精氨酸甲基转移酶5蛋白选择性抑制阻断B细胞转化的启动和维持

基因组不稳定性和获得性基因突变已被充分记录为多步骤致癌过程的相关驱动因素。¹ 尽管在理解遗传、炎症和微环境变量在癌症病因中的复杂相互作用方面取得了很大进展，但异常的表观遗传调控在推动恶性肿瘤的发生和维持方面的作用仍不完全明确。记录细胞永生化和转化过程中异常表观遗传活动进展的一个主要限制因素是缺乏自发的、可复制的模型。

EB病毒（EBV）是一种与B细胞淋巴瘤的发生有关的人类嗜B淋巴细胞γ疱疹病毒。² 在此，我们探讨了表观遗传修饰物精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）在利用EBV作为工具驱动B淋巴细胞永生化和维持恶性表型的转化过程中失调的意义。

人类基因组编码11种蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs），共价修饰组蛋白和非组蛋白中的精氨酸残基，从而形成广泛的细胞调节网络。^3-6 I型和II型PRMT均在精氨酸的ω-NH2处催化单甲基化，但它们不对称（I型）或对称（II型）添加第二甲基的能力不同。^三，4，6 PRMT5是一种II型精氨酸甲基转移酶，催化组蛋白H3（S2Me-H3R8）和H4（S2Me-H4R3）的对称二甲基化，改变染色质结构，促进转录靶基因沉默。^7-16 越来越多的非组蛋白参与多个调控网络的控制，包括EBV编码的基因产物EBNA1和EBNA2，也已被鉴定与PRMT5相互作用。^4，17-21 

PRMT5过度表达与套细胞淋巴瘤（MCL）的增殖和生存有关¹⁵ 和弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞。²² 尽管这些研究证明了PRMT5与恶性B细胞生存和增殖之间的直接关系，但在转化过程中PRMT5过度表达的总体相关性仍不清楚。

在这里，我们证明PRMT5的过度表达依赖于潜在膜蛋白1（LMP1）驱动的核因子-κB（NF-κB）抑制复合物，该抑制复合物被招募到microRNA96（miR96）启动子中，沉默该调控miR并促进PRMT5过度表达，它转移到B淋巴母细胞核和关键抑癌基因的转录沉默。我们用一种一流的、高选择性的小分子PRMT5抑制剂来靶向这一致癌途径，使我们能够研究B细胞转化过程中发生的表观遗传事件。干扰PRMT5活性可部分通过影响NF-κB/p65亚单位与恢复肿瘤抑制因子表达的转录激活复合物的差异关联，阻止B细胞永生化的建立和恶性表型的维持。本研究揭示了PRMT5对B细胞淋巴瘤的重要作用，并为在B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）中靶向该酶提供了理论基础。

EBV驱动的淋巴瘤的严重联合免疫缺陷小鼠（hu PBL SCID）模型在补充方法中有详细描述（可在血液网站）。完全转化的淋巴母细胞系（LCL）来源于肿瘤相关组织的处理。

B细胞的分离和活化在补充方法中进行了描述。

根据标准方案，用B95.8细胞系的含EBV上清液对正常B淋巴细胞进行体外感染后30至45天，获得LCL（“永生化LCL”）。^23，24 永生化细胞系D-5、D-9、D-22、D-25、D-27、D-28、D-32和D-33各自从不同的供体获得。补充方法中提供了更多详细信息。

抗体和试剂列在补充方法中。

福尔马林固定样本取自3名有反应性淋巴结（EBV）的患者⁻)以及23名EBV患者⁺恶性淋巴增生性疾病（LPD）（8例Burkitt淋巴瘤，3例浆清性淋巴瘤，3株EBV⁺老年人DLBCL、7例移植后DLBCL，1例移植后外周T细胞淋巴瘤和1例多态性移植后LPD）。此外，在原发EBV中评估肿瘤形态（苏木精和伊红）、EBV状态（EBV编码RNA）和PRMT5定位⁺在EBV-LPD的hu-PBL-SCID小鼠模型中自发形成的肿瘤（n=3）。补充方法中提供了更多详细信息。

