甘油 30 18     硫酸盐离子 45 —     磷酸盐离子 — 15    平均B类系数（Ω2)   蛋白质 37 40.4     金属离子‡‡ 26.1 33.7     水-氧气 34.6 40.8     甘油 49.3 55     硫酸盐离子 2.3 —     磷酸盐离子 — 65    理想几何的R.m.s.偏差   粘结长度（Ω） 0.013 0.009     粘结角度（°） 1.58 1.42    钢筋混凝土。Z轴-分数§§   键长 0.64 0.46     粘合角度 0.73 0.64    拉马钱德兰阴谋¶¶   有利/异常值（%） 96.9/0.0 96.3/0.0     转子流量计不良（%） 0.16 0   †PF，日本光子工厂；PLS，浦项光源，大韩民国。 Friedel对被视为单独的观察结果。 §R（右）合并=，其中我(香港特别行政区)是反射的强度香港特别行政区，是所有反射和总数结束了吗我反射测量香港特别行政区. ¶抄送1/2是相关系数两个随机半组数据之间的平均强度。 ††R（右）工作=，其中R（右）自由的是针对随机选择的未用于结构的5%反射进行计算的精细化和R（右）工作计算剩余反射。 形态1中的两种金属离子为Zn2+Csd3两链活性中心的离子Δ41.表2包含Zn2+活性部位的离子，可能含有两个镍2+与C-末端六组氨酸标记结合的离子。 §§使用REFMAC公司5 ¶¶使用获得的值摩尔概率.

硒代蛋氨酸取代Csd3_Δ41蛋白质在大肠杆菌因此，我们通过将其浸泡3次，制备了形式为2的铂衍生物晶体 2分钟 µl含重原子的冷冻保护剂溶液，由添加25%的储液溶液组成(v（v）/v（v）)甘油和30 米M（M）K（K）₂氯化铂₄单波长异常衍射（SAD）数据是在100 K来自波长为1.0720的铂衍生物晶体 在韩国浦项光源BL-7A实验站使用ADSC Q270 CCD探测器。使用香港（HKL）-2000程序集（Otwinowski&Minor，1997). SAD阶段的计算使用自动解决方案来自菲尼克斯软件包（Adams等。, 2010)并通过以下措施进一步改进RESOLVE（解决）（特威利格，2003年)，得出2.95的可解释电子密度图 奥分辨率。阶段统计见表1.

2.4. 建模和细化

RESOLVE（解决）也用于自动构建，这导致了初始模型占重组多肽链中约38%的残基，并分配了大部分序列。使用形态2晶体的精细模型作为搜索模型来确定Csd3_Δ41晶体形式1的结构分子置换利用MOLREP公司（Vagin和Teplyakov，2010年). 手动建模使用库特（埃姆斯利等。, 2010)模型经过了改进REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011)包括散装固体校正。总共5%的数据被随机留作测试数据，用于计算R（右）_自由的（布伦格，1992年). 精制模型的立体化学通过以下方法进行评估摩尔概率（陈）等。, 2010).精炼统计如表1所示.

2.5. 反常散射法识别结合金属离子

测试金属结合部位是否被锌占据²⁺离子，SAD数据是在100℃时从形态1和形态2晶体中收集的 K，X射线波长1.2820 浦项光源光束线5C上的¦∏（补充表S1）。异常差异图使用快速傅里叶变换（Immirzi，1966年; Ten Eyck，1973年)来自中央处理器4软件包。

2.6. 平衡沉降

平衡沉降实验是使用Beckman ProteomeLab XL-a分析超离心机在缓冲液中进行的C类温度为4°C。重组Csd3_Δ41通过测量280的吸光度来监测蛋白质样品 使用六扇形电池在三个转子速度（12 000, 14 000和18 000 转速 最小值⁻¹，对应9660，13 148和21 734克分别为6.0 cm半径）和三种不同的蛋白质浓度（3.77、5.03和6.29 µM（M）). 重组Csd3的蛋白质浓度_Δ41使用估算∊_280 纳米= 39 770 M（M）⁻¹ 厘米⁻¹分子质量为42 562 Da，包括C末端六组氨酸标签。这个部分比容蛋白质和缓冲液密度的计算方法如下塞登特普（劳厄等。, 1992). 通过数学建模进行进一步的数据操作和数据分析，使用MLAB公司（诺特，1979年).

