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HIV-1和IL-1β通过丝裂原活化蛋白激酶和核因子调节星形胶质细胞CD38-κB信号机制

神经炎杂志 体积 8，物品编号：145(2011)引用这篇文章

摘要

背景

在大约一半的病例中，感染人类免疫缺陷病毒1型（HIV）-1会导致某种形式的HIV-1相关神经认知障碍（HAND）。星形胶质细胞导致HIV-1相关痴呆（HAD）（最严重的HAND）的机制仍然没有解决。HIV-1脑炎（HIVE）是HAD的一种病理相关性疾病，约影响9-11%的HIV-1感染人群。我们的实验室之前已经证明HIVE脑组织中星形胶质细胞中CD38显著上调，CD38是一种参与钙信号传递的酶。我们还报道了白细胞介素（IL）-1β激活的星形胶质细胞中CD38表达的增加。在本研究中，我们研究了HIV-1相关刺激激活的星形胶质细胞中CD38基因表达的调控机制。我们还研究了丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和核因子（NF）-κB在星形胶质细胞CD38调节中的作用。

方法

用HIV-1转染培养的人类星形胶质细胞YU-2号机组采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）基因表达分析、western blot分析和免疫组化检测前病毒克隆及CD38 mRNA和蛋白水平。通过ELISA分析促炎性趋化因子水平来测定病毒转染对星形胶质细胞的激活。为了评估MAPK和NF-κB在CD38调节中的作用，在激活IL-1β之前，用MAPK抑制剂（SB203580、SP600125、U0126）、NF-κ子B干扰肽（SN50）或显性阴性IκBα突变体（IκB-αM）转染星形胶质细胞。CD38基因表达和CD38 ADP-核糖基环化酶活性测定分别用于分析CD38水平和功能的变化。

结果

艾滋病病毒1型YU-2号机组-转染显著增加星形胶质细胞中CD38 mRNA和蛋白的表达（p<0.01），呈剂量依赖性，并诱导星形胶质细胞活化。IL-β-激活HIV-1YU-2号机组-转染星形胶质细胞显著增加HIV-1基因表达（p<0.001）。用MAPK抑制剂或NF-κB抑制剂SN50治疗可消除IL-1β诱导的星形胶质细胞CD38表达和活性，而不会改变基础CD38水平（p<0.001）。IκBαM转染也显著抑制了IL-1β介导的星形胶质细胞CD38表达和活性的增加（p<0.001）。

结论

本研究结果表明，HIV-1和病毒诱导的促炎性刺激物直接参与调节星形胶质细胞CD38水平。艾滋病病毒1型YU-2号机组-转染有效诱导HIV-1第页24蛋白表达并激活星形胶质细胞上调CCL2、CXCL8和CD38。在星形胶质细胞中，IL-1β诱导的CD38水平升高通过MAPK信号通路和转录因子NF-κB进行调节。未来的研究可能会着眼于了解CD38在应对感染中的作用，以及它在HAND中的作用。

背景

人类免疫缺陷病毒（HIV）-1感染中枢神经系统（CNS）后不久，几乎50%的感染者会出现神经认知障碍[1]. 这些疾病统称为HIV-1相关神经认知障碍（HAND），由于感染者的寿命更长，抗逆转录病毒药物在血脑屏障中的渗透性较差，其发病率正在上升[2]. HIV-1相关性痴呆（HAD）是最严重的HAND，即使在抗逆转录病毒治疗时代，也会影响9-11%的HIV-1感染者[三]. HIV-1脑炎（HIVE）是HAD的病理相关性，其特征是细胞因子/趋化因子失调和神经胶质细胞活化[4]. 除了巨噬细胞和小胶质细胞外，星形胶质细胞也被认为是HIV-1神经发生的重要因素[5]. 感染的小胶质细胞和活化的星形胶质细胞有助于神经毒性，这是由两种细胞类型之间的信号交换间接导致CNS内潜在有毒分子的分泌，包括白细胞介素（IL）-1β[6]. 星形胶质细胞与神经元密切接触，能够感知神经元的活动。因此，星形胶质细胞中由递质受体介导的细胞内钙浓度对决定神经元活动很重要[7]. 总之，参与钙信号传导的酶是研究星形胶质细胞活化和HIV-1神经病变机制的重要靶分子。

人CD38是一种45kDa II型单通道跨膜糖蛋白，由早期造血细胞表达，在成熟细胞中丢失，并由大脑中活化的淋巴细胞和星形胶质细胞重新表达[8]. 它的亚细胞定位表明在神经元和星形胶质细胞的不同部位有多种作用。CD38的胞外区作为一种钙动员外酶，具有二磷酸腺苷（ADP）-核糖基环化酶和环ADP-核糖（cADPR）水解酶活性[9]. cADPR被认为是神经元钙信号的第二信使[10]. 在HIV-1感染的患者中，T细胞CD38表达增加表明疾病进展，而CD38表达减少是抗逆转录病毒治疗有效性的良好指标[11]. CD38的三维结构显示该分子的一个肽区可以干扰HIV-1-CD4受体的相互作用，即病毒进入细胞的入口[12]. 这使得该分子成为研究HIV-1相关神经疾病的有趣靶点。

CD38被多种细胞因子、雌激素和维生素D3上调[13]. 我们早期的研究表明，白细胞介素（IL）-1β上调星形胶质细胞CD38的水平，HIV-1包膜糖蛋白（gp120）增强了这种作用[14]. 这导致细胞内钙浓度升高[14]并干扰星形胶质细胞的谷氨酸转运[15]最终导致兴奋性神经元损伤[16].

