Complex assembly, crystallization and preliminary X-ray crystallographic studies of MHC H-2Kd complexed with an HBV-core nonapeptide

Zhou, M.; Xu, Y.; Lou, Z.; Cole, D.K.; Li, X.; Liu, Y.; Tien, P.; Rao, Z.; Gao, G.F.

doi:10.1107/S0907444904013587

结晶纸

生物
结晶学

国际标准编号：1399-0047

第60卷| 第8部分| 2004年8月| 第1473-1475页

doi:10.1107/S090744490413587

MHC H-2K的复杂组装、结晶和初步X射线晶体学研究^d日与HBV核心九肽复合

^一中国科学院微生物研究所，北京100080，中华人民共和国，^b条中国科学院研究生院，北京100080，中华人民共和国，^c（c）清华大学结构生物学实验室，北京100084，中华人民共和国^d日英国牛津OX3 9DU牛津大学约翰拉德克利夫医院纳菲尔德临床医学部
^*通信电子邮件：raozh@xtal.tsinghua.edu.cn，george.gao@ndm.ox.ac.uk

(2004年4月21日收到； 2004年6月5日接受)

为了建立小鼠I类主要组织相容性抗原复合物（MHC）H-2K的结构研究系统^d日、细菌表达系统和在体外H-2K复合物的复性制备^d日和人类在一起β₂m和来自乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白残基87-95的免疫优势肽SYVNTNMGL被使用。综合体（45 kDa）结晶；这些晶体属于空间组 P（P）222₁，带有单位-细胞参数一= 89.082,b条= 110.398,c（c）= 47.015 Å,α=β=γ= 90°. 晶体中每种含有一个复合物非对称单元X射线衍射至少2.06 奥分辨率。该结构已由求解分子置换并且是第一个晶体结构肽–H-2K^d日复杂。

关键词：鼠Ⅰ类主要组织相容性抗原复合物;乙型肝炎病毒核心九肽.

1.简介

主要组织相容性复合体（MHC）I类分子（MHC-I）是几乎所有哺乳动物细胞都表达的质膜蛋白，在细胞免疫识别中起着核心作用。它们向细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的T细胞受体（TCR）提供细胞内处理蛋白的短片段（肽）（形成肽-MHC-I复合物，缩写为pMHC-I）。这种特定的选择性识别通过TCR信号转导触发T细胞激活，导致CTL细胞对感染细胞的杀伤（Zinkernagel&Doherty，1974 ; 哈斯金斯等。, 1984 ; 汤森德等。, 1986 ; 比约克曼和帕勒姆，1990年 )从而赋予细胞抵抗病毒感染的免疫力。

pMHC-I分子是具有（I）具有细胞外结构域的多态性膜锚定重链的异源三聚体结构α₁，α₂和α_三，（ii）光不变的可溶性非共价连接β₂-微球蛋白(β₂m）单元和（iii）位于由α₁和α₂重链域（Madden，1995 ).

MHC I类基因的特点是多态性，是迄今为止已知的最具多态性的基因，它赋予每个裂缝独特的空间和化学特征（Trowsdale&Campbell，1992 )进而决定每个MHC I类等位基因的T细胞表位（结合肽）。人类HLA-A2（A*0201）是第一个晶体结构待确定的MHC复合体（比约克曼等。1987一，b条 )很快，小鼠和人类MHC分子的结构与单一肽类（1995年在Madden审查; 琼斯，1997年 ). 对这些结构的分析提高了我们对分裂结构如何影响肽呈现和位于α₁和α₂靠近结合缝隙的螺旋。

