2.1. 质粒和蛋白质生产

的序列和RNA表达谱弓形虫从ToxoDB中提取烯醇酶(https://toxodb.org). 优化TgENO1和TgENO2的序列，以便在大肠杆菌，合成并亚克隆到pCCK-N′-HisTEV载体（美国加利福尼亚州MCLAB）。表达载体转化为BL21（DE3）Magic后，制备过夜培养物大肠杆菌细胞。接种过夜培养后，细胞生长4 37°C条件下，添加0.5 米M（M）25°C时的IPTG。采集的细胞在20个 米M（M）三氯化氢，500 米M（M）氯化钠，10 米M（M）咪唑缓冲液pH 8.3，在水-冰浴（0–4°C）中超声处理10 min，离心10 7000时最小值 转速 最小值⁻¹利用固定化金属亲和力从可溶性细胞提取物中纯化重组蛋白色谱法使用Ni–NTA琼脂糖柱和Sephadex G-25柱上的凝胶过滤的系统。纯TgENO1和TgENO2在含有10的缓冲液中洗脱 米M（M）Tris–HCl pH值8.3500 米M（M）氯化钠，5 米M（M） β-巯基乙醇。将蛋白质浓缩在同一缓冲液中，用于晶体筛选和在体外研究。

2.2. 结晶和X射线数据采集

采用1:1的TgENO1（7.0 毫克 毫升⁻¹)和储层溶液。用于结构研究的晶体是在由0.1 M（M）蒙脱土（1:2:2DL公司-苹果酸：MES：Tris碱）缓冲液pH 6.0和25%PEG 1500。在液氮中冷却之前，将晶体转移至贮存条件进行低温保护。衍射数据收集于100 美国伊利诺伊州阿贡市高级光子源生命科学合作访问团队光束线上的K。沉积结构的衍射图像可在CSGID网站上获得(https://www.csgid.org/csgid/pages/home).

2.3.结构确定和精细化

香港（HKL）-3000用于索引、集成和缩放（Broennimann等。, 2006). 该结构由分子置换在里面相位器使用詹氏甲烷球菌烯醇化酶结构（PDB条目2人6; RIKEN Structural Genomics/Proteomics Initiative，未发表的工作）作为起始模型（McCoy等。, 2005). 该模型在REFMAC公司（穆尔舒多夫等。, 2011)根据中显示的电子密度图进行手动校正后库特（埃姆斯利和考坦，2004年). 结构图使用PyMOL公司（v.1.5；薛定谔），国际学生成绩评估（徐）等。, 2008)和LigPlot（照明绘图）+v.1.3（拉斯科夫斯基和斯温德尔出版社，2011年). 坐标和结构因子已保存在蛋白质数据库中，并带有登录号3个.

2.4. 生物源和DNA结合分析

在人包皮成纤维细胞中培养寄生虫，收集并获得如前所述的核提取物（Kibe等。, 2005). 寄生虫核提取物在使用前应在−80°C下进行校准和储存。电泳根据制造商的说明，使用带移分析试剂盒（法国赛默科技公司）进行迁移率变化分析（EMSA）。如前所述完成了竞争实验（Mouveaux等。, 2014). 按照Olguin-Lamas的描述进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析等。(2011)稍作修改。简单地说，来自细胞内寄生虫的染色质（2×150 厘米^三烧瓶）在HFF细胞中生长，交联10 在室温下，用1%甲醛进行至少一分钟的净化。交联后，细胞内寄生虫被用于超声处理后获得染色质提取物，产生500-1000个片段 bp。使用多克隆抗ENO1抗体（Dzierszinski）进行免疫沉淀等。, 2001). 还使用了单克隆或多克隆抗HA抗体（Invitrogen）。ChIP在4°C下孵育过夜，并按照Olguin-Lamas的描述进行清洗等。(2011). 然后对DNA进行蛋白酶K消化2 h并使用Qiagen PCR纯化试剂盒进行纯化(https://www.qiagen.com网站). 作为阴性对照，使用免疫前血清。用MAG1基因特异引物PCR扩增的ChIP产物在琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭染色，并用紫外线扫描仪拍照。