星形胶质细胞的HIV-1感染是限制性的和非生产性的（如[17]). 这使得很难研究病毒对星形胶质细胞生物学的直接影响。为了克服HIV-1进入星形胶质细胞的限制，在当前的研究中，我们采用了高效转染技术来直接传递HIV-1YU-2号机组质粒进入星形胶质细胞。这使我们能够模拟HIV-1基因表达和复制单独对星形胶质细胞激活和CD38调节的直接影响。我们的实验室此前已经显示，HIV-1感染的人类脑组织中星形胶质细胞CD38表达增加[18]. 位于人类第4染色体上的CD38基因受生理刺激调节，如肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-1β和干扰素-γ，这些刺激由活化的星形胶质细胞产生[19–21]. CD38基因的5'上游区域没有TATA和CAAT盒，并且存在激活蛋白-1和核因子（NF）-κB等转录因子的各种结合位点[22]. 导致NF-κB在各种刺激下活化的信号级联中的主要成分是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）。MAPK是一个丝氨酸苏氨酸激酶家族，由细胞外信号调节激酶（ERK）、p38激酶（p38Ks）和c-Jun N末端激酶（JNK）组成，可以调节星形胶质细胞生物学的各个方面[23–25]. IL-1β可介导混合胶质细胞ERK1/2、p38Ks和JNK磷酸化的激活，可能在神经炎症中起重要作用[26]. 激活后，MAPK可以在转录、翻译和翻译后水平调节基因表达。IL-1β是HIV-1相关炎症介质[27]并调节星形胶质细胞中的NF-κB[28]. 我们之前已经证明CD38在IL-1β激活的星形胶质细胞中上调[14].

在本研究中，我们假设MAPK信号系统参与CD38基因表达的上调，以响应HIV-1相关刺激，如HIV-1YU-2号机组和IL-1β，通过NF-κB转录因子。我们发现，诱导HIV-1基因在星形胶质细胞中的表达和复制，以及IL-1β的刺激，通过MAPK-NF-κB依赖机制增加CD38的表达水平。因此，本文提供的数据为CD38在星形胶质细胞介导的神经炎症过程中的作用提供了重要线索，该过程涉及神经退行性疾病，如HAND。

方法

人原代星形胶质细胞的分离培养

如前所述，人类星形胶质细胞是从完全符合NIH、内布拉斯加州大学医学中心、华盛顿大学和北德克萨斯州健康科学中心道德准则的选择性流产标本中分离出来的[29]. 简单地说，对脑组织进行解剖和机械分离。细胞悬浮液离心，悬浮在培养基中，并以20×10的密度进行电镀6电池/150厘米2用胰蛋白酶处理粘附的星形胶质细胞，并在类似条件下培养，以提高复制星形胶质细胞的纯度。通过免疫细胞化学染色检测胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和小胶质标记物CD68，星形胶质细胞制剂的常规纯度>99%，以排除任何小胶质细胞污染以及小胶质细胞在炎症反应中的作用。

RNA提取和基因表达分析

分离RNA（如[30])从随后的切片中描述的星形胶质细胞中提取，并通过实时PCR检测基因表达。TaqMan 5'核酸酶实时PCR使用ABI Prism 7900序列检测系统（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行。商用TaqMan®基因表达分析用于测量CD38和GAPDH mRNA水平（应用生物系统）。GAPDH是一种普遍表达的看家基因，用作内部正常化对照。30μl反应在48℃下进行30 min，95℃下进行10 min，然后在96 well光学实时PCR板上进行40个95℃循环15 s和60℃循环1 min。

艾滋病病毒1型YU-2号机组-星形胶质细胞的IκBα突变体转染

用HIV-1转染原代人星形胶质细胞YU-2号机组（摘自NIAID艾滋病司艾滋病研究和参考试剂项目：pYU-2，来自Beatrice Hahn博士和George Shaw博士[31])或IκBα突变体（IκB-αM，addgene质粒12330，由Inder M Verma博士保存[32])质粒，使用Amaxa大鼠星形胶质细胞Nuclefector试剂盒（Lonza Walkersville Inc.，Walkersville，MD，USA）。简单地说，将星形胶质细胞悬浮在核载体溶液和HIV-1中YU-2号机组质粒（0.2、0.3、0.4、0.8μg/150万细胞）或IκBβM质粒（40μg/800万细胞），并使用Nucleofector/Shuttle（Lonza）设备转染。为了评估转染效率，从HIV-1的多个微孔中采集了7张图像YU-2号机组-转染星形胶质细胞与GFAP阳性和HIV-1的数量第24页对每个图像中的阳性细胞进行独立计数。然后以百分比的形式计算两个标记阳性的细胞数。转染细胞补充星形胶质细胞培养基，并在电镀前在37°C下培养30分钟。电镀后12至24小时，洗涤细胞，并加入无血清星形胶质细胞培养基（含或不含IL-1β20ng/ml）8小时至7天。

