2.1. 材料

溶菌酶（目录号2933，批号36P9210）购自美国新泽西州莱克伍德市沃辛顿生化公司(R（右）)-MPD和(S公司)-MPD由德国弗莱堡Reuter Chemische Apparetebau KG合成。(RS系列)-MPD（目录号68340，批号1345630）购自美国密苏里州圣路易斯Sigma–Aldrich。Tris碱（目录号BP512-500）、叠氮化钠（目录号S227I-500）和盐酸（目录号A144S-500）购于美国宾夕法尼亚州匹兹堡Fisher Scientific。所有材料均在未经进一步净化的情况下使用。蛋白质和化学物质的纯度对映体纯度第页，共页(R（右）)-, (S公司)-和(RS系列)-MPD的确定如支持信息所述。去离子水来自Integral 3去离子系统（美国马萨诸塞州比勒里卡市Millipore）。溶液通过Nalgene一次性0.22过滤 使用前使用µm过滤装置（美国纽约州罗切斯特Nalge Nunc International）。

浓度测量是在Beckman–Coulter DU800分光光度计上通过UV–Vis消光光谱法进行的。溶菌酶在280时的消光系数 nm被视为∊^0.1%= 2.64 毫克 毫升⁻¹ 厘米⁻¹（Aune&Tanford，1969年). 使用带有DuraProbe电导率池和ROSS Sure Flow pH电极（Thermo Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）的Orion 4-Star电导率和pH计进行电导率和pH测量。

2.2. 蛋白质结晶

溶菌酶于200年溶解 米M（M）Tris（用HCl滴定至pH 8.0；σ= 9.90 毫秒 厘米⁻¹)，在Amicon Ultra-4离心过滤装置中的同一缓冲液中用3 kDa分子量截止值（Millipore，Billerica，Massachusetts，USA），然后浓缩至约35 毫克 毫升⁻¹晶体是在EasyXtal 15-Well Tool（目录号132006；美国加利福尼亚州巴伦西亚市齐根市）中使用吊滴蒸汽扩散法生长的。混合10滴 10µl蛋白质溶液 µl储液罐溶液。这个混合物被短暂地旋涡，三个5 然后将微升液滴分配到结晶载体上。储液罐溶液（300 µl）为60%(v（v）/v（v）) (R（右）)-, (S公司)-或(RS系列)-水中MPD。还进行了水库中水的控制试验。将结晶托盘放置在4.0±0.5°C的温度下，并使用AxioImager A1m显微镜（德国哥廷根卡尔蔡司公司）通过亮场显微镜定期检查结晶托盘。约200个晶体 μm的尺寸在大约5年内增长 d带MPD（补充图S1）；类似大小的晶体在对照组中生长大约需要两周时间。晶体是用安装的冷冻环采集的（美国加利福尼亚州Aliso Viejo的Hampton Research）。除对照组中生长的晶体外，未使用任何冷冻保护剂，在衍射测量之前，将其浸入Paratone N（美国加利福尼亚州Aliso Viejo Hampton Research）中。

2.3. 数据收集，精细化和结构分析

13.5至15.1年间，所有X射线衍射数据均记录在美国纽约厄普顿布鲁克海文国家实验室国家同步辐射光源的光束线X6A上 千伏。所有数据均记录在100 K使用ADSC Q270 CCD探测器（ADCS，美国加利福尼亚州波韦）。数据被编入索引、整合和缩放香港（HKL）-2000（Otwinowski&Minor，1997）). 溶菌酶晶体结构由分子置换使用MOLREP公司（Vagin和Teplyakov，2010年)和PDB条目中的模型1个（绍特等。, 2001). 每个模型都经过了约束最大似然 精细化具有REFMAC公司（穆尔舒多夫等。, 2011; 优胜者等。, 2011)单个各向异性温度系数和人工建筑库特（埃姆斯利等。, 2010). 决赛之后精细化，结构的立体化学用检查（拉斯科夫斯基等。1993年). 所有数据都是用PyMOL公司(https://www.pymol.org).

2.4. 量子化学计算和分子动力学模拟

从头算九星的电子结构计算(R（右）)-MPD符合者1–三（见图2）高斯09（弗里希等。, 2009). 使用二阶Möller–Plesset微扰（MP2）方法，在量子化学理论的适度水平上，这九个构象的局域势能面上定位了驻点（Möler&Plesset，1934)和6-311++G（d，p）中等基数（克拉克等。, 1983)为C、H和O原子设置。使用了程序包默认值，包括波函数收敛准则和势面上驻点的位置。九个初始输入结构是定性的结果构象分析所有交错构象的可能性(R（右）)-MPD公司。Conformer公司1a个假设为分子内氢键；我们之所以能够专注于单一构象，是因为关于C-O键的不同分子内氢键结合转子异构体的几何优化能量相差不到1 千焦 摩尔⁻¹如预期，C4处的构型反转(S公司)-MPD给出了相同的计算结果。

我们在量子化学理论的同一水平上考察了水溶剂化对相对构象能的影响，在极化连续体模型（PCM）中加入了默认积分方程形式变量（IEF），用于将溶质放置在溶剂反应场（SCRF；Tomasi等。, 2005).