“结果”和补充方法中详细描述了人类PRMT5（hPRMT5）模型的开发和hPRMT4小分子抑制剂的发现。

补充方法中描述了小干扰RNA（siRNA）转染和短发夹RNA（shRNA）感染。

细胞凋亡分析、免疫荧光、共焦显微镜、免疫印迹和免疫沉淀（IP）实验均采用标准技术进行，并在补充方法中进行了描述。

感染EBV±PRMT5 shRNA慢病毒治疗的B细胞增殖通过氚化胸腺嘧啶掺入测定，详见补充方法。

RNAseq使用标准协议进行，包括RNA完整性检查、poly-A选择和Truseq文库准备。补充方法中提供了更多详细信息。

使用补充方法中详述的标准技术进行定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和染色质IP（ChIP）检测。

为了从统计学上验证不同组中使用多个样本生成的数据，使用方差分析计算P（P）值。为了确定两组之间差异表达的基因或不同染色质重塑的招募，配对t吨测试用于计算P（P）值。在所有情况下，GraphPad Prism4软件都用于生成图形和P（P）值。除非另有规定，否则所有实验均一式三份。

23株原发性EBV的免疫组织化学研究⁺淋巴瘤显示，在所有EBV病例中，PRMT5和相关的表观遗传标记S2Me-H4R3和S2Me-H3R8均以核/细胞质模式显著过度表达⁺淋巴瘤和EBV-LPD与正常或反应性淋巴结的比较(表1;图1A).

EBV淋巴瘤hu-PBL-SCID小鼠模型（n=3）的原发肿瘤也通过免疫组化进行了评估，结果显示胞质和核PRMT5水平丰富（补充图1）。转化LCL（60A，C7M3，100，147）的Western blot分析证实PRMT5过度表达，而静止或活化的B淋巴细胞，CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞和单核细胞制剂没有，这表明PRMT5的表达与恶性表型相关，而与生理活化B淋巴细胞的增殖无关(图1B; 补充图2）。

对生理活化或感染EBV（B95.8株或对照非转基因EBV株）的正常B细胞进行Western blot分析，结果表明（与静止、活化的B细胞或感染非转化EBV株的B细胞相比）永生化LCL（D-9、D-22、D-27、D-28、D-32）表达丰富的PRMT5水平(图1C)与转换后的LCL中看到的等效(图1B). western blot检测发现，B细胞感染EBV后～8天，PRMT5持续表达(图1D). 共聚焦显微镜研究记录了早在感染后4天检测到PRMT5(图1E)与LMP1病毒癌蛋白表达时间一致(图1F)PRMT5早在感染后第8天就从细胞质转移到细胞核，并且在永生化过程中核表达强度持续增加，最终与转化的LCL中的表达强度相同(图1E). 核PRMT5的高水平表达与获得全球PRMT5催化的组蛋白表观遗传标记（S2Me-H4R3和S2Me-H3R8）一致(图1G)I型PRMT1非对称组蛋白标记A2Me2-H4R3相对缺失（补充图3）。这些观察结果使我们假设PRMT5过表达发生在EBV感染后不久，而不是在转化状态建立后获得。

评估小细胞肺癌中PRMT5 shRNA敲除效果的先导性实验导致生存能力下降（补充图4A；数据未显示）。用转染慢病毒制剂的B淋巴细胞进行EBV永生化试验，该慢病毒制剂旨在表达PRMT5互补DNA，在感染后5天和12天显示出增强的生存能力和增殖，而转染shRNA的细胞旨在击倒PRMT5，显示出降低的生存能力（补充图4B-C）(P（P）< .05). 这些观察结果支持了以下观点：PRMT5过度表达可能是EBV感染后促进B细胞永生的重要机制。