3.1. 阶段特异性表达弓形虫烯醇化酶

来自ToxoDB的RNA和蛋白质表达数据(弓形虫数据库；https://toxodb.org/toxo/; 加伊里亚等。, 2008)支持先前关于原生动物寄生虫中两个烯醇化酶基因的阶段特异性表达的报道弓形虫（Dzierszinski）等。, 1999). 虽然这两种烯醇化酶都在肿瘤的各个阶段表达弓形虫生命周期中，TgENO2（TGME49_268850）在速殖子中转录水平最高，而TgENO1（TGME49 _268860）在缓殖子中特异性上调表达。

3.2. 缓性岩TgENO1的结构

apo TgENO1晶体结构在中确定空间组 我4至2.75 分辨率（表1). 结晶学非对称单元包含三个几乎相同的TgENO1同源二聚体。与相关烯醇化酶类似，436-氨基酸TgENO1亚基中的每一个亚基折叠成一个小的N末端结构域（残基1-150）和一个大的催化C末端区域（残基151-444）（图1和2c（c）). N端域构成三股β-四张纸α-螺旋，而C端域形成TIM带催化域（图2c（c）)在烯醇化酶超家族成员中是保守的（Gerlt等。, 2012).

图1 烯醇酶的二级结构排列。细菌(猪链球菌)，原生动物寄生虫(弓形虫和恶性疟原虫)，工厂(拟南芥)并对人烯醇化酶进行比对。除人类ENO2和链球菌ENO公司。人类MPB1是ENO1的一种选择性剪接形式，在N末端域被截断。五个保守的活性位点残基（His165、Glu174、Glu217、Lys355和Lys406）用蓝色箭头标记。环2 N末端的非典型TgENO1残基替代物E164S和环3中的相互作用残基Tyr270用红点表示。转录调节烯醇酶表面保守的带正电残基用加号（+）标记。方框区域为植物样插入（红色虚线；DI，二肽插入；PI，五肽插入）、催化流动环（黑色；L，环）和纤溶酶原结合基序（蓝色虚线；PB，纤溶酶源结合）。

图2 缓性岩TgENO1的结构。(一)将TgENO1的结构域拓扑与选定的烯醇化酶进行了比较。(b条)TgENO1二聚体。(c（c）)TgENO1单体。图中显示了N末端结构域（小麦中）、C端结构域（绿色）、标准TIM桶（TIM）、三个移动环（L1–L3；洋红色）和植物状插入物（PI和DI；红色）。这个疟原虫-衍生的纤溶酶原结合基序（星号）位于TgENO2中的表面环3上，但不位于TgENO1中。(d日)植物样插入物（圈出）在TgENO1中标记为红色（绿色），并与人类ENO1重叠（紫色；PDB条目2磅/平方英寸; J.K.Hyo、J.K.Seung、J.C.Sang和J.Suk-Kyeong，未发表作品），其中不包含植物样插入。

3.3. 植物状插入弓形虫烯醇化酶

植物烯醇化酶含有五肽[PI；EWGW（Y）C（S）]和二肽（DI；EK/DK，KQ）插入物。虽然在大多数酵母和动物烯醇化酶中不存在，但这两种插入物在TgENO1和TgENO2中都存在（图1和2; Dzierszinski先生等。, 2001; Harper&Keeling，2004年). 一对缺失研究强调了这些植物样插入物的功能重要性。五肽基序的缺失疟原虫烯醇化酶使酶分解成单体，导致催化效率急剧降低～100倍（Vora等。, 2009). 删除TgENO1中的一个或两个植物样插入物表明，插入物协同作用以增加底物亲和力（Dzierszinski等。, 1999). TgENO1中另外两个二肽插入（ID位于147位，EK位于323位）尚未报告或分析其潜在功能。