2.7. 接入代码

坐标和结构因子已以登录代码存放在蛋白质数据库中第四年和4毫米分别用于形式1和形式2晶体。

3.1.结构确定Csd3的

幽门螺杆菌当Csd3序列由TMHMM公司服务器2.0版（Krogh等。, 2001). 因此，我们最初过度表达了由29–403个残基组成的结构，这些残基融合到一个含有C末端六组氨酸的标签上大肠杆菌表达蛋白结晶。然而，晶体衍射较差至低分辨率（～4 尽管对结晶条件进行了广泛的筛选。这促使我们尝试过表达一些较短的结构体，包括残基40-403、40-397、40-393、40-390、42-403、42-397、42-393、42-390、45-403、45-397、45-393和45-390。其中，只有N端41位截断的Csd3（Csd3_Δ41)由残基42–403组成的晶体以可溶性形式表达，并产生两种不同形式的衍射良好的晶体（正交形式1和六角形形式2）（表1).

我们已经确定了Csd3的结构_Δ41（图1)使用来自铂衍生2型晶体的SAD数据。形式2晶体的模型在1.98时进行了细化 λ分辨率为R（右）_工作和R（右）_自由的分别为20.8%和23.9%（表1). 形态2晶体含有一个Csd3单体_Δ41在中非对称单元。Csd3的这个模型_Δ41排除金属结合位点附近无序环中的六个残基（Pro251–Arg256），以及四个残基Gly333–Thr336和两个组氨酸位于C末端亲和标记的末端。形式1晶体的模型在2.00时进行了细化 λ分辨率为R（右）_工作和R（右）_自由的分别为20.3%和25.6%（表1). 形式1晶体包含两个单体（链A类和B类)Csd3的_Δ41在中非对称单元。链A类和B类由非晶体学双重对称性联系在一起。在两条链条中A类和B类，四个残基Gly333–Thr336和C末端亲和标记（LEHHHHH）被扰乱。链A类和B类彼此非常相似，均方根误差为0.67 359 C时为^α原子。然而，它们与形式2晶体链的结构偏差较大，均方根偏差为1.61和1.85 Å表示353摄氏度^α链中的原子A类和B类分别是。最大偏差发生在η1和α6个螺旋，偏差为6.65和5.58 奥在C^αPro167和Gly366的原子（补充图S1）。观察到的结构变化可能是由于这些区域固有的灵活性以及不同的晶体接触。

图1 整体单体结构和拓扑幽门螺杆菌Csd3型Δ41(一)Csd3的功能区图Δ41单体（链A类形式1），并标记二级结构元素。域1、域2的核心和LytM域分别以亮橙色、天蓝色和红色显示。C-­终端α-螺旋线(α6） 和β-绞线(β22）是蓝色的。绿色球体是Zn2+离子。金属配位残基的侧链（Glu74、His259、Asp263和His341）显示在棒状模型中（深灰色）。二级结构定义如下STRIDE（步态）（Heinig&Frishman，2004年). LytM域中活性位点的壁由四个环组成：环I（β12–β13回路），回路II（β15–β16回路），回路III（β19–β20回路）和回路IV（β20–β21回路）。(b条)的域幽门螺杆菌Csd3颜色如(一). TM，跨膜螺旋线。残留指示每个域的数字。(c（c）)Csd3的拓扑图Δ41颜色如中所示(一).α-螺旋，β-股，310-螺旋线和回路分别显示为圆柱体、箭头、圆和实线。结构图使用PyMOL公司（德拉诺，2002).