两者的分子动力学模拟(R（右）)-MPD和(S公司)-MPD使用格罗马克v.4.0.5（赫斯等。, 2008). 的初始坐标(R（右）)-和(S公司)-MPD取自PDB条目4b4e和第4页第4页分别使用个人数字广播2gmx公司的效用GROMACS公司。已运行模拟真空中其中一个分子(R（右）)-或(S公司)-MPD放置在长度为3.0的立方盒中 具有周期性边界条件的nm。由于MPD没有净电荷，所以没有添加反离子。拓扑文件是使用OPLS-AA原子类型的参数（Jorgensen等。1996年; Jorgensen&Tirado-Rives，1988年). 两种对映体拓扑文件中使用的原子的性质如补充表S1所示。

OPLS-AA全原子力场用于运行模拟。使用最速下降法对每个模拟盒进行能量最小化。使用NVT系综进行模拟，温度保持在300或370 K使用V型重新缩放恒温器（Bussi等。, 2009)耦合常数为0.1。使用粒子网格Ewald算法（Essmann等。, 1995)使用静电、范德华和0.9的邻域截止值 纳米。这个SHAKE（震动）约束算法（Ryckaert等。, 1977)用于以0.0002的公差约束所有键。模拟运行了100次 ns，使用1 fs时间步长和每1节约坐标和能量 附：前10名 每个模拟的ns被视为平衡时间，不用于后续分析。

退火模拟使用(R（右）)-MPD公司真空中系统的准备如上所述。在每100个模拟中，初始速度都是独立随机生成的。初始温度为370 K，模拟运行200 ps.以后每200个 ps，温度随时间线性下降5 K.因此，14.6 模拟开始后ns，温度达到5 K.接下来的200年 ps，温度随时间线性下降至0.1 K、在这个温度下继续模拟，直到总共运行了20次 纳秒。

轨迹分析使用GROMACS公司实用程序包。为清楚起见，我们报告的扭转角范围为0至360°，而不是习惯的−180至180°（大于180°的扭转角可以通过减去360°转换为通常的负扭转角）。

2.5. 数据库分析

MPD构象是从RCSB蛋白质数据库（PDB；https://www.pdb.org; 伯曼等。, 2000)和剑桥结构数据库（CSD；Allen，2002). PDB使用以下任一化学标识进行搜索(R（右）)-MPD（MRD）或(S公司)-MPD（MPD）以及两个附加要求：X射线分辨率介于0和1.5之间 Å，与其他大分子的序列同源性小于90%。这项搜索对MRD产生了49个蛋白质结构命中，对MPD产生了89个蛋白质结构点击。其中一些包含两种对映体，产生117种独特的蛋白质结构(R（右）)-或(S公司)-MPD公司。[我们注意到许多蛋白质结构有不止一个(R（右）)-或(S公司)-与之相关的MPD分子。]这些分子使用库特（埃姆斯利等。, 2010)具有结构和电子密度图（2F类_o个−F类_c（c）和F类_o个−F类_c（c）)通过Uppsala Electron Density Server（Kleywegt）下载等。, 2004). 没有密度或结构因子的点击被丢弃。电子密度图、局部氢键和原子的质量B类使用分子因子检查指定模型(R（右）)-或(S公司)-MPD结构是可以接受的，即是否对映体数据支持所选的构象。保留了可接受的结构，而丢弃了不可接受结构（因为无法明确确定分子的扭转角）或重新分配结构，以实现模型与电子密度之间更好的一致性。使用内置函数测量可接受和重新分配结构的扭转角库特共保留221个分子：109个(R（右）)-MPD和112是(S公司)-MPD公司。

CSD被搜索ConQuest公司（布鲁诺等。2002年)使用MPD（C）的化学公式₆H（H）₁₄O（运行）₂). 检查得到的28个命中，仅保留了对应于2-甲基-2,4-戊二醇的7个命中（参考代码BACXIM10、FALDUS、KOFPAW、NIRQIO、NOSVOG、PIFYEZ和TECYIJ）。hits，其中一些包含两种对映体的多个分子，使用水星（布鲁诺等。2002年). 由于没有可用的结构因子信息，因此指定的模型(R（右）)-MPD或(S公司)-MPD结构按原样接受，除非局部氢键建议重新分配结构。使用内置函数测量可接受和重新分配结构的扭转角水星共保留了十个分子：三个是(R（右）)-MPD和7名(S公司)-MPD公司。

3.1. 蛋白质和沉淀剂纯度

蛋白质纯度是结晶的关键因素（McPherson，1999). 事实上，杂质对溶菌酶结晶的有害影响已被广泛研究（Dold等。, 2006; 法官等。, 1998; 洛伯等。1993年; 帕尔玛等。, 2007; 托马斯等。1996年). 我们选择使用沃辛顿生化公司的溶菌酶，因为它已经被证明可以生产高质量的晶体（帕玛等。, 2007). 我们通过尺寸排除和阳离子交换高性能对蛋白质进行表征色谱法，准弹性的光散射和电喷雾电离质谱学确认其高纯度（补充图S2和S3以及表S2）。