TgENO1结构显示，两个类植物烯醇化酶插入位于表面环上（图2). 较大的五肽插入物EWGYS形成一个短β-绞线(β5） 在α3和α4螺旋。插入会产生更正的电荷表面电位在这个N端域循环。二肽插入KQ，位于β11和β12，也会增加充电表面电位环L3位于C末端结构域，为与配体结合提供了一个可能的位点，该配体将负向调节催化囊。位置147和323处未标记的二肽插入也位于表面环上。

一个亚基的N端结构域与另一个亚基的C端结构域的相互作用形成了掩埋1891.7的TgENO1二聚体界面 Ų含有33个氢键和15个盐桥。这与埋藏2003年2的hENO1二聚体相当 Ų并且包含43个氢键和20个盐桥，如使用国际学生成绩评估服务器（Xu等。, 2008). 图解（图3，补充图S1）使用LigPlot（照明绘图）+v.1.3（拉斯科夫斯基和斯温德尔出版社，2011年)，它预测了TgENO1和hENO1的26个和31个氢键的数量，因为不同的几何截止值（补充图S1）。缓性子TgENO1和速性子Tg ENO2的比较表明二聚体界面上氢键形成残基的高度保守。由于五肽与二聚体界面有一定距离，五肽缺失导致的单体状态必然是构象发生重大变化的结果（Vora等。, 2009).

图3 烯醇化酶二聚体界面。子单元接口弓形虫并且人ENO1二聚体以红色和绿色示出。这个弓形虫ENO1二聚体由33个氢键形成，平均表面积为1891.7 Å2，由确定国际学生成绩评估和26个氢键LigPlot（照明绘图）+（补充图S1一)而人类ENO1二聚体界面包含43个(国际学生成绩评估)和31(LigPlot（照明绘图）+)氢键（补充图S1b条)平均表面积为2003.2 Å2.

3.4. 缓性岩TgENO1活性位点

从速殖子阶段到缓殖子时期的转化伴随着从氧化到厌氧糖酵解过程的急剧转变（Dzierszinski等。, 2004; 托马沃，2001年). 缓性岩TgENO1在这一转变中具有潜在的重要性，表现出类似的K（K）_米2-磷酸的值-D类-与速殖子TgENO2相比，甘油酸含量低三倍k个_猫（Dzierszinski）等。, 1999). 烯醇化酶活性位点位于由β-链，包含环1（L1；残基36-57）、环2（L2；残基166-173）和环3（L3；残基258-282）（图1, 2和4). 先前的研究报告称，这些环在非连接态和PEP结合态中采用“开放”构象，但在2-磷酸化中经历构象变化以采用“封闭”构象-D类-结合甘油和镁²⁺-束缚态（勒比奥达等。, 1989; 张等。, 1997). L1起到“盖子”的作用，通过与Mg配合使用L1中的残基Ser41/39（TgENO1/人ENO1），在底物和辅因子结合时关闭活性位点²⁺辅因子。闭合构象促进了His165/159的质子化α2-磷酸中的碳-D类-甘油酸和随后由Lys355/345脱质子形成碳负离子中间体。磷酸烯醇丙酮酸是通过残基Glu217/211从碳3中消除氢氧化物而形成的，然后随着三个动态环转移到“开放”构象而释放。将TgENO1与先前报道的烯醇化酶结构叠加显示，apo TgENO 1结构中的三个环呈“开放”状态（图4一和4b条).

