1.简介
X射线晶体学取决于大型有序晶体的可用性结构确定。在常规同步加速器源处用于衍射数据收集的晶体的最短边通常>50 长度为µm。特别是对于膜蛋白和大型蛋白复合物等困难的靶点,从蛋白质纯化到初始结晶,最后到大的、衍射良好的晶体的路径可能被证明是资源密集型的。此外,大晶体有效地阻止了扩散触发过程的时间分辨研究(Hajdu等。, 2000). 从小于10-20的晶体中收集高质量衍射数据的能力 微米三因此,体积是最理想的。
两个微焦点光束线(Moukhametzianov等。, 2008)以及最近的X射线自由电子激光器(XFEL)(Boutet等。, 2012)允许高分辨率结构测定从这些样品中。在微聚焦光束线的情况下,边长约为20的晶体 µm通常用于结构确定。XFEL允许从晶体1收集数据 µm及更大。这里记录了衍射数据,每个晶体一个图案,然后晶体被高功率X射线脉冲破坏(Barty等。, 2012; 查普曼等。, 2014). 数以百万计的晶体不断地流过X射线束,产生数千个独立的衍射“静止物”,然后对数据进行索引和合并,生成一个看似无损伤的结构。然而,最近的研究表明,即使在XFEL实验中,样品仍然会受到辐射损伤(Nass等。, 2015). 虽然XFEL在纳米晶体成像中显示出巨大的前景,但使用液体喷射时对样品的高要求,即蛋白质毫克数(Weierstall,2014))加上有限的基础设施和高昂的成本是目前的限制因素。
MicroED是最近开发的一种低温电子显微镜(electron cronic microscopy)方法,可从0.1–0.4范围内的极小三维晶体中收集高分辨率电子衍射数据 µm厚(Shi等。,2013年)使用透射电子显微镜。电子是原子结构的优秀探针,因为它们与物质的相互作用比X射线更强,在晶体中沉积的能量更少(Henderson,1995). 不足为奇的是,在过去几十年里,人们多次尝试在三维晶体上进行电子衍射,但直到最近一直未能获得任何精细的原子结构。由于传统的实验装置,通常每个晶体只收集一个单电子衍射图案,但与X射线晶体学不同,在电子显微镜这非常具有挑战性,因为单个衍射图案中通常包含的信息不足(§2.3). 2013年,我们推出了MicroED方法,在该方法中,我们从单个纳米晶体收集了完整的衍射倾斜序列,数据楔形高达90°,使我们能够在2.9°时首先索引和求解溶菌酶的结构 分辨率(Shi等。,2013年)然后用改进的连续旋转法在2.5 奥决议(Nannenga,Shi,Leslie&Gonen,2014)). 目前,连续旋转程序已在许多实验室中使用不同的电子显微镜和不同的探测器(Nederlof、van Genderen等。,2013年; Nannenga、Shi、Hattne等。, 2014; Nannenga,Shi,Leslie&Gonen,2014年; 米仓等。, 2015). 使用这种方法的高分辨率结构已被报道用于溶菌酶、过氧化氢酶和膜蛋白钙ATP酶(Nannenga,Shi,Hattne等。, 2014; Nannenga,Shi,Leslie&Gonen,2014年; 米仓等。, 2015; 表1).
| 溶菌酶(PDB id:3j4克; EMDB编号:EMD-2945;史等。,2013年) | 溶菌酶(PDB id:3j6k个; EMDB编号:EMD-6313;Nannenga,Shi,Leslie&Gonen,2014年) | 溶菌酶(PDB id:5a3e公司; EMDB编号:EMD-6342;Nannenga,Shi,Leslie和Gonen,2014年) | 过氧化氢酶(PDB id:3j7b公司; EMDB编号:EMD-6314;Nannenga、Shi、Hattne等。, 2014) | 钙2+-ATP酶(PDB id:3j7吨; 米仓等。, 2015) | 过氧化氢酶(PDB id:3j7单位; 米仓等。, 2015) | 晶体数量 | 三 | 2 | 1 | 1 | 99 | 58 | “空间”组 | P(P)4三212 | P(P)4三212 | P(P)4三212 | P(P)212121 | C类2 | P(P)212121 | 单位单元格 | | | | | | | 一,b条,c(c)(Å) | 77, 77, 37 | 76.0, 76.0, 37.2 | 75.9, 75.9, 36.9 | 67.8、172.1、182.1 | 166.3, 64.4, 147.3 | 69.0, 173.5, 206.0 | α,β,γ(°) | 90, 90, 90 | 90, 90, 90 | 90, 90, 90 | 90, 90, 90 | 90, 98.3, 90 | 90, 90, 90 | 分辨率(Ω)† | 2.9 (3.1–2.9) | 2.5 (2.6–2.5) | 2.5 (2.6–2.5) | 3.2 (3.4–3.2) | 3.40 (3.47–3.40) | 3.20 (3.27–3.20) | 多重性 | 34 | 4.8 | 3.4 | 2.4 | 15.8 | 20.8 | 完整性(%)† | 92 (57) | 97.2(90.2) | 80.1 (80.1) | 79.4 (75.5) | 67.5 (65.7) | 73.0 (72.8) | R(右)工作/R(右)自由的(%) | 25.5/27.8 | 22.0/25.5 | 21.3/25.3 | 26.2/30.8 | 27.7/31.5 | 27.2/31.7 | R.m.s.d.债券(Au) | 0.051 | 0.003 | 0.003 | 0.006 | 0.01 | 0.01 | R.m.s.d.角(°) | 1.587 | 0.60 | 0.60 | 1.05 | 1.03 | 1.04 | | †括号中的值反映最高分辨率外壳。 |
2.方法
虽然样品制备、显微镜设置和数据收集可能因实验室而异,但我们在下面详细介绍了成功进行MicroED实验所采用的协议。
2.1、。样品制备
由于尺寸较小,很难对适用于MicroED的纳米晶进行初步鉴定。而手性晶体的二阶非线性光学成像(SONICC)(基西克等。, 2011)可以提供一种自动和客观的方法来识别小晶体,到目前为止,我们一直依赖于视觉判断例如水滴浑浊,然后是阴性染色电子显微镜。当发现合适的晶体时,约4 将微晶溶液中的微晶微晶分配给在辉光放电装置中清洁过的多孔碳或连续碳网格。晶体可以沉淀30 s,用滤纸吸干,从格栅中去除多余溶液。需要去除足够的溶液,以最小化背景贡献,并允许电子束在随后的曝光过程中穿透样品;然而,过多的吸墨剂会使晶体脱水并损坏晶体。因为很难在太厚的样品和被过度吸墨剂损坏的样品之间取得适当的平衡,所以准备几个吸墨剂时间、温度和湿度范围广泛的网格通常是有益的。
格栅可以用手或使用自动玻璃化设备进行吸墨剂和冷冻。自动化系统由于其高再现性和对吸墨剂条件(如时间和力)的精细控制,通常更可取。如果缓冲液太粘稠,无法有效去除,晶体很脆弱,或者如果溶液流动带走了太多晶体,则可能需要用滤纸轻轻接触网格背面,手动吸干网格。
吸液后,立即将格栅插入液态乙烷中。高导热系数液态乙烷确保样品冷冻足够快,以防止晶格在冷却过程中,即使没有防冻剂。然后,将冷冻的格栅迅速转移到一个冷冻箱中,在那里可以在低温下长期储存。或者,在制备网格后,可以立即在电子显微镜中对其进行检查。成功的吸干和冷冻是一个反复试验的过程,必须针对每个样品单独进行优化。