星形胶质细胞治疗和激活

用或不用MAPK抑制剂SB 203580（20μM）、SP 600125（20μM）和U0126（20μL，Sigma-Aldrich Inc.，St Louis，MO）或NF-κB转位到细胞核的肽抑制剂SN50（18μM）或相应的对照突变肽SN50（M）（18μM，Sigma）、，如前所述，在无血清星形胶质细胞培养基中激活IL-1β（20 ng/ml）8小时前1小时[14,18]. 该剂量在5-100 ng/ml的范围内，目前许多其他组使用该剂量激活星形胶质细胞[33]和动物模型中诱导的水平[34,35].

蛋白质的测量

通过测定病毒衣壳蛋白HIV-1测定星形胶质细胞中病毒基因的表达第24页转染后5天通过免疫细胞化学测定。模拟和HIV-1YU-2号机组-转染的星形胶质细胞如前所述进行免疫标记[29]携带HIV-1第24页抗体（1:10，Dako Corp Inc.，Carpindia，CA）、GFAP抗体（1:1000，Dako）和/或CD38抗体（1:100，Novo Castra，United Kingdom），用于评估病毒表达和CD38表达。用HIV-1定量全细胞或培养上清液中的蛋白质表达第24页HIV-1感染后1、2、4和5天的ELISA（Perkin Elmer Inc，Waltham，MA）、CCL2和CXCL8 ELISA（R&D systems Inc.，Minneapolis，MN）YU-2号机组-转染。

ADP-核糖基环化酶活性的测定

使用荧光循环分析法定量初级星形胶质细胞裂解物的ADP-核糖基环化酶活性，该方法测量cADPR和烟酰胺产生的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），如[36]. 简单地说，细胞在含有蛋白酶抑制剂的Tris-subesure缓冲液（pH 7.2）中采集。含有5μg总蛋白的细胞裂解物与10 mM或不含烟酰胺的细胞裂解液在0.45 mM cADPR存在下孵育。NAD通过产生荧光产物的循环反应进行定量。在FLOOStar Galaxy荧光计（BMG Biotechnologies，Durham，NC，USA）中量化荧光（544nm激发，590nm发射），并计算荧光发射速率。使用已知NAD标准生成的标准曲线计算实验性反环化酶反应中生成的NAD数量。ADP-核糖基环化酶活性以每分钟每毫克总蛋白NAD的微粒体表示。

蛋白质印迹分析

用1X Laemmli样品缓冲液将等量的蛋白质样品（25μg）煮沸5-10分钟，通过10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后使用i-Blot（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）转移到硝化纤维素膜上。将膜与抗人鼠CD38抗体（1:250，BD Biosciences）在4℃孵育过夜，清洗，然后在室温下与辣根过氧化物酶（1:5000，Bio-Rad）结合的抗鼠山羊抗体IgG孵育2 h。然后在Flourochem HD2成像仪（ProteinSimple，Inc.Santa Clara，CA）中使用SuperSignal west femto底物（伊利诺伊州罗克福德的赛默飞世尔科学公司）开发膜。α-微管蛋白（1:1000，细胞信号）免疫印迹用作负荷对照。

星形胶质细胞代谢活性的测定

按照上述实验操作，向星形胶质细胞培养基中添加5%（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）试剂，并在37°C下培养20-45分钟。MTT被活细胞代谢还原为紫色的甲霜结晶。去除MTT溶液，轻轻搅拌，将晶体溶解在DMSO中15分钟。在Spectromax M5微孔板阅读器（加利福尼亚州桑尼维尔市分子器件公司）中，在490 nm处测定二甲基亚砜/晶体溶液的吸光度。

统计分析

使用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析，采用单向方差分析（ANOVA）和Newman-Keuls后验进行多重比较。显著性设为p<0.05，数据表示平均值+/-标准误差（S.E.M.）。所提供的数据代表了两个或更多独立捐赠者至少三个独立实验。