图4 TgENO1活性位点。(一)TgENO1二聚体（绿色）与“开环”ScENO二聚体的叠加（蓝色；PDB条目每小时1次; 威德金德等。, 1995). r.m.s.d.为0.56 Å超过777摄氏度α原子。(b条)TgENO1二聚体与“闭环”hENO1二聚体的叠加（橙色；PDB条目3b97号; 康等。, 2008). r.m.s.d.为0.68 高于645 Cα原子。(c（c）)从不同的角度来看(一)突出显示回路2中独特的TgENO1残基Glu164和回路3中残基Tyr270之间的氢键（虚线）。(d日)TgENO1在闭环PEP结合复合体上的叠加（PDB入口3个ucd; 秦等。, 2012)说明L2闭合需要破坏Glu164–Tyr270氢键，并应允许His165与PEP O原子氢键。

虽然关键的催化和配体结合残基（TgENO1/人ENO1:His165/159、Glu174/168、Glu217/211、Lys355/345和Lys406/396）是保守的，但与TgENO2和其他烯醇酶相比，TgENO 1在活性位点囊袋中表现出三种非典型残基（Glu164、Leu176和Gln380）（图1). 缓性子TgENO1中最值得注意的是Glu164在其他烯醇化酶中最常被丝氨酸占据的位置上的存在（图1). Ser164是N-末端残留物与底物/产物磷酸基团相互作用。在缓动子TgENO1结构中，Glu164侧链指向远离活性位点，并且在Tyr270的氢键距离内（图1, 4c（c）和4d日). Tyr270也是一种独特的残基，通常被关键L3中的苯丙氨酸占据。作为最显著的区别特征，Glu164可能解释了k个_猫通过在重新定位L2和L3时需要破坏Glu164–Tyr270键来启动消除反应的催化囊，在缓性子TgENO1和速性子Tg ENO2之间进行反应。

3.5. 转录调节烯醇酶的表面电位

在TgENO1或TgENO2或人类和植物转录调节烯醇化酶中无法识别典型的DNA结合基序（螺旋-转-螺旋、基本螺旋-环-螺旋、螺旋-环–螺旋、亮氨酸拉链、锌指和HMG盒）。然而，计算的表面静电势的比较（图5)表明核烯醇化酶（hENO1和TgENO1）比细胞质烯醇化酶类（hENO2，肺炎链球菌ENO1）。缓性子TgENO1表面带正电荷的残基（赖氨酸和精氨酸）在速殖子TgENO2中保守（图1)也是激活基因启动子的核因子（Mouveaux等。, 2014). 正表面电荷弓形虫烯醇化酶与与DNA负电荷表面结合的蛋白质界面一致（纳达西等。, 1999). 到目前为止，我们在共结晶TgENO1和含TTTTCT基序的DNA复合物以从结构上验证阳性表面补丁作为一种新的核酸结合表面方面所做的大量工作均未成功。

图5 烯醇化酶的表面静电势。细胞溶质ssENO和hENO2以及转录因子TgENO1和hENO1以表面表示并用电荷着色。蓝色代表正电荷和红色负电荷。星号表示核烯醇化酶中相同和/或保守的正电荷残基（见图1). 静电计算和可视化使用自动驾驶辅助系统插件PyMOL公司.ssENO、，链球菌病，PDB条目第4周（卢等。, 2012). hENO2，智人，PDB条目1第6页（柴等。, 2004).

3.6. 特异性TgENO1-DNA相互作用的证据

然而，在缺乏晶体学数据的情况下，我们通过测试缓长石TgENO1的物理相互作用，进一步证实了其在转录中的作用同工酶TTTTCT基序存在于一系列基因的启动子中，这些基因在阶段转换期间受到严格调控，包括囊肿基质抗原（MAG1）基因（Mouveaux等。, 2014). 我们测试了重组TgENO1与TTTTCT和其他控制DNA基序的结合（图6一). 凝胶阻滞如图6所示(c（c）)证明重组TgENO1蛋白与含有TTTTCT基序的TgMAG1探针特异性相互作用。相比之下，TgENO1蛋白没有与c-Myc基序结合，该基序包含探针B中的典型TATA盒，该盒以与人类或植物烯醇化酶结合而闻名（Lee等。2002年)或连接到不相关的探针C（图6c（c）). 此外，对照区PCR为阴性（数据未显示）。因此，TgENO1与存在于弓形虫基因启动子。