3.2. Csd3的寡聚状态_Δ41溶液中

在形式1晶体中非对称单元埋藏相对较大的1130表面积 Ų每个单体（单体表面积的6.0%），而形式2晶体的最大埋表面积为710 Ų每个单体（单体表面积的3.8%）。大部分晶体界面的面积小于1000 Ų，很少有代表超过该值（Duarte等。, 2012). 众所周知，生物界面往往呈现大面积，大多数情况下面积为1000 Ų及以上（杜阿尔特等。, 2012). 这对Csd3的寡聚状态提出了一个问题_Δ41溶液中。因此，我们平衡沉降实验。所有测量数据均符合均相单体模型，表明Csd3_Δ41以单体形式存在于浓度高达6.29的溶液中 µM（M）在18岁时测得的代表性结果 000 转速 最小值⁻¹使用蛋白质浓度3.77 µM（M）如补充图S2所示。

3.3. Csd3的三域结构_Δ41和结构相似性搜索

Csd3的结构_Δ41可分为三个结构域：结构域1（残基Glu42–Ile124）、结构域2（残基Ile125–Gly228和Ala360–Phe403）和LytM结构域（残基Phe229–Thr359）（图1). 使用DALI公司服务器（Holm&Rosenström，2010)揭示了整个结构（形成1个晶体，链A类)Csd3的_Δ41类似于来自脑膜炎奈瑟菌（NMB0315；PDB条目3路; 王等。, 2011; 均方根偏差5.2 对于315当量C，为^α位置，Z轴-得分为21.7，序列一致性为26%）和推测的溶葡萄球菌肽酶霍乱弧菌（VC0503；PDB条目2个单元1; 拉古马尼等。, 2008; 均方根偏差4.5 奥表示219当量C^α位置，Z轴-得分为18.8分，序列一致性为23%）（图2和补充图S3）。上述两个蛋白质是三域蛋白质，但由于结构域排列的巨大差异，VC0503的结构域2不包括在结构重叠中。它们属于M23B金属肽酶家族（Wang等。, 2011; 拉古马尼等。, 2008).

图2 四种M23B金属肽酶蛋白的序列比对。Csd3序列比对幽门螺杆菌菌株26695（HP0506；HP_Csd3；SWISS-PROT登录代码O25247），NMB0315来自脑膜炎双球菌（NMB_0315；Q9K163），VC0503来自霍乱弧菌（VC_0503；Q9KUL5）和LytM来自金黄色葡萄球菌（SA_LytM；O33599）。红色三角形表示H中的保守残基xxx个D和Hx个H图案（H259-xxx个-D263和H339-x个-H341英寸幽门螺杆菌Csd3）对金属肽酶活性很重要。四个回路用灰色方框表示。

Csd3的域1具有α/β由五股反平行分子组成的折叠β-薄板(β1↓–β2↑–β三↓–β4↑–β5↓）少了三个α-螺旋（图1). 一组连续相连的螺旋线(α1–α2–α3） 插入绞线之间β1和β2，包装在β-表。域2（Ile125–Gly228）的核心还具有α/β由六股反平行分子组成的折叠β-薄板(β6↓–β7↑–β8↓–β9↑–β10↓–β11↑) 和三个短螺旋（图1). 在域1中，一组连续连接的螺旋线(α4–α5–η1） 插入绞线之间β6和β7，位于β-表。尽管氨基酸序列同源性很低，但结构域1和结构域2的核心似乎共享一个共同的折叠（补充图S4一). 然而，它们在表面上的电荷分布彼此不同（补充图S4b条). C端螺旋(α6） 和β-绞线(β22）从LytM域突出的部分与域2的核心紧密相关，覆盖了β-板材和延伸β-片材。

当DALI公司对结构域1（1型晶体，链A类)，从VC0503和NMB0315中观察到的相应结构域的结构相似性最高Z轴-得分分别为7.6分和5.0分。除此之外，域1与单链莫奈林（PDB条目1毫升; 李等。, 1999)，带有Z轴-得分为4.2，人类胱抑素A（也称为stefin A；PDB条目3公里/小时，链条D类; M.Renko和D.Turk，未出版作品）Z轴-3.5分。当DALI公司分别对畴2（晶型1晶体，链）的核心进行搜索A类)，从VC0503和NMB0315中观察到的相应结构域的结构相似性最高Z轴-得分分别为14.6分和14.5分。除此之外，结构域2与来自薰衣草K1（PDB入口4磅/平方英寸; 加莱等。, 2014)和来自产气荚膜梭菌（PDB条目1立方米; J.Rossjohn，M.Parker，G.Polekhina，S.Feil&R.Tweten，未出版作品）Z轴-得分分别为4.5分和4.4分。