结果

艾滋病病毒1型YU-2号机组-转染增强星形胶质细胞中CD38的表达

星形胶质细胞缺乏表面CD4；因此病毒只能感染一小部分细胞在体外和体内[37]. 我们已经证明，IL-1μ单独或与HIV-1gp120联合使用可导致培养的人类星形胶质细胞中CD38的表达和功能增加[18]. 在这项研究中，我们使用星形细胞转染HIV-1前病毒DNA来绕过受体限制，使HIV-1能够进入细胞内YU-2号机组病毒基因组，脑源性分离物。为了确定HIV-1在调节星形胶质细胞CD38水平中的作用，我们将HIV-1转染星形胶质细胞YU-2号机组基因表达质粒并测定CD38 mRNA和蛋白水平。转染后一天，HIV-1中CD38 mRNA水平显著增加YU-2号机组-转染细胞与模拟细胞的比较（图1安培，p<0.01）。此外，为了评估CD38在翻译水平上的表达，在转染5天后通过western blot和密度测定分析全细胞蛋白裂解物。艾滋病病毒1型YU-2号机组-与mock相比，转染星形胶质细胞的CD38蛋白水平显著增加（归一化为α-微管蛋白）。还用IL-1β（20 ng/ml）处理星形胶质细胞，作为CD38蛋白水平升高的阳性对照。（图1B年，p<0.01）。同时，对星形胶质细胞进行CD38和HIV-1免疫分析第24页，转染后5天。艾滋病病毒1型第24页HIV-1中有明显的抗原表达YU-2号机组-通过HIV-1共定位免疫染色（黄色）转染星形胶质细胞第24页（绿色）带GFAP（红色；图一维)，但不在模拟中（图1摄氏度). 艾滋病病毒1型YU-2号机组-转染的星形胶质细胞表现出更强烈的CD38染色（图1楼)与模拟相比（图1E级). 此外，CD38（绿色）与HIV-1共定位第24页（红色，图1楼)在HIV-1中YU-2号机组-转染星形胶质细胞。综上所述，HIV-1YU-2号机组-转染显著增加星形胶质细胞中CD38 RNA和蛋白质水平。HIV-1的转染效率YU-2号机组通过GFAP、HIV-1评估，质粒通常为90%第24页共染色（图2).

图1
图1

星形胶质细胞HIV-1 YU-2号机组 -转染增加CD38表达.用HIV-1转染培养的人类星形胶质细胞YU-2号机组质粒和模拟转染对照保持平行。转染后24小时分离RNA并检测CD38水平。（A）通过实时PCR检测，在HIV-1中检测到显著较高的CD38 mRNA水平YU-2号机组-转染星形胶质细胞与模拟对照组相比（p<0.05）。（B）艾滋病病毒1型YU-2号机组-与模拟对照组相比，转染星形胶质细胞在转染后5天通过全细胞蛋白裂解物的western blot和密度测定分析显示CD38蛋白水平显著升高（p<0.01）。IL-1β（20 ng/ml）处理的星形胶质细胞作为CD38 mRNA和蛋白水平增加的阳性对照。图表显示了两个独立捐赠者的代表性数据。转染5天后用免疫细胞化学方法检测CD38和HIV-1p24的表达（C-F）DAPI对所有面板的细胞核进行蓝色染色。（C）无HIV-1p24表达的模拟GFAP阳性星形胶质细胞（红色）。（D）HIV-1中GFAP（绿色）和HIV-1p24（红色）的共定标（黄色）YU-2号机组-转染星形胶质细胞。GFAP、HIV-1p24共同定位评估的常规转染效率为90%（数据未显示）（E）模拟对照中基本CD38表达（绿色），无HIV-1p24表达。（F）HIV-1中CD38表达增加（绿色）和与HIV-1p24（红色）共定位（黄色）YU-2号机组-转染的星形胶质细胞。原始放大倍数x200。

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图2
图2

HIV-1的转染效率 YU-2号机组 培养人星形胶质细胞的基因表达质粒.评估培养的人类星形胶质细胞与HIV-1的转染效率YU-2号机组，使用Amaxa大鼠星形胶质细胞Nucleofector试剂盒将0.3μg/150万细胞转染星形胶质细胞，并将其置于48孔组织培养板中10 5细胞/孔。转染后3天和5天，固定细胞，并用星形胶质细胞标记物、GFAP（绿色）和HIV-1进行免疫细胞化学标记第24页（红色）。从HIV-1的多个微孔中拍摄了7张图像YU-2型-转染星形胶质细胞与GFAP阳性和HIV-1的数量第24页每个图像中的阳性细胞独立计数。然后以百分比的形式计算两个标记阳性的细胞数。（A）第三天的代表性图像（200倍，原始放大），（B）第五天的代表性图像（200倍，原始放大）（C）分析第3天和第5天的所有图像后，双阳性细胞百分比。HIV-1的平均转染效率为90%YU-2号机组用此方法在培养的人星形胶质细胞中表达基因质粒。

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CD38 mRNA表达与HIV-1病毒基因表达相对应YU-2号机组-转染星形胶质细胞

CD38在HIV-1中的表达呈剂量依赖性增加（0.2、0.4和0.8μg/150万细胞）YU-2号机组-通过RT-PCR在第1天测量转染的星形胶质细胞（图3A级，p<0.001），与HIV-1增加相对应第24页表达式（未显示数据）。HIV-1未改变代谢活性水平YU-2号机组转染（20和40μg/150万细胞）与模拟细胞相比。然而，在0.8μg/150万细胞中，代谢活性在第7天显著降低（图第3页，p<0.001）。在随后的实验中，星形胶质细胞被转染0.3μg HIV-1YU-2号机组在第五天测定质粒、mRNA和蛋白质水平，以确保HIV-1的生存能力YU-2号机组-在实验期间，转染的星形胶质细胞没有受到损害。