图6 体外TgENO1与TgMAG1启动子序列的相互作用。(一)寡核苷酸探针设计用于缓激肽TgMAG1启动子的TTTTCT基序、人类c-Myc启动子的TATA盒和负随机序列。(b条)纯化重组TgENO1的SDS-PAGE。车道1包含分子量标记（标记单位为kDa）。(c（c）)电泳迁移率生物素化TgENO1与探针孵育后的位移分析，用于检测DNA-蛋白质复合物的迁移阻滞。TgENO1–TgMAG1复合物（第二通道）与未标记探针竞争，然后与标记的TgMAG1探针（第三通道）孵育。

3.7. TgENO1专门针对MAG1启动子体内

已经证明TgENO1通过凝胶阻滞与特定DNA基序结合在体外，我们重点验证其与MAG1基因启动子的结合体内我们发现，特异于TgENO1的兔多克隆抗体从细胞内寄生虫的染色质提取物中拉下了MAG1启动子（图7b条)使用跨越TTTTCT基序的两对不同的引物（图7一). 此外，MAG1启动子也同样被多克隆抗ENO2抗体和同一对引物拉下（图7c（c）). 这些结果表明，缓殖子特异性TgENO1和速殖子特异性TgENO2都能与TgMAG1基因启动子结合，这表明核烯醇化酶可能在控制基因表达中发挥作用弓形虫TgENO1的靶向性破坏进一步证实了这一作用，这导致了核基因转录物的改变，并降低了慢性感染小鼠（Mouveaux等。, 2014). 因此，这种兼职酶被认为在脑囊发育中起转录调节作用。

图7 体外染色质免疫沉淀（ChIP）分析显示，TgENO1和TgENO2与缓冲剂TgMAG1启动子的相互作用。(一)用于ChIP产物PCR的TgMAG1中TTTTCT基序的上游和下游引物。(b条)针对缓激肽特异性TgENO1的多克隆抗体从TgMAG1启动子沉淀出ChIP片段。(c（c）)针对速殖子特异性TgENO2的多克隆抗体也能从TgMAG1启动子中拉下ChIP片段。

3.8. 转录调节烯醇酶的进化史

TgENO1和TgENO2的鉴定使具有经验证的转录调节特性的烯醇化酶数量达到4个，其中弓形虫（TgENO1和TgENO2），拟南芥（AtENO2/LOS2）和人类（hENO1/hMPB1）。为了评估已知转录调节烯醇酶之间的进化关系，最大似然使用代表24个系统发育门的157个烯醇化酶氨基酸序列进行系统发育分析（补充图S2）。由此产生的bootstrap共识树揭示了一个复杂的进化历史，与早期关于烯醇化酶插入分布的研究基本一致，因为没有任何单一事件可以解释烯醇化酶类系统发育（Harper&Keeling，2004）). 烯醇化酶的进化史可能是由于横向基因转移、同源性和重组的结合。与本研究最相关的是，DNA结合烯醇酶不具有共同来源。虽然样本大小仅限于四个，但初步分析表明，核定位、DNA结合和转录调控的特性可能是收敛进化的产物。正电荷残基的低保守性被认为表明DNA结合表面（图7)TgENO1、植物ENO2和人类ENO1/MPB1之间（图1)支持建议的收敛进化。未来的研究将表明，这种功能融合是否能够揭示寄生虫和哺乳动物宿主之间的关键结构-功能关系，划定特定的局部区域和功能，以针对寄生虫烯醇化酶，而不会对人类酶产生意外影响。

总之，这项研究提供了缓殖子蛋白的第二个结构分析，专门研究烯醇化酶的多重和差异功能，这反过来可能揭示针对脑寄生虫急性和慢性感染的靶向药物的可变窗口弓形虫.