hPRMT5最初缺乏晶体结构，这导致我们使用比较建模和基于结构的虚拟筛选方法来识别能够特异性抑制PRMT5活性的化合物。

同源精氨酸甲基转移酶的多晶体结构用于hPRMT5模型构建过程。大鼠PRMT1（rPRMT1）的晶体结构与hPRMT5的同源性最高，为建模提供了主要模板。用rPRMT1晶体结构覆盖hPRMT5催化结构域的硅内模型^25，26 显示出几乎相同的排列(图2A)主链α-碳根均方差为1.14Ω，支持该酶家族催化结构域的保守性质(图2A-C). 此外，我们能够通过计算将S-腺苷-L-高半胱氨酸（SAH）和底物精氨酸残基成功对接到hPRMT5模型中的相应结合囊中，从而验证了基于结构的药物设计的催化位点(图2C-D).

使用基于结构的计算和组合铅优化方法，我们使用我们的hPRMT5催化位点模型筛选10的ChemBridge CNS-Set库 000种小分子化合物（CMP）。候选小分子的虚拟对接揭示了与S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）辅因子和精氨酸结合囊中的低结合能相关的一些结构（在图2A）。初始测试确定了8种结合能最低的CMP（补充图5A-B），用于使用免疫荧光筛选分析，以抑制JeKo细胞中I型或II型H4R3甲基化的能力(图2F). 细胞筛选分析使我们能够识别CMP5(图2G; 补充图5）作为进一步研究的最佳候选抑制剂。与包括CMP6在内的其他CMP不同(图2G)CMP5通过抑制PRMT5甲基转移酶活性选择性阻断S2Me-H4R3，对H4R3甲基化没有影响(图2H)组蛋白制剂。此外，CMP5对其他类型I（PRMT1和PRMT4）和类型II（PRMT7）酶不起作用，强调了其对PRMT5的特异性(图2H).

CMP5与hPRMT5模型的结合作用初步预测表明，CMP5的吡啶环可以与Phe327残基形成π堆积作用(图2E)假设其对于指导PRMT5催化精氨酸的对称二甲基化的能力是关键的，²⁷ 也可能解释CMP5对II型PRMT5而非I型PRMTs的选择性。当我们的硅内模型与最近报道的hPRMT5晶体结构进行比较时(图2I紫色色带），²⁸ 我们发现我们的催化域模型几乎相同(图2I绿色丝带）。此外，我们模型的催化位点残基6Å内的氨基酸残基的比对产生了1.17Å的较低均方根偏差，表明与催化位点残基的一致性更好(图2J). 晶体结构也观察到一些差异，尤其是Glu444的旋转异构体放置。Glu444的取向朝向模型中的溶剂可及表面，而晶体结构取向以102°的二面角旋转。由于这些差异，CMP5与hPRMT5晶体结构对接表明咔唑环占据了辅助因子腺苷结合位置的空间(图2K)而不是最初用同源模型预测的辅因子蛋氨酸亚基(图2E).

细胞毒性研究表明，增加CMP5浓度的治疗对淋巴瘤细胞具有选择性毒性(图2L，N-O) (P（P）<.05），但即使在延长孵育时间（48和72小时，图2M). 此外，尽管CMP5治疗LCL导致PRMT5表观遗传标记、S2Me-H4R3和S2Me-H3R8的丢失，但它并不影响H4R3的不对称甲基化，即I型PRMT组蛋白标记（补充图6）。总之，这些数据表明，PRMT5抑制导致选择性肿瘤细胞死亡，并且PRMT5在恶性细胞中选择性过度表达，因此是一个理想的治疗靶点。

我们使用shRNA-lentiviral PRMT5敲除和基于CMP5的方法进行EBV–B细胞永生化分析。正常B细胞感染EBV：在第8天将shRNA（或对照加扰shRNA）添加到培养物中(图3A-B); CMP5（或二甲基亚砜[DMSO]车辆控制或非反应性CMP6，图3C)在第4、7、14和21天添加。每3至5天监测一次增殖/细胞活力和绝对淋巴细胞数。shRNA敲除和选择性抑制PRMT5活性(图3B-C)阻止EBV感染驱动B细胞存活，表明PRMT5对支持B细胞永生化的启动和转化表型的维持至关重要。