对于化学沉淀剂和对映体纯度必须加以控制。我们购买了(RS系列)-Sigma–Aldrich的MPD，但决定不使用商用(R（右）)-同一制造商生产的MPD（目录号252840），因为其化学纯度较低，且其相关信息有限对映体纯度（仅给出具体的旋转）。对于(S公司)-MPD不是一个商业供应商。据我们所知对映体不可用作普通化学品。

因此，我们委托客户合成(R（右）)-MPD和(S公司)-Reuter Chemische Apparetebau KG的MPD（两种对映体的结构和相关命名如图1所示). 自(S公司)-MPD之前没有特征描述，只有部分信息可用于(R（右）)-MPD，我们分析了这些对映体和外消旋体(RS系列)-MPD由¹H和¹³C核磁共振，串联质谱法和光学活性（补充图S4-S9和表S3和S4）。为了完整起见，我们还提供了(R（右）)-MPD和(S公司)-制造商提供给我们的MPD（补充图S10和S11）。这些结果证实了合成分子的化学特性，并证明了它们的高化学和对映体纯度；表1总结了主要结果.

图1 的示意图(R（右）)-和(S公司)-英里/小时。C原子根据本工作中使用的惯例和扭转角进行编号(ψ1，ψ2)用红色箭头表示。CM是通过虚线连接到C2的未标记甲基C原子；附在C2和C4上的O原子分别是O2和O4，手性中心位于C4。

3.2. MPD构造

X射线衍射数据分析中的一个重要步骤是正确分配晶体结构。这项任务包括选择最适合电子密度的分子对映体和构象。对于纯(R（右）)-或(S公司)-MPD只有一个对映体可供选择，但用于结晶(RS系列)-MPD—选择不太简单。

如果电子密度图的质量足够高，则可以通过检查图的形状来区分这两种对映体，即使手性中心C4上的H原子（图1)在X射线数据中不可见。例如(R（右）)-Weiss及其同事在Phe34附近的溶菌酶结构（PDB入口）中发现MPD分子1dpw)用…结晶(RS系列)-MPD（韦斯等。, 2000). 如果图谱的形状不确定，了解最可能的构象有助于选择合适的对映体。

由于H原子对电子密度的贡献很小，从电子密度图中获得的MPD构象完全由扭转角决定(ψ₁，ψ₂)，分别由C原子C1-C2-C3-C4和C2-C3-C4-C5定义（图1). 此外，对于一个孤立的分子对映体将是另一个的镜像。能量方面的考虑表明(R（右）)-MPD分子约为（180°，180°）。这种构造（如图1所示)允许形成分子内氢键（O2和O4原子之间的距离为2.8 ？），对应于C1-C2-C3-C4-C5主干的良好排列（Salam&Deleuze，2002）). 为了验证这些考虑，我们在MPD上进行了量子化学计算和分子动力学模拟。

我们进行了量子化学（QC）计算，以确定(R（右）)-MPD示意图如图2所示选择这些全错列构象作为几何优化的初始构型；这些可能都接近构象上的局部极小值势能表面（Mo，2010). 表2列出了九种构象的优化几何构型的相对能量（另见补充表S5）。正如预期，1a个是最稳定的构象真空中最终几何优化结构的扭转角为（177°，173°），与定性预测的扭转角（180°，180°）接近。此外，在能源方面1a个第二个最稳定的构象，3a年（图2). Conformer公司3a年不能容纳分子内氢键，因为O2和O4相距太远（3.9 Å). 实际上，能量差（12.4 千焦 摩尔⁻¹)协议双方：3a年和1a个属于氢键能量范围（9.2-24.3 千焦摩尔⁻¹)计算其他烷二醇（Mandado等。, 2006). 最后，我们验证了一致性1a个那个(R（右）)-和(S公司)-MPD对映体具有相同的能量。

图2 通过量子化学计算研究了MPD的构象。每个构象由一个双符号代码（数字和字母）表示，该代码大致表示扭转角(ψ1，ψ2)计算中使用的初始构象。数字1，2和三对应于ψ1分别为180°、300°和60°；这些字母一，b条和c（c）对应于ψ2分别=180°、60°和300°。[例如，1a个是图1所示的（180°，180°）构象.]为了相互转换两个相邻结构，围绕方括号中给出的碳-碳键进行旋转。为了清楚起见，只对C2、C3和C4进行了编号；C1显示为红色，而CM和C5（与C4相邻）显示为黑色。

由于我们的蛋白质晶体是在溶剂存在下形成的，我们还使用水的可极化连续体模型计算了构象体的相对能量（Scalmani&Frisch，2010). 虽然相对能量的精确值与发现的值略有不同真空中，异构体在稳定性方面的排名相同（表2). 特别是，最稳定的构象是1a个对于下一个最稳定的构象，存在与分子内氢键损失相对应的能量差3a年.