本研究的目的是建立一个用于小鼠MHC I类H-2K结构研究的系统^d日该复合物包括一种源自乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（氨基酸87-96）的免疫优势肽。复合体H-2K的结构分析^d日–HBV核心87-96复合物之所以重要，有几个原因。首先，H-2K的结构^d日令人惊讶的是，尽管H-2k^d日-以前的研究已经提出了限制性肽基序，锚定为Tyr位于位置2，Ile或Leu位于位置9（Falk等。, 1991 ; 马力昂斯基等。, 1993 ). H-2K^d日该分子已广泛用于T细胞识别的功能分析，其表位不仅包括许多外来抗原，还包括自身抗原（Amrani等。, 2000 ; 风扇等。, 2000 ); 因此，对H-2K的分析^d日分子结构有助于了解细胞免疫中抗原呈递的细节以及自身免疫性疾病的机制。其次，HBV是一种非细胞病DNA病毒，在全球范围内慢性感染3.5亿人。与许多其他慢性病毒性疾病和癌症一样，它与T细胞的高反应性或耐受性有关（Chisari，1995 ; Chisari&Ferrari，1995年 ). HBV转基因小鼠已经成为评估免疫治疗策略以打破耐受并终止持续HBV感染的模型系统（Chisari，1995). 免疫显性CTL表位内的突变与免疫耐受密切相关（McMichael，1993 ; 贝尔托莱蒂等。, 1994 ). 因此，H-2K复合体的结构知识^d日HBV核心87-96，为免疫显性表位这将有助于研究免疫耐受的结构机制。第三，我们先前发现HBV核心抗原（HBcAg 88–94）的7肽（YVNTNMG）与HBV诱导的肝细胞癌（HCC）患者肝组织中的热休克蛋白（HSP）gp96相关等。, 2001 , 2002). 该肽与小鼠H-2K高度同源^d日-限制性9肽（SYVNTNMGL；核心87-95）。我们还发现，这种7聚体与H-2K结合^d日 在体外（未发表的数据），但亲和力低于9肽。

我们采用了细菌表达系统在体外复合组装制备H-2K晶体^d日与来自HBV核心蛋白残基87–95的肽SYVNTNMGL结合。这个H-2K^d日-限制性肽已被证明在H-2中引发CTL反应^d日DNA疫苗接种小鼠（Kuhrober等。, 1997 ). 我们在此报告了H-2K络合物成功复性、纯化和结晶的条件^d日HBV核心87–95表位。晶体将X射线衍射到2.06以上通过分子替换解决了结构问题。

2.材料和方法

2.1. H-2K的制备^d日和β₂m蛋白作为包涵体

构建H-2K的表达载体^d日重链和β₂m、 H-2K的编码氨基酸1-280的区域^d日人类的重链和氨基酸1-99β₂m通过PCR扩增并克隆到pET-3a中。通过测序验证表达质粒并将其转化为BL21（DE3）pLysS（Novagen）。在310℃培养转化的BL21（DE3）pLysS细胞 Luria中的K–含50的Bertani培养基微克毫升⁻¹羧苄青霉素。异丙基-D类-将硫代吡喃半乳糖苷（IPTG；Sigma）添加到0.5 m的最终浓度M（M）当文化达到OD时₆₀₀0.6。再进行3-4次 310培养h K、收集细菌并将其悬浮在低温磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲液中。使用声波仪进行溶解并在20℃下离心后 000克，用20的溶液将颗粒洗三次米M（M）三氯化氢，100 米M（M）氯化钠，1 米M（M）乙二胺四乙酸二乙酯，1 米M（M）DTT和0.5%Triton X-100。H-2K型^d日和β₂球团主要由m个包裹体组成。

2.2. H-2K的制备^d日复杂的

这基本上是按照威利和同事（加博奇）之前的描述进行的等。, 1992 ). 简单地说，H-2K^d日重链和β₂m个包涵体分别溶解在10m的溶液中M（M）Tris–HCl pH值8.0和8 M（M）尿素。合成的HBV衍生肽（SYVNTNMGL）也溶解在二甲基亚砜（DMSO）中。H-2K型^d日重链，β₂m和肽以1:1:3摩尔比通过稀释进行复性。24-48之后 277孵育小时 K、将可溶性部分浓缩，然后通过色谱法在Superdex G-75（Pharmacia）尺寸排除柱上，然后进行Mono Q（Pharmachia）阴离子交换色谱。