Csd3 LytM结构域的大部分被折叠成两层三明治，由一个较大的七个品牌的反平行结构组成β-薄板(β12↑–β13↓–β20↑–β17↓–β16↑–β15↓–β18↑) 还有一个较小的三股反平行天线β-薄板(β14↓–β19↑–β17↓). 这些β-床单共用一条长绳(β17） ，弯曲得像字母J。另一根长绳(β20） 与短股关联(β21）形成一个小的、反平行的β-薄板(β20↑–β21↓), 后面是3₁₀-螺旋线(η3） （图1). 正如预期的那样，LytM结构域（1型晶体，链A类)Csd3的_Δ41与M23B金属肽酶的相应结构域，如NMB0315（PDB条目3路; 均方根偏差2.8 123当量C的^α位置，Z轴-得分为19.7，序列一致性为44%）和VC0503（PDB条目2个单元1; 均方根偏差2.7 120当量C时为^α位置，Z轴-得分为19.0，序列一致性为35%）。它在结构上也类似于金黄色葡萄球菌甘氨酰甘氨酸内肽酶，另一种M23B金属肽酶（PDB条目2013年2月; Firczuk公司等。, 2005; 均方根偏差1.9 118当量C的^α位置，Z轴-得分为18.3，序列一致性为30%），毒力因子LasA来自铜绿假单胞菌，M23A金属肽酶（PDB条目3它7; 斯宾塞等。, 2010; 均方根偏差2.1 对于107当量C，为^α位置，Z轴-得分为11.4分，序列一致性为21%）。M23A金属肽酶与更多的M23B酶的区别在于其结构特征，包括二硫键和具有额外的C末端亚结构域，以及活性位点区域的改变，表现为H的His和Asp残基之间的序列间距的差异xxx个M23B家族的D主题（Spencer等。, 2010). 在M23A金属肽酶中，干预序列是可变的，并且比M23B的干预序列长几倍。

离开LytM结构域后，多肽链连接到C末端α-螺旋线(α6） 和一个短β-绞线(β22）折叠回域2的核心，与域2的内核紧密交互（图3). 这个α6螺旋位于β-三螺旋簇的第二域片(α4–α5–η1） 并牢牢固定在β-通过疏水和氢键相互作用形成薄片（图3). 这个β22股与β域2的6条链，形成β-域2核心中的薄板（图3). C端子α6–β22区可能在稳定结构域2核心和Csd3 LytM结构域的畴间取向方面起着重要作用。

图3 Csd3中的金属配位Δ41以及C端的相互作用α-螺旋线(α6） 和β-绞线(β22）以域2为核心。Csd3的带状图Δ41单体，着色如图1所示(一)，显示在中间。左侧的特写视图表示C端子绞线的相互作用(β22）使用β域2（顶部）和C端螺旋的核心中的6股(α6） 使用β-片位于域2的核心（底部）。氢键相互作用显示为黑色虚线。右侧的特写视图表示Zn的带状图2+-结合基序（顶部）和由LytM域（底部）的四个环形成的基板结合槽的表面表示。Zn的电子密度2+OMIT中的离子毫发o个−DF公司c（c）地图显示为浅粉色网格（轮廓为10σ). 为了更清楚地显示详细的交互，特写视图的方向略有不同。

3.4. LytM域的活性位点结构

Csd3-LytM结构域具有金属肽酶MEROPS M23家族的特征。在这些酶中，催化残基由较大的反平行分子锚定β-片状，并围绕金属离子分组（图3, 4和5). 我们证实，这个金属结合位点确实被锌占据²⁺利用锌的异常数据计算异常差异图吸收边缘第页，共1.2820页 ？（补充表S1和补充图S5）。在所有Csd3中_Δ41我们观察到四配位锌的结构²⁺活性部位的离子，带有预期的三个氨基酸配体（His259^∊2，阿斯普263^δ1和His341^δ1)和一个氨基酸配体（Glu74^∊2)来自α3域1的螺旋（图3). His259和Asp263属于特征H（H）xxx个D类基序，而His341是H的第二组氨酸x个H（H）动机。金属-配体原子距离在1.95–2.11之间 Oh，与典型Zn一致²⁺离子-配体原子距离。锌²⁺-配位基团通过与相邻氨基酸残基或水分子形成氢键来稳定。His259号^δ1和His341^∊2分别与Pro243的主链O原子和水分子氢键结合。谷氨酸74^∊1氢键合到His306^∊2Csd3的His306在M23B肽酶蛋白中保守（图2)以及相应的残基与金属离子的第四配体类似地相互作用。例如，NMB0315中的His343与水分子形成氢键（图5)而His260在活跃的LytM金黄色葡萄球菌与磷酸盐离子形成氢键。如果Csd3处于肽酶活性的活性状态，则两个水分子应占据靠近Glu74侧链O原子的位置，因为五配位被认为与催化机制的建议一致（Sabala等。, 2014).