图3
图3

CD38 mRNA表达与HIV-1病毒基因表达相对应 YU-2号机组 转染星形胶质细胞用HIV-1剂量转染星形胶质细胞YU-2号机组质粒0.2、0.4和0.8μg/150万个细胞，并测定CD38的表达和细胞活力。（A）HIV-1感染24小时后YU-2号机组-转染后，CD38的表达以剂量依赖性的方式显著增加（p＜0.001）。（B）HIV-1未改变代谢活性水平YU-2号机组与mock相比，转染0.2和0.4μg。然而，0.8μg时，第7天代谢活性显著降低（p<0.001）。在随后的实验中，用0.3μg转染星形胶质细胞，并在第五天测定mRNA和蛋白质水平，以确保HIV-1的活性YU-2号机组-在实验期间，转染的星形胶质细胞没有受到损害。

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艾滋病病毒1型YU-2号机组-转染导致HIV-1相关蛋白表达和星形胶质细胞活化

由于趋化因子CCL2和CXCL8的产生与星形胶质细胞活化有关[38]，我们在HIV-1感染后的培养上清液中测量了它们的水平YU-2号机组-不同时间点转染。病毒转染导致星形胶质细胞活化，从第一天到第五天CCL2和CXCL8的生成逐渐增加就可以明显看出。HIV-1患者CCL2和CXCL8水平显著升高YU-2号机组-第2天和第5天转染星形胶质细胞与相应模拟对照组和第1天HIV-1的比较YU-2号机组-转染的星形胶质细胞（图4A-B型分别为p<0.001）。为了确保转染后病毒蛋白的成功表达，HIV-1第24页通过ELISA测定水平。艾滋病病毒1型第24页水平在第2天增加了约两倍，在第5天增加了大约13倍（图4摄氏度，p<0.001）。这些观察结果与之前的工作一致，显示星形胶质细胞在水疱性口炎病毒假HIV-1感染五天后激活[39]. 已知IL-1β和TNF-α可重新激活星形胶质细胞的潜在或非生产性HIV-1感染[40]以NF-κB依赖的方式[41]. 在这个HIV-1基因表达模型中，IL-1β激活显著增加HIV-1第24页HIV-1的表达YU-2号机组-第4天和第7天的转染细胞（图4天，p<0.001）。由于IL-1β在脑巨噬细胞和小胶质细胞中上调，并且是CD38的有效激活剂，因此在IL-1β诱导的CD38表达的背景下进行了后续的信号研究。人类星形胶质细胞感染HIV-1YU-2号机组-表达质粒被激活并显示CD38水平增加在体外这些数据表明HIV-1YU-2号机组人类星形胶质细胞中的表达导致CD38表达增强和促炎性趋化因子的产生。

图4
图4

艾滋病病毒1型 YU-2号机组 -转染的星形胶质细胞具有剂量和时间依赖性的促炎性趋化因子水平.遵循HIV-1YU-2号机组-ELISA检测转染后HIV-1p24、CCL2和CXCL8水平。（A）艾滋病病毒1型YU-2号机组-与相应的模拟对照组和HIV-1第1天相比，转染显著增加培养上清液累积CCL2水平2和5天YU-2号机组-转染星形胶质细胞（p<0.001）。（B）HIV-1感染后，上清液中的星形胶质细胞CXCL8水平也显著增加YU-2号机组-转染与模拟对照组相比（p<0.001）。HIV-1中的CXCL8水平YU-2号机组-转染5天后，转染星形胶质细胞与前一天相比继续显著增加（p<0.05）。（C）在转染后1、2和5天，检测总细胞提取物中的累积HIV-1p24水平，以量化病毒蛋白表达。艾滋病病毒1型YU-2号机组-与模拟相比，转染在第2天和第5天显著增加了HIV-1p24水平（p＜0.001）。（D）在HIV-1中YU-2号机组-转染的星形胶质细胞经IL-1β处理和不经IL-1β处理后，在第4天和第7天均观察到HIV-1p24的表达显著增加（p<0.001）。

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MAPK调节IL-1β诱导的CD38表达活化

为了研究MAPK（p38Ks、JNK和ERK）在调节星形胶质细胞CD38表达中的作用，我们使用了一组靶向MAPK的药物抑制剂。IL-1β与HIV-1相关的炎症介质[27,42,43]在培养的人类星形胶质细胞中，已显示激活ERK、p38Ks和JNK磷酸化[26,44]. 虽然抑制单个MAPK（p38Ks、JNK或ERK）并没有显著降低（p>0.05）基础CD38 mRNA表达，但它们各自的阻断剂（p38K：SB203580，图第5页; JNK:SP600125，图5亿和ERK:U0126，图5摄氏度)，显著消除了IL-β对CD38表达的诱导作用（p<0.001）。因此，p38Ks、JNK和ERK MAPKs的激活可能有助于IL-1β激活的星形胶质细胞中CD38 mRNA表达的增加。ADP核糖基环化酶测定作为CD38功能的测量，显示IL-1β诱导的CD38 ADP核糖基环化酶活性在用各自的药物阻断剂抑制p38Ks、JNK和ERK后显著降低（图5天，p<0.001）。因此，我们得出结论，JNK、p38Ks和ERK均参与调节IL-1β激活的人类星形胶质细胞中CD38的表达和功能。