上述结果表明1a个是各种环境中最稳定的构象。然而，任何给定环境中的实际构象数不仅取决于能量因子，还取决于熵因子，即通过相对自由能。为了确定MPD的相对自由能，我们进行了MD模拟真空中在300和370 K代表每个对映体。(ψ₁，ψ₂)每1次记录的构象 100秒内ps ns模拟如图3所示.（前10 每个模拟的ns被视为平衡时间，不包括在我们的分析中。）我们看到，使用QC计算检查的构象周围的数据簇（图3中的红色圆圈一). 300时 K并非所有的构象都可用于MD模拟，但在370 K观察到所有九种构象(R（右）)-MPD，只有一个未观察到(S公司)-MPD公司。此外，没有发现无关的构象，这证实了我们为质量控制计算选择的构象是合理的。最后，在每个温度下(R（右）)-和(S公司)-MPD结果大致显示了预期的镜面对称性。更具体地说，对于零假设(R（右）)和(S公司)构象相同，aχ²测试（见支持信息§S2）表明该假设被接受第页-值大于0.90（在300 K） 或0.80（370时 K） ●●●●。

图3 MD模拟的MPD构象真空中(一) (R（右）)-300时的MPD K；(b条) (R（右）)-MPD为370 K；(c（c）) (S公司)-300时的MPD K；(d日) (S公司)-MPD为370 K.输入(一)虚线表示自由能计算中使用的九个箱子。红色圆圈是从量子化学计算中获得的九个局部稳定构象；每个构象对应的标签以粗体显示。模拟退火实验的结果位于绿色方块内。

通过除以(ψ₁，ψ₂)将构象空间分成九个大小相等的箱子（图3一). 由于每个容器中只有一个构象，所以在给定容器中的所有观察结果都可以与特定的构象相关联。摩尔亥姆霍兹自由能ΔF类_我符合规定的我相对于1a个由（Frenkel&Smit，1996）给出)

在这里，N个_我是一致性的观察次数我和N个_1a个是一致性的观察次数1a个.R（右）是普遍的气体常数和T型是绝对温度。

正如我们在QC计算中发现的那样，MD模拟表明1a个是最稳定的构象，与下一个最稳定构象存在差距（表3). 当温度从300变为370时 K这个间隙减小，说明熵贡献的重要性增加。事实上，在370 K构象的相对稳定性顺序与300时的顺序不同 英国。

虽然能源（QC）和自由能源（MD）景观具有全球特征，但它们在几个方面有所不同。例如，能量方面第二个最稳定的构象是3a年而在自由能方面2a个（我们注意到2a个是能量第三稳定的构象，只有1.4 千焦 摩尔⁻¹高于3a年 真空中; 表2此外，根据MD结果，1c个，2厘米和3立方厘米是最不稳定的状态，在370时具有类似的自由能 K、 但QC计算表明3立方厘米能量上比其他两个稳定大约10倍 千焦 摩尔⁻¹大约是氢键的能量。事实上3立方厘米为2.7 ω，适合形成强氢键。在MD模拟中加入熵效应可能会使3立方厘米不太稳定，因为纯粹的能量考虑。

为了进一步比较QC和MD结果，我们对(R（右）)-MPD，其中系统在370平衡 K、 其中观察到所有9种构象，并缓慢冷却至0.1 K、 其中熵的贡献很小，能量的考虑决定了分子的稳定性。在77次运行中，我们发现最终构象（图3中央箱中的绿色方块一)与1a个质量控制计算的构造（图3中央箱中的红色圆圈一)，这与我们之前的结果一致1a个是全球能源最低值。

在剩下的23次跑步中，有20次(R（右）)-MPD在年达到当地最低值2a个bin（MD模拟中仅次于1a个; 表3)在三次跑步中，它达到了3亿构象（第三稳定状态）。根据QC结果，我们预计低温极限状态的顺序为1a个<3a年<2a个（就增加能量而言；表2). 这种差异可能反映了经典力场在捕捉原子相互作用的量子力学方面的局限性。

我们的计算结果有力地表明1a个应该是自然界中最常见的构象。为了验证这个假设，我们检查了(ψ₁，ψ₂)的构象(R（右）)-和(S公司)-PDB中发现的MPD（伯曼等。, 2000). 正如预期的那样，我们观察到大多数构象围绕1a个（图4)与大约十年前对当时可用的MPD分子进行的类似分析一致（阿南德等。2002年). 为了进一步研究MPD与蛋白质的相互作用，我们将PDB数据与MD结果进行了合并，并计算了构象的相对吉布斯自由能（表4). 结果遵循了在没有蛋白质的情况下QC计算和MD模拟的模式：构象1a个最稳定，存在差距（3.7 千焦 摩尔⁻¹在300 K） 协议双方：1a个其次是最稳定的构象。对于PDB结果，下一个最稳定的构象是2a个，这与我们在MD模拟中发现的结果相同（表3).

图4 PDB中MPD的构象。这两种对映体以不同的颜色显示：(R（右）)-红色MPD和(S公司)-蓝色MPD。虚线表示自由能计算中使用的九个箱子(囊性纤维变性.图3一).