图4 Csd3的LytM域。(一)Csd3的LytM畴静电势面的两种不同观点。表面上的正静电势和负静电势分别为蓝色和红色。围绕Zn形成基板结合槽的四个回路2+离子（绿色球体）由回路I–IV表示。(b条)四种M23B金属肽酶中LytM结构域的重叠。的LytM域幽门螺杆菌Csd3（红色），脑膜炎双球菌NMB0315（浅绿色；PDB入口3路),霍乱弧菌VC0503（天蓝色；PDB条目2个单元1)和金黄色葡萄球菌LytM（黄色/橙色；PDB条目第1季度)重叠并显示为带状图。

图5 M23B金属肽酶活性部位的保守残基。(一)两种晶体形式中LytM畴的重叠幽门螺杆菌Csd3.链条A类形态1晶体（红色）和形态2晶体（粉红色）如带状图所示。(b条)两个M23B家族成员（NMB0315和VC0503）中LytM域的叠加，着色如图4所示(b条). 保存的残留物显示为棒状模型，并进行标记（顶部为NMB0315，底部为VC0503）。金属离子和水分子分别显示为绿色球体和蓝色圆点。在NMB0315中，Zn2+离子被镍取代2+离子在亲和层析（王）等。, 2011). NMB0315中存在Wat-1和Wat-2，其中Ni2+离子是五配位的。黑色虚线表示NMB0315中Wat-1的氢键。在VC0503中，Zn2+离子是四配位的，在Wat-1和Wat-2之间有一个水分子（为了清楚起见省略了）。

在Csd3中，Zn之间的距离²⁺和来自Glu74（Glu74）侧链的两个O原子^∊1和Glu74^∊2)分别为2.9和2.0 分别为：。这种协调不同于LasA非复杂结构中的协调铜绿假单胞菌（斯宾塞等。, 2010). 锌²⁺LasA非折叠结构中的离子被描述为具有三个保守金属配体和两个保守水分子的五配位（具有略微扭曲的三角双锥几何结构）。Zn之间的距离²⁺水O原子（Wat-1和Wat-2）分别为2.1和2.7 分别为：。在LasA的酒石酸络合物结构中，酒石酸氧原子与Zn占据几乎相同的位置²⁺-配位水分子，锌之间的距离²⁺酒石酸氧原子为2.5和2.1 分别为：。然而，锌²⁺酒石酸盐复合结构中的配位被描述为四面体几何（斯宾塞等。, 2010). 有人认为五配位与许多关于催化机理的建议是一致的，并且对可变Zn的观察结果²⁺特征M23家族金属肽酶之间的协同作用可能反映了锌变化的低能量屏障²⁺催化配位（萨巴拉等。, 2014; 斯宾塞等。, 2010).