2.3. H-2K结晶^d日复杂的

纯化的复合蛋白（45 kDa）在结晶缓冲液（10）中透析米M（M）Tris–HCl pH 8.0，10 米M（M）NaCl）并浓缩至10 毫克毫升⁻¹使用Crystal Screen（Hampton Research）筛选初始结晶条件。复合物在含有PEG 20的条件下结晶通过改变沉淀剂、蛋白质浓度和添加剂，进一步优化了晶体形成的条件。使用0.1可以获得质量良好的晶体 M（M）MES pH 6.5，18%(w个/v（v）)聚乙二醇20 000, 8%(v（v）/v（v）)二甲基亚砜。291采用悬滴蒸发扩散法进行结晶 K.1公司将µl蛋白溶液与1 µl储层溶液和混合物与200进行平衡 291µl储液罐溶液英国。

2.4. 数据收集和处理

从H-2K收集数据^d日该综合设施是在室内使用Rigaku RU-2000旋转铜节点X射线发生器进行的，该X射线发生器的工作温度为48 kV和98 毫安（铜 K（K）α;λ= 1.5418 ？）带有MAR 345成像探测器。这些晶体被安装在尼龙环中，并在100℃的冷氮气流中进行闪蒸冷却 K使用Oxford低温系统，以贮存溶液作为低温保护剂。使用索引和缩放数据DENZO公司和电子秤组件（Otwinowski&Minor，1997年 ).

3.结果和讨论

H-2K型^d日重链只有在存在β₂m和肽（图1一, 1b条和1c（c）). 重折叠导致约10%的复合物（45 kDa），其可以纯化为同质性由Superdex G-75提供尺寸排除色谱法和Mono Q（Pharmacia）阴离子交换色谱法（图1一, 1b条和1c（c）). 色谱洗脱曲线显示出三个峰，对应于复性络合物（45 kDa；峰值2），非复杂β₂m（峰值3）和非本地聚合产品（峰值1；图1一和1b条). 用Mono Q进一步纯化了复性复合物色谱法以17–26的NaCl浓度洗脱络合物米M（M）（图1c（c）). 此外，我们还发现，如果在第一次复性实验中添加了足够的肽，则第一次复折叠溶液的滤液可以用于进一步的复性，而无需添加肽。

图1
H-2K络合物的纯化^d日通过FPLC Superdex G75凝胶过滤和Mono Q阴离子交换获得HBV核心87–96色谱法。(一)不含肽的复折叠尝试。第一个峰值代表聚集的重链（标记为1）和第二个峰值β₂m（标记为3）。(b条)肽（SYVNTNMGL）存在下的复性。与中的配置文件相比(一)，峰2代表正确折叠的H-2K^d日复合（45 kDa）。(c（c）)复性络合物的进一步纯化阴离子交换。峰值4代表H-2K^d日以17–26的NaCl浓度洗脱米M（M）(d日)SDS-PAGE凝胶（15%）纯化复合物。H-2K车道1^d日包涵体；车道2，β₂m个包裹体；通道3，kDa中的蛋白质标准标记；车道4，纯化复折H-2K^d日复杂，显示H-2K的带^d日和β₂米。

大单晶（图2)出现在5 d在优化的条件下。H-2K^d日复杂晶体属于空间组 P（P）222₁，带有晶胞参数一= 89.082,b条= 110.398,c（c）= 47.015 Å,α=β=γ= 90°. 假设在非对称单元，计算出溶剂含量约为56%。所选数据统计如表1所示.结构确定通过分子置换使用小鼠H-2D的结构^b条复杂（PDB代码第一组2; 天梭牌手表等。, 2000 )由于搜索模型已经成功，详细结构将在其他地方报告。

表1
H-2K的数据收集和处理统计^d日复杂的

“空间”组	P（P）222₁
单位-细胞参数（Ω）	一= 89.082,b条= 110.398,c（c）= 47.015,α= 90,β= 90,γ= 90
波长（Ω）	1.5418
冗余	7.9 (7.7)
观察到的反射	236416
独特的反射	29503
完整性（%）	99.9 (100.0)
我/σ(我)	28.5 (8.1)
R（右）_{sym（对称）}(%)	7.9 (37.9)
R（右）_{sym（对称）}= $[\textstyle\sum_{h}\sum_{l}\|I_{ih}-\langle I_{h{rangle\|/]$ $[\textstyle\sum_{h}\sum_{i}\langle i_{h{rangle]$ ，其中〈我_小时〉是观测值的平均值我_{国际卫生组织}反射的小时.