转化的LCL（60A）中的RNA测序显示，CMP5处理显著降低了基因组的表达（12小时时402个上调基因对149个下调基因）(P（P）<.005），并确定了干扰素调节因子4和固醇调节元件结合蛋白1/2靶点的富集(P（P）< .005; 补充图7）。我们还对PRMT5-shRNA处理的60A细胞进行了RNA-seq，并观察到CMP5去表达的基因和PRMT5-shRNA去表达的基因组之间存在显著重叠（24个基因；P（P）<.005），证实了我们化合物的特异性。尽管PRMT5去表达程序的功能意义尚待阐明，但这些结果证实了PRMT5作为一种全球转录阻遏物的直接作用。

与我们在蛋白质水平上观察到的结果相反，与静止的B细胞相比，转化的LCL显示PRMT5转录水平显著降低(P（P）< .005) (图4A). B细胞感染EBV后不同时间采集的RNA的qRT-PCR显示早在第8天PRMT5转录物就减少(图4B) (P（P）<.01），蛋白质表达清晰(图1D-E). 我们以前报道过PRMT5通过抑制MCL中miR96诱导表达的转录后性质。¹⁵ 与我们之前观察到的情况类似，我们发现与静止的B淋巴细胞相比，转化的LCL中miR96水平显著降低(P（P）< .005) (图4C). 我们还记录了B淋巴细胞永生化过程中miR96水平的急剧下降，早在第4天出现，在感染后第8天变得显著(图4D;P（P）<.005），并且一直被抑制到B细胞永生化的完全建立，这表明PRMT5通过抑制miR96诱导表达的转录后性质。

LMP1促进构成性NF-κB活性和核因子κB元件的核移位，从而对靶基因表达进行正或负调节。^29-32 两种单独的LMP1特异性shRNA制剂导致LMP1和PRMT5的高效敲除(图5A下图）和LCL60A中miR96的显著上调(P（P）< .01) (图5A顶部面板）。此外，转化的LCL（SR27和60A）与IkB激酶α选择性抑制剂（BAY11）孵育4小时后(P（P）<.01）上调miR96(图5B-C)和PRMT5损失(图5D)以及S2Me2-H4R3(图5E)支持LMP1驱动的NF-κB活性有助于miR96的转录抑制的假设。使用选择性组蛋白去乙酰化酶（HDAC）1,2抑制剂JQ12未能显著增强miR96的表达(图5F)而广谱HDAC抑制剂AR42和选择性HDAC1,3抑制剂MS275的使用具有统计学意义(P（P）<0.05）miR96表达增强(图5G-H支持HDAC3作为转录抑制复合物的关键成分的作用。用MS275治疗LCL导致H3K14（已知HDAC3靶点）超乙酰化，证实了该抑制剂的特异性(图5I).³³ 

用PRMT5、S2Me-H4R3和S2Me-H3R8特异性抗体进行的ChIP研究表明，在LCL 60A的miR96启动子处PRMT5及其标记显著富集(图6A) (P（P）< .01). 此外，CMP5对PRMT5的敲除（shRNA）或抑制导致PRMT5的募集及其在miR96启动子上的表观遗传学标记的丧失(图6B-C) (P（P）<.05）和miR96的转录去表达(图6D-E) (P（P）< .01). 在用PRMT5-shRNA或CMP5处理的60A细胞中，还使用抗p65、HDAC3和表观遗传标记Ac-H4K8、Ac-H3K14和Ac-H2BK12的抗体进行了ChIP研究。PRMT5敲低和抑制显示p65的募集增强，HDAC3的缺失，组蛋白H3、H4和H2B上赖氨酸标记的过度乙酰化，与miR96的转录活性恢复一致(图6F-G).^34，35 此外，在永生化LCL（D-22）和转化LCL（60A）中的IP实验表明PRMT5和HDAC3之间存在物理联系(图6H顶部面板）和HDAC3和p65之间(图6H底部面板）。CMP5治疗导致这种抑制复合物（HDAC3，PRMT5）的破坏和miR96启动子的募集丢失，同时组蛋白乙酰转移酶p300增强了p65的募集，组蛋白标记的乙酰化增强，miR96转录激活(图6I). 这些研究首次记录了驱动赖氨酸脱乙酰化的NF-κB抑制复合物如何与PRMT5协调，以沉默对支持其在淋巴瘤细胞中表达至关重要的关键miR。