除了提供有关MPD异构体与蛋白质强结合时的相对稳定性的信息外，PDB结果还允许我们检查对这种相对稳定性的可能手性影响。特别是，我们可以问，共结晶的构象分布是否存在统计上的显著差异(R（右）)-以及(S公司)-MPD公司。由于PDB数据库中的MPD分子是在手性环境中发现的，因此构象分布可能存在差异。A类χ²测试（压力等。, 1992)关于(R（右）)-以及(S公司)-MPD分布(即9个构象中每个构象被观察的次数）表明，无效假设，即(R（右）)和(S公司)一致性相同，应被接受(第页= 0.11). 这一结果支持了以下假设：MPD和蛋白质之间的任何手性相互作用都不会影响构象的相对稳定性。

作为对MPD构象的进一步检查，我们还检查了剑桥结构数据库（CSD；Allen，2002）). 虽然小样本量无法进行详细的统计分析，但我们注意到从CSD中提取的十个MPD分子中有八个采用了构象1a个.

QC、MD和数据库结果均表明1a个是MPD在手性和非手性环境中最稳定的构象。其他八种构象的稳定性明显较差；数据库分析表明，找到MPD分子的构象不是1a个小于50%，仿真结果给出的概率要低得多。因此，我们决定使用1a个专门用于拟合MPD与蛋白质共结晶的电子密度数据。如§所示3.3，这一选择导致实验数据的合理拟合。

考虑到X射线结构的高分辨率，我们可以添加一个甚至两个低占据率的构象，以略微改善MPD分子的适合性。然而，我们选择了一种保守的方法来解释电子密度图，以获得有物理意义的结果，并尽量减少在分析蛋白质-配体复合物时遇到许多问题的机会（Kleywegt，2009). 我们的工作强调了彻底构象分析与大分子结构复合的配体分子，我们支持最近对PDB中配体分子的可靠标准约束库的呼吁（Jaskolski，2013).

3.3. 溶菌酶晶体与MPD相互作用

当溶菌酶在pH 8.0的Tris中结晶时，它会形成四方晶体空间组 P（P）4_三2₁2和几乎相同的单位-细胞参数，无论是否使用MPD，并且与MPD立体化学无关（表5). 这一结果与其他研究人员的发现一致，他们在一系列溶液条件下观察到了这种晶体排列（布雅茨等。, 2010; Helliwell&Tanley，2013年; 法官等。, 1999; 米肖等。, 2008; 坦利等。, 2012; 韦斯等。, 2000). 从我们研究的四个条件[即(R（右）)-, (S公司)-, (RS系列)-MPD和无MPD]也类似；等效C之间的平方根偏差^α原子数小于0.4 对于任何两个结构物（补充表S6）。

然而，晶体之间存在重要差异。最重要的是，分辨率和无序度（通过镶嵌和B类因子）随使用的沉淀剂而变化（表5). 当(R（右）)-MPD是沉淀剂。此外，MPD的纯对映体与蛋白质产生不同的相互作用。两者(R（右）)-MPD和(S公司)-MPD在Phe34附近形成晶体接触，但第二个分子(R（右）)-MPD位于Trp63附近，非常靠近蛋白质的活性部位（绪端等。, 2013). 没有(S公司)-在这个位置观察到MPD，但第二个分子(S公司)-MPD位于Trp123附近（图5). 使用(RS系列)-MPD仅作为沉淀剂(R（右）)-观察到MPD分子，它们在Phe34和Trp63附近发现，与纯MPD分子的模式相同(R（右）)-MPD公司。我们在下面详细检查了发现MPD的每个站点。

图5 溶菌酶与MPD对映体的整体结构。C的带状图α显示了晶体的主干(R（右）)-MPD（蓝色）和(S公司)-MPD（绿色）。与每个结构相关的MPD分子显示为与蛋白质骨架相同的颜色。

3.3.1. Phe34相互作用位点

这是一个晶体接触部位，MPD在其中形成氢键，涉及两个对称相关蛋白分子上的残基：Phe34和Gly22′（图6; 为完整起见，还显示了Arg114和Gly22′之间的直接氢键）。此前，其他研究人员曾以较低分辨率与(RS系列)-MPD，但结果自相矛盾：Weiss和同事只发现(R（右）)-晶体中的MPD（Weiss等。, 2000)Michaux和同事们发现(S公司)-MPD（米肖等。, 2008).

图6 晶体接触位置靠近Phe34。两个对称相关的蛋白质分子（用绿色和紫色C原子表示）通过氢键（橙色虚线）相互作用。(一)–(d日)描述使用不同添加剂的当前工作结果：(一) (R（右）)-MPD；(b条) (S公司)-MPD；(c（c）) (RS系列)-MPD；(d日)未添加MPD。红色球体(d日)是水分子的O原子。为了进行比较(e（电子）)韦斯等。(2000)和(（f）)米肖等。(2008)，两者都使用了(RS系列)-还介绍了MPD。第2个F类o个−F类c（c）密度显示为1.5的灰色网格轮廓σ.