图5
图5

MAPKs调节IL-1β活化星形胶质细胞CD38的表达和功能在用各种MAPK抑制剂预处理1小时后，用20 ng/ml的IL-1β激活原代星形胶质细胞。未处理的对照组保持平行。CD38 mRNA水平用实时PCR测定，CD38活性用cADPR环化酶分析作为CD38功能的测定。正如预期的那样，与未经治疗的对照组相比，仅IL-1β显著增加CD38的表达和活性（p<0.001，所有小组）。抑制剂预处理后，基础CD38表达无变化（p>0.05，A-C）。IL-1β诱导的CD38mRNA表达的增加通过用特异于（A）第38页，SB203580（p<0.001）（B）JNK、SP600125（p<0.001）和（C）ERK、U0126（p＜0.001）。（D）每种MAPK抑制剂的预处理显著抑制了星形胶质细胞中IL-1β介导的CD38 cADPR环化酶活性（p<0.001）。

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IL-1β活化星形胶质细胞中CD38的表达和功能依赖于NF-κB

NF-κB是人原代星形胶质细胞IL-1β信号转导的主要介质之一[45]. 为了确定NF-κB在IL-1β介导的CD38调节中的作用，培养的星形胶质细胞预先用NF-κ子B转位到细胞核的肽抑制剂SN50（18μM）或非抑制对照SN50M（18μM）处理。然后用20 ng/ml的IL-1β激活细胞8小时。与IL-1β单独作用相比，SN50治疗显著抑制了IL-1β诱导的CD38表达增加（图6A级，p<0.001）。正如预期的那样，对照肽SN50M没有抑制IL-1β介导的CD38水平的增加（图6A级). 为了进一步证实NF-κB在IL-1β介导的CD38表达中的作用，用IκBαM转染原代星形胶质细胞，然后用IL-1β激活8小时。IκB-αM阻止Iκ-BαM从NF B复合体中磷酸化和随后的位移，从而抑制NF-kb B活性。与模拟细胞和IL-1β活化细胞相比，IκBαM转染消除了IL-1β介导的CD38表达增加（图6亿，p<0.001）。IκBαM转染细胞中的基本CD38表达未受影响。为了进一步证实NF-κB对CD38功能的调节作用，我们检测了转染星形胶质细胞全细胞裂解物中CD38 ADP-核糖基环化酶的活性。正如预期的那样，IκBαM转染的星形胶质细胞的CD38环化酶活性可以忽略不计，这表明NF-κB通路中的一个分子块阻断了CD38的功能（图6摄氏度，p<0.001）。因此，我们得出结论，NF-κB是IL-1β介导的星形胶质细胞CD38 mRNA表达和活性增加的重要调节器。

图6
图6

NF-κB调节IL-1β活化星形胶质细胞中的CD38在存在或不存在NF-κB抑制剂、SN50或IκBαM的情况下，用或不使用IL-1β激活培养的人类星形胶质细胞。CD38 mRNA表达用实时PCR测定，CD38活性用cADPR环化酶测定。（A）与IL-1β活化的星形胶质细胞相比，用NF-κB受体阻滞剂SN50预处理IL-1β激活的星形胶质胶质细胞，CD38 mRNA水平显著降低（p<0.001）。然而，SN50M治疗并不影响星形胶质细胞的IL-1β反应。（B）IκBαM转染消除了IL-1β介导的CD38 mRNA水平的增加（p<0.001），而不影响未治疗星形胶质细胞的基础CD38水平（p>0.05）。（C）与模拟转染的IL-1β活化星形胶质细胞相比，IκBαM转染的白细胞介素-1β活化的星形胶质细胞CD38环化酶活性显著降低（p<0.001）。

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讨论

在之前的一项研究中，我们的实验室报告了HIVE脑中CD38表达增加，该表达与炎症区域的星形胶质细胞共存[18]. 该研究确立了CD38在调节星形胶质细胞神经炎症反应中的重要作用。在这里，我们通过研究星形胶质细胞中CD38调节的分子机制和信号通路来扩展我们的分析。在本研究中，我们发现HIV-1介导的星形胶质细胞CD38直接上调。星形胶质细胞感染HIV-1YU-2号机组基因表达质粒不仅增加了CD38mRNA和蛋白质水平，还导致星形胶质细胞的活化，如趋化因子CXCL8和CCL2的产生增加所示。体内增加的CCL2被认为有助于吸引单核细胞穿过血脑屏障。这也暗示在病毒进入中枢神经系统后不久，前炎症趋化因子CCL2就会出现在大脑中[46]. 结果表明，少量受感染星形胶质细胞产生的趋化因子可能导致免疫细胞募集和随后激活未受感染的星形胶质细胞，从而进一步上调星形胶质细胞CD38的整体水平。正如我们之前报道的那样，CD38酶活性的增加导致cADPR水平的增加以及活化星形胶质细胞内钙流量的相应增加[14,18]. CD38/cADPR系统被认为可以启动星形胶质细胞到神经元的钙信号传递，从而导致胶质细胞释放更多的神经调节剂[47]. 钙信号失衡可能最终导致神经元功能障碍[48].