对用S2Me-H3R8抗体免疫沉淀的DLBCL细胞（Pfeiffer）分离的染色质进行全基因组定位，指导我们识别PRMT5的潜在直接表观遗传靶点，这些靶点可能与EBV-驱动的B细胞转化的发病机制有关，并识别了PRMT5启动子PTPROt公司肿瘤抑制基因显示S2Me-H3R8的3.5倍富集（未显示）。PTPROt是一种酪氨酸磷酸酶，是PTPRO公司基因产物，并在B细胞恶性肿瘤中调节B细胞受体（BCR）信号蛋白脾酪氨酸激酶（SYK）、Lck/Yes新型酪氨酸激酶。^36，37 PTPROt公司转录物和蛋白质检测不到(P（P）<.005）分别通过qRT-PCR和共焦显微镜在永生化LCL（D-9、D-22和D-27）中(图7A、C). 我们还注意到PTPROt公司早在感染后第8天的转录本，当建立永生化LCL时，转录本继续下降到几乎无法检测到的水平(图7B) (P（P）< .005). 用PRMT5抗体进行的ChIP实验证实了对PTPROt公司发起人(图7D) (P（P）<.005），PRMT5抑制导致PTPROt公司转录去抑制(图7E) (P（P）<0.05）和蛋白质表达的恢复(图7E底部）。恢复PTPROt公司导致BCR信号蛋白SYK、SRC和BTK去磷酸化(图7F).

使用抗PRMT5和抗S2Me-H4R3抗体的ChIP分析证实了抑瘤性7(ST7标准)基因将成为直接靶标，并在LCL中被PRMT5沉默（补充图8A）(P（P）< .01). Western blot分析和qRT-PCR未能显示LCL中可测量的ST7，然而ST7标准在静止的B细胞中观察到转录物和蛋白质（补充图8B-C）(P（P）< .01). 用shRNA慢病毒敲低PRMT5或用CMP5抑制导致ST7标准（补充图8D）。在B细胞永生化过程中，ST7水平在第16天开始下降，最终在感染后第30天检测不到（补充图8E）。这些观察结果支持这样的观点，即在B细胞永生化过程中，EBV利用PRMT5靶向并沉默具有重要抑癌特性的基因，并且持续的PRMT5活性对支持恶性表型至关重要。

PRMT5与含有HDAC、MBD2和DNMT3a酶的染色质重塑复合物结合，通过催化组蛋白尾部精氨酸残基的对称二甲基化来沉默调节基因的转录。^{7，8，15，16，38} PRMT5在多种淋巴瘤中过度表达，包括MCL和DLBCL，而PRMT5的敲除通过恢复RBL2/E2F抑癌途径、PRC2基因（EZH2、SUZ12、EED）的转录沉默以及促凋亡EZH2-靶基因（CASP10和DAP1）的恢复表达导致凋亡。^15，16，22 此外，PRMT5通过转录抑制细胞周期蛋白D1介导的肿瘤生长和增殖细菌4.^三 最后，最近研究表明，PRMT5可以通过NF-κB亚基p65的物理结合和二甲基化激活NF-κ的B¹⁸ PRMT5可以介导p53甲基化，促进G1期阻滞以应对DNA损伤。⁴ 