我们的高分辨率结构(R（右）)-和(S公司)-MPD允许我们澄清这些相互冲突的结果。我们观察到，电子密度更好地定义为(R（右）)-MPD（图6一)而不是为了(S公司)-MPD（图6b条和补充图S12），这反映在(R（右）)-MPD（0.9与0.5). 事实上，我们发现在C1位置的水分子（占有率为0.5）(S公司)-MPD正在与竞争(S公司)-MPD（为了清楚起见，图6中省略了该水分子b条). 这些结果表明溶菌酶和(R（右）)-Phe34站点的MPD，我们的结果证实了这一建议(RS系列)-MPD：我们观察到(R（右）)-现场MPD（图6c（c）). 入住率（0.55）没有纯酒店高(R（右）)-MPD，这可能是由于几个因素造成的，例如(R（右）)-溶液中的MPD[纯溶液中MPD的一半(R（右）)-MPD]和与的竞争(S公司)-现场MPD。

此外，正如我们观察到的纯(S公司)-MPD，可能是水在同一地点竞争。当我们在没有任何MPD的情况下使溶菌酶结晶时，我们观察到一个水分子可以形成等价的氢键（图6d日). 然而，MPD是一种比水更有效的结晶剂。溶菌酶晶体（200 µm）增长约5 d带MPD；大约相同大小的晶体在没有MPD的情况下生长了大约两周。在之前的工作中，我们注意到索马汀和L（左）和D类酒石酸钠的对映体，在有添加剂和无添加剂的情况下形成相同的晶体习性，但那些与添加剂一起生长的晶体在动力学上受到青睐（阿舍利等。, 2009).

鉴于这些结果，我们同意Weiss的赋值等。(2000)第页，共页(R（右）)-Phe34站点的MPD(RS系列)-MPD用作添加剂（图6e（电子）). 虽然可能有一小部分(S公司)-MPD对电子密度有贡献，仅指定(S公司)-由Michaux执行现场MPD等。(2008)，与电子密度数据的拟合较差。通过检查B类原子因子(S公司)-MPD不均匀且异常高（补充图S13）。当我们使用他们的数据制作OMIT图时，我们发现(R（右）)-MPD能更好地适应电子密度。

每种相互作用之间的另一个区别对映体从两种添加剂在结合位点的不同取向可以明显看出蛋白质的结合（图6一和6b条)，这导致MPD和蛋白质残基之间不同的分子间氢键。连接(R（右）)-MPD和蛋白质是O2和Phe34和O4的羰基O原子以及Gly22′的羰基氧原子，而对于(S公司)-MPD对为O4–Phe34和O2–Gly22′。

由于O2和O4有可能与Phe34或Gly22′形成氢键，我们想知道为什么没有证据表明O2与O4交换位置的刚体旋转的电子密度。我们认为，这种轮换是不利的，因为空间位阻。例如，旋转(R（右）)-MPD使O4–Phe34和O2–Gly22′氢键(S公司)-MPD会导致甲基CM和Lys33的羰基O原子之间产生强烈的排斥作用。

3.3.2. Trp63相互作用位点

在这里，MPD与同一蛋白质的Trp63和Asn59形成氢键。尽管它不是晶体接触点，但它可能会导致不同晶体之间观察到的差异，因为我们发现(R（右）)-当它是添加剂时，现场的MPD（占用率0.60）（图7一)，但没有(S公司)-作为唯一添加剂时的MPD（图7b条). 相反，我们发现两个水分子与那些含有(R（右）)-MPD公司。我们的(RS系列)-MPD结果与该发现一致：我们观察到(R（右）)-现场MPD（图7c（c）)入住率为0.50。

图7 Trp63附近的相互作用位点。(一)–(c（c）)描述使用不同添加剂的当前工作结果：(一) (R（右）)-MPD；(b条) (S公司)-MPD；(c（c）) (RS系列)-MPD公司。红色球体(b条)是水分子的O原子。为了进行比较，Michaux的结果等。(2008)，使用了(RS系列)-MPD，也会出现(d日). 第2个F类o个−F类c（c）密度显示为1.5的灰色网格轮廓σ，除了(S公司)-MPD分子(d日)，显示为1.0σ这是为了强调C4（用箭头表示）从密度中突出。

韦斯等。(2000)在这个区域发现定义不明确的电子密度，他们将其分配给水分子。迈克尔等。(2008)观察更明确的密度(S公司)-MPD（图7d日)，但对于这个任务，C4从电子密度中突出（图7中的黑色箭头d日). 与Phe34站点一样，我们认为(R（右）)-MPD是一项更合适的任务。

这是一个悬而未决的问题，为什么(R（右）)-在该现场观察到MPD。我们没有发现任何明显的因素会排除其他因素对映体，因为Trp63附近的区域似乎不是MPD的传统对映体选择性结合位点，在这个口袋中只有一个对映体配合（Ali等。, 2006; Haginaka，2008年). 添加剂和蛋白质之间形成优选的非对映体复合物可能涉及到更微妙的影响（Lämmerhofer，2010）).