星形胶质细胞可能无法从头开始病毒复制，但HIV-1感染的星形胶质细胞可以将病毒传播到CD4+细胞。病毒颗粒是从星形胶质细胞中释放出来的，没有逆转录。虽然这种感染方式不会增加病毒载量；然而，它可以导致病毒持续存在并在中枢神经系统传播[49,50]. 因为星形胶质细胞增生是早期CNS HIV-1感染的一个显著特征[51,52]星形胶质细胞在感染早期可能具有神经保护作用。然而，星形胶质细胞在慢性HIV-1中枢神经系统感染和免疫激活过程中的功能障碍可能导致神经毒性[5,39,53]. 星形胶质细胞感染和/或HIV-1激活的确切功能后果尚不清楚。因此，使用HIV-1质粒转染星形胶质细胞的模型系统，我们可能能够了解病毒基因表达对星形胶质细胞功能的直接影响及其在HIV-1-CNS感染期间对神经毒性的最终影响。

对于各种HIV-1蛋白或HIV-1基因表达和复制模型，星形胶质细胞中IL-1β表达增加的报道尚未见报道[54–56]. 然而，HIV-1感染者的脑组织中IL-1β升高[52]在HIV-1感染的促炎环境中，受感染/激活的免疫细胞上调并分泌[27]IL-1β自分泌环的诱导导致进一步产生IL-1β和其他细胞因子[57]. 已知IL-1β和TNF-α也可重新激活星形胶质细胞的潜在或非产生性HIV-1感染[40]以NF-κB依赖的方式[41]. 因此，随后在IL-1β诱导的CD38表达的背景下进行了信号传导研究。

我们评估了转录因子NF-κB在CD38调节中的作用。我们的研究表明，用SN50（NF-κB的一种细胞通透性肽抑制剂）预处理星形胶质细胞，可以阻断IL-1β活化时预期的CD38上调。这一发现强烈强调了IL-1β介导的基因上调涉及转录因子NF-κB。在星形胶质细胞瞬时转染IκBαM后，CD38表达和酶活性减弱，进一步支持了这一点，这阻碍了NF-κB的激活。了解这种信号通路在HIVE等神经炎症状态下的调节可能具有重要的治疗意义。转录因子NF-κB是IL-1β信号通路中的关键介质，是星形胶质细胞诱导细胞因子、趋化因子和粘附分子的主要驱动力；也是HIVE期间重要的炎症介质[58]. 刺激后，NF-κB激活的持续时间可能是短暂的或持续的，取决于细胞刺激和细胞类型。有趣的是，已有研究表明，IL-1β刺激可能导致NF-κB激活延长，从而表明其在与HIVE相关的神经炎症中的意义[59]. 因此，综上所述，这些发现表明NF-κB是活化星形胶质细胞中CD38表达和酶活性的主要调节因子之一。

我们还研究了MAPK在CD38调节中的作用，因为NF-κB是MAPK信号级联中的下游转录因子。新的证据表明，MAPK信号通路可能在活化的胶质细胞诱导的神经元功能障碍中发挥重要作用[60]. MAPK在细胞外信号转导到细胞反应中起重要作用。当激活时，这些激酶可以磷酸化细胞溶质和核靶蛋白，从而激活转录因子并最终调节基因表达[25]. 已知IL-1β可增加原代星形胶质细胞中p38Ks、JNK和ERK MAPKs的激活[26,44]. 我们独立地抑制了每个MAPK通路的激活，并显示IL-1β激活的星形胶质细胞中CD38的表达显著降低。通过抑制p38Ks、JNK和ERK通路，IL-1β诱导的CD38的ADP-核糖基环化酶活性也显著降低。值得注意的是，单独抑制每一个单独的信号通路，都会导致IL-1β激活的星形胶质细胞中CD38表达和环化酶活性的强烈下调。因此，合理地假设所有三种MAPK途径在CD38调节中具有同等的重要性。重要的是，MAPK抑制剂并不影响非活化星形胶质细胞的基础CD38水平。因此，综合这些结果表明，MAPK通过NF-κB直接或间接调节IL-1β诱导的星形胶质细胞CD38水平。据报道，p38Ks和JNK主要通过胶质细胞激活介导神经元损伤[61]. p38Ks的激活在发展HIV-1包膜蛋白gp120介导的人脑微血管内皮细胞细胞毒性中起重要作用[62]. MAPK激活可导致胶质细胞产生一氧化氮和释放细胞因子，从而加剧包括HIVE在内的神经退行性疾病期间的神经炎症环境[63,64].