在本研究中，我们使用EBV永生化和转化的体外和体内模型来了解组蛋白翻译后的变化如何影响基因表达，PRMT5失调的机制，以及这些过程的扰动如何导致淋巴肿瘤。以前的研究表明，永生化LCL的早期传代在软琼脂中生长或在裸鼠体内生成肿瘤的能力较差。³⁹ 然而，必须指出的是，来自hu-PBL-SCID小鼠的永生化LCL和人类EBV-LPD肿瘤细胞都已被证明在SCID小鼠中诱导LPD。⁴⁰ 虽然体外生成的LCL和完全转化的细胞系可能代表同一疾病的不同方面，但体外生成的LC表达的病毒基因与EBV淋巴瘤相同⁴¹ ; 因此，我们认为这两个系统都是研究EBV介导的B细胞肿瘤发生的有用而可靠的模型。

我们发现，尽管PRMT5在正常或活化的B细胞中不表达，但在原发性EBV中显著过度表达⁺淋巴瘤和LCL，表明PRMT5过度表达是细胞转化而非增殖的标志。除了H4R3的对称二甲基化外，PRMT5还诱导H3R8的对称二甲化，同时失去H4R8的不对称甲基化，这是一种I型PRMT组蛋白标记，表明EBV感染B细胞后很早就出现了全染色质抑制性表观遗传变化。

一种一流的PRMT5小分子抑制剂的开发显示出对S2Me-H4R3和S2Me-H3R8的选择性作用，而对I型（PRMT1和PRMT4）或其他II型（PRMT 7）酶没有影响。我们还进行了细胞毒性研究，显示了对LCL的选择性抗肿瘤活性。为了进一步支持我们的抑制剂的特异性，我们用shRNA和siRNA显示了类似的表观遗传变化和细胞毒性作用，这些shRNA和siRNA设计用于敲除PRMT5。与这些发现一致，使用shRNA或CMP5的RNA-seq实验支持多个调节基因的恢复表达，与shRNA和抑制剂处理的LCL之间的表达相似。这种一流的药物在这里被用作工具化合物，以探索PRMT5抑制的生物效应，并作为第一步，促进为EBV患者引入全新的治疗方法⁺淋巴瘤和其他PRMT5过度表达的B细胞淋巴瘤。还应强调的是，CMP5和新一代PRMT5抑制剂需要进一步优化才能在体内使用。

在之前的工作中，我们通过miR调节描述了PRMT5表达的转录后性质，并将PRMT5的异常表达与MCL中miR-96的异常表达联系起来。¹⁵ 在这里，我们表明PRMT5通过参与抑制miR-96转录的PRMT5/p65/HDAC3复合物来增强其自身的表达。此外，尽管HDAC3和PRMT5在miR-96启动子处赋予p65转录抑制活性，但用PRMT5抑制剂治疗淋巴瘤细胞会导致这种抑制复合物的快速分离，以及p65与p300的差异关联，从而增强miR-96的启动子的募集和随后的反式激活。这些数据支持p65作为依赖于PRMT5活性的阻遏物和激活物的双重作用。

我们的发现通过NF-κB将PRMT5失调和异常miR96表达与LMP1信号联系起来，确定病毒癌基因活性和宿主调节网络之间的相互作用，从而影响PRMT5驱动的致癌途径。此前已有研究表明，EBV通过上调抗凋亡基因的表达，如：BFL1型⁴² 和BCL2级.⁴³ 在这里，我们证明PRMT5过度表达对支持B细胞永生化、转化和维持恶性表型至关重要。