3.3.3. Trp123相互作用位点

我们可以放心地在这个地点分配MPD的唯一晶体是那些生长在(S公司)-MPD，其中占用率为0.50（图8和补充图S14）。对于(R（右）)-MPD没有明显的密度，而对于(RS系列)-MPD密度定义太差，无法进行明确的分配：我们选择分配水分子。韦斯等。(2000)和米肖等。(2008)也发现该地点的密度定义不明确；前者指定Tris分子，而后者指定水分子。

图8 Trp123附近的相互作用位点。(S公司)-MPD通过氢键（橙色虚线）与蛋白质相互作用。红色球体是水分子的O原子。第2个F类o个−F类c（c）密度显示为1.5的灰色网格轮廓σ为了清楚起见，O2和O4之间的分子内氢键(S公司)-MPD未显示。

尚不清楚此网站在晶体结构。MPD和蛋白质之间没有直接氢键，只有一个通过水分子间接氢键连接到Ala122。此外，与Trp63位点一样，蛋白质与MPD之间的对映选择性相互作用机制仍有待阐明。

3.3.4. 晶体质量

溶菌酶与MPD的对映选择性相互作用影响晶体质量。我们发现最高分辨率和最少无序的晶体（根据平均蛋白质测量B类因子和镶嵌性）(R（右）)-MPD（表6). 无论我们使用最大分辨率极限数据（表6），这都是正确的)或者在恒定的条件下比较晶体我/σ(我)（补充表S7）。使用(R（右）)-MPD与更好的晶体接触一致对映体在Phe34位点与蛋白质形成。

表6 晶体质量比较 调查人员 MPD添加剂 最大分辨率（Ω） 总体B类系数（Ω2) 镶嵌度（°） 这项工作 (R（右）)-MPD公司 1 13.4 0.26 这项工作 无 1.15 15.5 0.32 这项工作 (S公司)-MPD公司 1.20 17.2 0.46 这项工作 (RS系列)-最大功率密度 1.25 15.1 0.43 维斯和同事† (RS系列)-MPD公司 1.64 19 — Michaux和同事‡ (RS系列)-最大功率密度 1.75 20.2 — †PDB条目1dpw（韦斯等。, 2000). PDB条目3b72号（迈克尔等。, 2008).

其他晶体质量较低。那些生长在(S公司)-MPD整体质量较差，表明(S公司)-相对于不使用MPD，MPD对晶体生长有有害影响。第二组晶体的数据（补充表S7）支持这一建议。

晶体生长在(RS系列)-Weiss的MPD等。(2000)和米肖等。(2008)具有较低的分辨率和较高的分辨率B类比我们的(RS系列)-MPD晶体，这可能部分是由于他们使用的溶菌酶纯度较低。（这些作者没有在他们的工作中报告镶嵌性，但无论如何，很难比较光束线之间的镶嵌性，因为X射线束具有不同的发散。）然而，很可能是外消旋添加剂的使用，而不是光学纯也会对晶体质量产生不利影响。当用立体异构体对于酒石酸钠，我们发现最高质量的晶体是由光学纯沉淀剂（Asherie等。, 2009).

3.4.手性和蛋白质结晶：评论和建议

使用手性影响小分子结晶是一个有着悠久历史的活跃研究领域（Pérez-García&Amabilino，2002）). 事实上，路易斯·巴斯德发现了手性1848年通过结晶实验（Gal，2008, 2011). 相比之下，关于手性在蛋白质结晶中。除了我们自己的研究之外，我们知道的唯一其他系统方法使用手性控制蛋白质结晶的方法是合成蛋白质的外消旋结晶等。, 2008; 萨瓦亚等。, 2012; Yeates&Kent，2012年). 如果感兴趣的蛋白质足够小，并且有足够数量的二硫键以确保正确折叠，则可以通过全化学合成来生产。由于蛋白质是人工组装的，它可以被制成两种对映体，其中一种由天然产物组成L（左）-氨基酸和其他D类-氨基酸，然后结晶为对映体对。这种方法使十多种蛋白质的结构更容易结晶和求解（Yeates&Kent，2012）).

进一步的迹象表明手性是蛋白质结晶的有用工具，可以从文献中收集到。例如，在β-十二烷基麦芽糖苷，脂质必须具有足够的立体化学纯度：α-立体异构体含量必须低于10%（Fromme&Witt，1998). 文献检索过程中出现的一个困难是，制造商（尤其是结晶试剂盒）或研究人员经常忽略所用添加剂的立体化学特性。我们注意到，手性分子通常存在于商用试剂盒中。在我们检查的八家制造商（Hampton Research、Qiagen、Jena Biosciences、Molecular Dimensions、Sigma–Aldrich、Microlysis、Anatrace和Rigaku）的180个试剂盒中，我们在134个试剂盒（占所有试剂盒的74%）中发现了至少一个手性分子。鉴于试剂盒中广泛包含手性分子，以及手性在蛋白质结晶实验中，我们鼓励其他研究人员在报告实验结果时指定所使用的所有化学品的绝对立体化学构型。