众所周知，HIV-1可激活p38Ks、ERK和JNK-MAPK级联，而HIV-1反式激活因子可诱导NF-κB和p38KsJNK-MAPK通路[65,66]在星形胶质细胞中。这可能最终导致胶质细胞释放谷氨酸和促炎细胞因子，从而导致HAD期间的神经退行性变[67]. HIV-1gp120也可能激活神经元中的MAPK[68]. NF-κB和MAPK信号的激活可能导致一氧化氮合酶的激活，从而导致人和大鼠星形胶质细胞以及C6胶质瘤细胞释放一氧化氮[69,70]. 以前有报道称，NF-κB的激活可能导致活性氧的释放，而活性氧反过来又调节星形胶质细胞中诱导型一氧化氮合酶的表达（如[71]). 因此，了解CD38的调节如何参与IL-1β活化星形胶质细胞中诱导型一氧化氮合酶的释放将是一件有趣的事情。

现已明确，活化的星形胶质细胞释放多种炎症细胞因子和趋化因子，包括IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL2和CXCL8（综述于[72,73])被认为与HIVE相关的炎症[74]. 我们之前已经证明，促炎细胞因子IL-1β上调星形胶质细胞中的Fas配体，从而诱导神经元凋亡[45,53]IL-1β介导的CCL2和CXCL8的产生部分受CD38调节[18]. IL-1β的自分泌产生可以增强IL-1β信号级联下游的许多其他信号分子[75]. 然而，我们也发现CD38的表达独立于星形胶质细胞中的IL-1β自分泌环[18]. 因此，星形胶质细胞CD38的调节是一种复杂机制的净效应。

结论

我们的发现补充了我们之前的研究，并提出了神经炎症期间星形胶质细胞CD38基因表达的调控机制。IL-1β诱导的CD38上调可能通过下游转录因子NF-κB激活JNK、p38Ks和ERK-MAPK信号通路介导。通过高效转染HIV-1YU-2号机组我们提供证据表明，HIV-1基因的表达和复制直接增加了星形胶质细胞中CD38的水平。De Flora的研究小组此前证明，CD38/cADPR系统增加的钙可能导致星形胶质细胞释放谷氨酸[76]. 过度接触神经递质谷氨酸被认为是导致HIVE神经元损伤和死亡的关键因素[76,77]. 因此，我们目前的研究结果有助于理解转录因子和信号分子在神经炎症状态下调节CD38水平的作用。由于CD38与神经炎症有关，详细了解其调节机制可能有助于开发调节CD38水平的方法，从而控制与HIV-1-CNS感染相关的神经炎症。

缩写

艾滋病毒1型：

人类免疫缺陷病毒

中枢神经系统：

中枢神经系统

MAPK（地图）：

丝裂原活化蛋白激酶

手牌：

HIV-1相关神经认知障碍

有：

HIV-1相关性痴呆

HIVE公司：

HIV-1脑炎

ADP（自动数据处理）：

二磷酸腺苷

cADPR：

环腺苷二磷酸核糖

伊利诺伊州：

白细胞介素

NF-κB：

核因子

MAPKs（映射Ks）：

丝裂原活化蛋白激酶

ERK公司：

细胞外信号调节激酶

38K页：

p38激酶

JNK公司：

c-Jun N-末端激酶

GFAP公司：

胶质纤维酸性蛋白

IκBαM：

IκBα显性阴性突变体

北美地区：

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸

(:

非抑制突变肽SN50

肿瘤坏死因子：

肿瘤坏死因子

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下载参考资料

致谢

本研究得到了NINDS，RO1 NS43113和NIMH，MH087345对A.Ghorpade的资助。我们还感谢发育生物学实验室为我们提供人脑组织的支持。题为“发育生物学实验室”的项目得到了尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发展研究所（NICHD）颁发的NIH奖（编号：5R24HD0008836）的支持。内容不一定代表NIH NICHD的官方观点。

作者信息

作者注释

    作者和附属机构

    1. 美国德克萨斯州沃思堡Camp Bowie大道3500号北德克萨斯大学健康科学中心细胞生物学和解剖学系，邮编76107

      Manmet K Mamik、Sugato Banerjee、Lin Tang、Kathleen Borgmann和Anuja Ghorpade

    2. 明尼苏达大学药理学系，美国明尼阿波利斯教堂东南321号杰克逊大厅6-120号

      Timothy F Walseth和Renee Hirte

    作者
    1. 曼梅特·马米克
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    2. 苏加托·班纳吉
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    3. 蒂莫西·F·沃尔塞斯
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    4. 蕾妮·赫特
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    5. 林丹（Lin Tang）
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    6. 凯瑟琳·博格曼
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    7. Anuja Ghorpade公司
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    通讯作者

    与的通信阿努贾·古尔帕德.

    其他信息

    竞争性利益

    作者没有任何利益冲突需要披露，这些利益冲突可能会对他们的工作产生不适当的影响，或被认为会影响他们的工作。

    作者的贡献

    AG设计了研究策略和实验。TFW执行并建议cADPR活性分析数据。MKM、SB、TFW、RH、LT和KB进行了实验。MKM和SB起草并修订了手稿。所有作者阅读、编辑并批准了最终手稿。

    Manmet K Mamik、Sugato Banerjee对这项工作做出了同样的贡献。

    作者提交的图像原始文件

    权利和权限

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    关于本文

    引用这篇文章

    Mamik，M.K.，Banerjee，S.，Walseth，T.F。等。HIV-1和IL-1β通过丝裂原活化蛋白激酶和核因子调节星形胶质细胞CD38-κB信号机制。J神经炎症 8, 145 (2011). https://doi.org/10.1186/1742-2094-8-145

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    • 出版:

    • DOI程序:https://doi.org/10.1186/1742-2094-8-145

    关键词

    神经炎杂志

    国际标准编号：1742-2094