LytM域基底结合槽的底板由较大的β-活动场地的板材和墙壁由四个回路组成：回路I（β12–β13回路），回路II（β15–β16回路），回路III（β19–β20回路）和回路IV（β20–β21回路）（图2, 3和4). Csd3的LytM结构域与NMB0315、VC0503和金黄色葡萄球菌LytM揭示了β-薄片之间的偏差很小，但回路I–IV的差异更大（图4b条). Csd3的第一环显示了同源物之间最显著的偏差。在形态1晶体中，它通过形成硫酸盐介导的盐桥参与晶体-填充相互作用（补充图S6）。在形态2晶体中，它不参与晶体堆积，而是无序的。因此，我们得出结论，观察到的回路I的结构差异很大程度上是由于晶体排列的差异以及其固有的灵活性。在Csd3的所有结构中_Δ41，环III的三个残基（Gly333-Leu334-Ser335）被无序化。环III具有显著的序列守恒，并且紧挨着Hx个H图案（图2). Csd3的Gly333和Ser335是保守的，而Csd3中的Leu334在NMB0315和VC0503中分别被Arg368和Arg365取代，在金黄色葡萄球菌LytM（图2). 在来自的活动LytM的结构中金黄色葡萄球菌（PDB条目2b44页)，磷酸根离子作为底物候选，通过多个氢键与Asn286（Firczuk等。, 2005). NMB0315的Ser369和来自金黄色葡萄球菌对应于Csd3环III中的无序Ser335，与H的第一组氨酸相互作用x个H图案。这种组氨酸被认为是锌配位的催化残留物²⁺-结合水分子作为亲核剂水解反应中（斯宾塞等。, 2010). 有趣的是，Csd3的His339侧链，H的第一个组氨酸x个H图案显示了两种不同的方向。它在形式2晶体中的取向与其他同源蛋白质中的取向相似（图5). 然而，它以1晶体的形式向溶剂翻转约104°（图5).

3.5. 结构域1阻断LytM结构域的活性位点

在形态1和形态2晶体中，结构域1阻断了LytM结构域的活性位点分裂（图6)，带有突出的螺旋α3对锌有贡献²⁺协调范围。域1中的几个带负电残基（Asp72、Glu74、Glu78和Asp105）和带正电的残基（Arg257、Arg301和Arg349）以及Zn²⁺来自LytM结构域的离子在这些结构域之间的界面上形成强烈的盐桥。如上所述²⁺LytM结构域活性位点中的离子由三个保守的残基（H的His259和Asp263）四面体配位xxx个D基序和H的第二组氨酸His341x个LytM结构域的H基序以及螺旋中的非融合Glu74α域1的3。Glu74和LytM结构域的保守His306之间存在氢键。Asp72通过形成盐桥与LytM域环I中的Arg257相互作用。Glu78与Arg301在βLytM结构域的17链；它还与LytM结构域环II中的Tyr289形成氢键。此外，Asp105在β3–β域1的4环路与Arg349在βLytM结构域的21条链。Tyr65位于α域1的2螺旋与LytM域环II中Gly288的主链N原子形成氢键。中的Ser103β3–β域1的4环在βLytM域的13条链。基于结构域1和LytM结构域之间的广泛相互作用，我们认为Csd3_Δ41在晶体中处于自动禁止状态。这类似于在抑制构象状态下结构相关的三域蛋白中的N-末端片段对活性位点的阻断（补充图S7）。在NMB0315中，N端子短路β3–β4个环路延伸到活动站点并与催化域（王）等。, 2011). 在VC0503中，N端螺旋(α2） 占据活动部位裂缝（拉古马尼等。, 2008). 在这两种情况下，环或螺旋不参与金属配位。

图6 Csd3 LytM域的活动站点被域1阻止。在此图中，为了清楚起见，省略了域2。(一)Csd3的结构域1（显示为亮橙色条带）和LytM结构域（显示为灰色表面图）之间相互作用的两个不同视图。(b条)域1的静电表面图和LytM域的带状图（深蓝色）。位于域界面的LytM域的剩余物显示为棒状模型并进行标记。(c（c）)域1（亮橙色）和LytM域（深蓝色）的带状图。域界面处的残留物显示为棒状模型。氢键相互作用和盐桥相互作用分别用红色和黑色虚线表示。

锌²⁺与Csd3活性中心结合的离子由四个残基（Glu74、His259、Asp263和His341）的侧链四面体配位，没有任何有序的水分子。Glu74不保守，而His259、Asp263和His341保守（图2). 与非配体Glu74相对应的配体位置通常由催化水分子或其他M23金属肽酶活性形式的各种阴离子占据（补充图S7）。如果LytM来自金黄色葡萄球菌，缺少Asn117的截断版本具有更高的比活度与全长酶相比，其抑制结构域中保守度低的Asn117占据Zn的一个配体位点²⁺（奥廷索夫等。, 2004). 在活动的、截断的LytM中金黄色葡萄球菌，Asn117被结晶缓冲液（Firczuk）中的磷酸盐、二羧酸盐或酒石酸盐取代等。, 2005).