除了缺乏关于手性，我们还遇到了与如何在PDB中描述分子2-甲基-2,4-戊二醇有关的命名问题。经常使用不一致的编号方案，例如在PDB条目中1jlt（1jlt），其中结构中的两个MPD分子编号不同。特别是，CM和C1经常切换，这使得分析添加剂的构象变得更加困难，并且模糊了一个分子是另一个分子的镜像的结构信息。我们选择的编号（图1)遵循IUPAC关于支链烃的建议（IUPAC，1979)并适当强调1a个构象。事实上，我们不得不反复要求PDB使用此编号(R（右）)-MPD在我们的结构中，当我们最初放置它们时，编号被切换。最近注意到PDB有使不正确或混乱的编号方案永久化的趋势（Jaskolski，2013)并应予以纠正。

PDB中命名和手性分子的另一个问题是用于识别分子的三个更好的配体ID。在撰写本文时，在PDB中搜索“MPD”，这是(S公司)-MPD，发现826个结构；搜索“MRD”，配体ID(R（右）)-MPD仅找到309个结构。这种差异可能是由于真正的手性效应造成的，但由于大多数结构的分辨率都不高，所以这种效应不太可能一直存在。也就是说，配体的密度可以与对映体。[除了我们的实验之外(RS系列)-MPD是使用的添加剂，因此原则上对映体可能存在于X射线结构中。]事实上，对于我们分析的高分辨率数据，我们发现几乎相同数量的(R（右）)-和(S公司)-MPD分子与蛋白质相互作用。(S公司)-PDB中的MPD可能反映了一种语言偏见：当人们适合他们的数据时，他们使用MPD，即(S公司)-MPD，因为它是大多数人用来指代分子2-甲基-2,4-戊二醇的首字母缩写。为了避免此类问题，我们建议PDB命名对映体，更一般地说立体异构体，使用不会产生偏见的缩写。鉴于PDB中有大量手性分子，这一点尤为重要。

前200个PDB配体中有90个手性分子（按配体命中率排列，即配体在PDB结构中的报告次数），约20%的配体命中涉及手性分子。我们认为，由于手性分子是常见的，因此应详细探讨蛋白质结晶中可能的手性效应。此外，探索更广泛的立体化学效应似乎是合理的对映异构体。鉴于糖作为配体在PDB中的普遍存在，我们认为立体异构糖作为一种有趣的可能性来考虑结晶蛋白质。

虽然PDB蛋白质结构和配体列表为选择候选手性配体提供了一个有用的起点，但它们仅提供了手性分子在蛋白质结晶中作用的部分观点。在蛋白质成核期间，溶液中可能存在手性效应，但最终晶体中不包含手性添加剂。事实上，我们在索马汀和酒石酸盐中观察到了这一点。添加L（左）-酒石酸盐对thaumatin产生双锥体晶体，将添加剂加入晶格中。晶体具有正常的溶解度和四方结构空间组。添加D类-相反，酒石酸盐导致形成具有逆溶性和正交性的棱柱晶体空间群；这些晶体不含任何酒石酸盐（Asherie、Ginsberg、Blass等。, 2008; 阿瑟里、金斯伯格、格林鲍姆等。, 2008; Asherie公司等。, 2009).

这里我们重点关注高分辨率结构（分辨率优于1.5 因为它们允许我们以最小的不确定性确定MPD的立体化学和构象，因此我们能够详细分析手性效应。这样做，我们并不意味着手性效应仅限于高分辨率结构。相反，手性效应的范围从明显的（其中一些可以用肉眼看到）到微妙的。这在小分子系统中是众所周知的，通过研究不同的蛋白质-添加剂对，我们希望发现它也适用于蛋白质系统。

需要进一步工作，以充分了解其机制手性影响蛋白质结晶。手性效应在晶体接触时通常很明显，但这些仅占蛋白质-加性相互作用的一小部分：我们估计手性分子与至少一个晶体接触的蛋白质结构的比例约为5%（Carugo&Djinović-Carugo，2014）). 更常见的情况是两种对映体在不同的位置与蛋白质相互作用，但这些不是晶体接触点；这就是本文中讨论的Trp63和Trp123相互作用位点的情况。此外，正如我们前面提到的，手性分子可以在溶液相中起作用。

我们感谢与光学纯添加剂价格昂贵。成本是迄今为止MPD结晶实验仅对外消旋体进行的一个可能原因。在撰写本文时，每克纯度为99%的成本(R（右）)-Sigma–Aldrich（目录号252840）的MPD是(RS系列)-类似纯度的MPD（目录号112100）。然而，考虑到潜在的好处，应将评估手性效应的某些方法纳入结晶实验，我们预计成本将随着对光学纯添加剂。如果使用研究中添加剂的单独对映体对结晶条件进行全面筛选的成本过高，我们建议使用价格较低的外消旋体进行初始筛选；然后可以用纯对映体优化有希望的条件。我们很乐意提供少量纯净水(R（右）)-和(S公司)-MPD发给社区成员。