早期的研究表明，LMP2A的功能是通过下游蛋白激酶的抗原非依赖性激活来改变正常的BCR信号传导。^44-47 尽管PRMT5抑制对EBV编码蛋白的表达没有任何直接影响（补充图9），但它确实影响多个细胞调节基因的表达，突出了其作为一种表观遗传修饰因子的相关性，能够驱动宿主而不是病毒致癌过程。PTPROt是一种酪氨酸磷酸酶，专门针对BCR触发的酪氨酸激酶。⁴⁸ 在这里，我们通过ChIP向PTPROt公司发起人。此外，PRMT5抑制导致PTPROt转录的去抑制和蛋白质表达的恢复，进而导致BCR信号激酶的去磷酸化。PTPROt表达降低淋巴瘤细胞增殖并诱导凋亡。³⁶ 我们最近还通过产生具有B细胞特异性PTPROt表达的转基因小鼠，建立了PTPROt的体内功能，并表明PTPROt介导的p53/Foxm1调控抑制了慢性淋巴细胞白血病小鼠模型中的白血病表型。⁴⁹ 我们的结果表明，EBV感染后，PRMT5介导的PTPROt下调以及随后的BCR信号失调在支持EBV诱导的B细胞永生化过程中发挥了作用。

越来越明显的是，组蛋白修饰酶的失调与癌症的病因和发病机制有关。我们利用了EBV的致癌潜能，并用它来说明PRMT5在B细胞转化过程中发挥的全局表观遗传抑制作用。我们已经将一种强大的致癌病毒（EBV）与表观遗传修饰物（PRMT5）的过度表达联系起来，并描述了PRMT5通过转录沉默miR96的抑制复合物（p65/PRMT5/HDAC3）在促进自身过度表达中的关键作用。由于PRMT5在恶性细胞中的选择性表达，以及该酶在调节自身表达和转录沉默多个调节基因中的活性方面的中心作用，PRMT5似乎是淋巴瘤的理想治疗靶点。除了为EBV提供创新战略之外⁺淋巴瘤以及其他B细胞非霍奇金淋巴瘤亚型，这种方法可用于确定潜在的新治疗靶点，并将促进探索新的组合策略，作为这些疾病的治疗选择。

这项工作得到了美国血液学会/欧洲血液学会（L.Alinari）、白血病和淋巴瘤学会转化研究项目（LLS TRP）、杰森·古尔德基金会之友（R.A.B.、P.L.S.、J.T.P.）、俄亥俄州立大学药物开发研究所（R.A.B.C.L.）、，美国国立卫生研究院、美国国立神经疾病和中风研究所拨款R21NS071346（R.A.B.，C.L.）和美国国立癌症研究院拨款R01CA116093（S.S.，R.A.B.）。

贡献：L.Alinari设计并执行了研究，分析了数据，撰写并审阅了论文，批准了手稿的最终版本；K.V.M.、F.Y.、S.C.-K.和O.E.设计并执行了研究，分析了数据，审查了论文，并批准了手稿的最终版本；V.K.、J.-H.C.、E.M.S.、C.Q.、P.L.S.、L.K.、JT.P.、B.Y.、Y.W.和S.R.进行了研究，分析了数据，并批准了手稿的最终版本；R.L.进行了研究，分析了数据，审查了草稿，并批准了手稿的最终版本；A.D.L.和J.E.B.提供了试剂，审查了草稿，并批准了手稿的最终版本；S.P.、C.A.和L.Ayers提供了样本，进行了研究，审查了草稿，并批准了手稿的最终版本；T.M.和S.M.进行了研究，分析了数据，审查了论文，并批准了手稿的最终版本；J.C.B.和S.J.设计了研究，审查了草稿，并批准了手稿的最终版本；S.S.、C.L.和R.A.B.设计并监督了研究，获得了工作资金，审查了草稿，并批准了手稿的最终版本。

利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。

通信：俄亥俄州立大学内科血液科Robert A.Baiocchi，地址：俄亥俄州哥伦布市西十大道320号B420 Starling Loving Hall，邮编：43210；电子邮件：robert.baiocchi@osumc.edu; 李成龙，俄亥俄州立大学药物化学和生药学系，俄亥俄州哥伦布市第十二大道西486号里夫大厦612号，邮编：43210；电子邮件：li.728@osu.edu; 卡塔尔大学艺术与科学学院生物与环境科学系Said Sif，卡塔尔多哈，邮政信箱2713；电子邮件：ssif@qu.edu.qa公司.