图2
H-2K的典型晶体^d日–HBV核心87-95复合物，用于数据收集。

脚注

‡这些作者对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

这项工作得到了中国科学技术部973项目（批准号：2001CB510001）的支持。GFG在中国科学院微生物研究所的逗留得到了一家K.C。Wong奖学金。

工具书类

Amrani，A.、Verdaguer，J.、Serra，P.、Tafuro，S.、Tan，R.和Santamaria，P.（2000年）。自然（伦敦），406, 739–742. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Bertoletti，A.、Sette，A.、Chisari，F.V.、Penna，A.、Levrero，M.、De Carli，M.，Fiaccadori，F.和Ferrari，C.（1994年）。自然（伦敦），369, 407–410. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 比约克曼，P.J.和帕勒姆，P.（1990）。每年。生物化学评论。 59, 253–288. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 比约克曼，P.J.，萨珀，M.A.，萨姆劳伊，B.，贝内特，W.S.，斯特罗姆格，J.L.&威利，D.C。（1987年一).自然（伦敦），329, 506–512. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 比约克曼，P.J.，萨珀，M.A.，萨姆劳伊，B.，贝内特，W.S.，斯特罗姆格，J.L.&威利，D.C。（1987年b条).自然（伦敦），329, 512–518. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Chisari，F.V.（1995年）。肝病学，22, 1316–1325. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Chisari，F.V.和Ferrari，C.（1995）。斯普林格·塞明。免疫病理学。 17, 261–281. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Falk，K.、Rotzschke，O.、Stevanovic，S.、Jung，G.和Rammensee，H.G.（1991）。自然（伦敦），351, 290–296. 交叉参考公共医学中国科学院科学网谷歌学者
 Fan，R.、Tykodi，S.S.和Braciale，T.J.（2000年）。免疫学杂志。 164, 1669–1680. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Garboczi，D.N.，Hung，D.T.&Wiley，D.C.（1992年）。程序。美国国家科学院。科学。美国，89, 3429–3433. 交叉参考公共医学中国科学院科学网谷歌学者
 Haskins，K.、Kappler，J.和Marrack，P.（1984年）。每年。免疫学评论。 2, 51–66. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Jones，E.Y.（1997）。货币。操作。免疫学。 9, 75–79. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Kuhrober，A.、Wild，J.、Pudollek，H.P.、Chisari，F.V.和Reimann，J.（1997）。国际免疫学。 9, 1203–1212. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 McMichael，A.（1993）。科学类，260, 1771–1772. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Madden，D.R.（1995）。每年。免疫学评论。 13, 587–622. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Maryanski，J.L.、Luthy，R.、Romero，P.、Healy，F.、Drouet，C.、Casanova，J.L、Jaulin，C.、Kourilsky，P.和Corradin，G.（1993年）。塞明。免疫学。 5, 95–104. 交叉参考中国科学院公共医学谷歌学者
 Meng，S.D.、Gao，T.、Gao、G.F.和Tien，P.（2001）。柳叶刀，357, 528–529. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Meng，S.D.，Song，J.，Rao，Z.，Tien，P.&Gao，G.F.（2002）。免疫学杂志。方法，264，29–35科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Otwinowski，Z.&Minor，W.（1997年）。方法酶制剂。 276, 307–326. 交叉参考中国科学院科学网谷歌学者
 Tissot，A.C.、Ciatto，C.、Mittl，P.R.、Grutter，M.G.和Pluckthun，A.（2000）。分子生物学杂志。 302, 873–885. 科学网交叉参考公共医学中国科学院谷歌学者
 Townsend，A.R.、Rothbard，J.、Gotch，F.M.、Bahadur，G.、Wraith，D.和McMichael，A.J.（1986年）。单元格，44, 959–968. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者
 Trowsdale，J.&Campbell，R.D.（1992年）。《欧洲免疫学杂志》。 19, 45–55. 交叉参考公共医学中国科学院科学网谷歌学者
 Zinkernagel，R.M.&Doherty，P.C.（1974年）。自然（伦敦），248, 701–702. 交叉参考中国科学院公共医学科学网谷歌学者