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.2023年9月20日；24(18):14337.
doi:10.3390/ijms241814337。

核NPM-ALK保护Myc免受蛋白酶体降解并促进其在ALK阳性间变性大细胞淋巴瘤癌干样细胞中的高表达

楚泉上 1, 贾斯汀·赖 2, 莫伊纳尔·哈克 1 三, 威尔·陈 1, 王鹏（音译） 2 4, 雷蒙德·赖 1 4
附属公司

核NPM-ALK保护Myc免受蛋白酶体降解并促进其在ALK阳性间变性大细胞淋巴瘤癌干样细胞中的高表达

楚泉上等。 国际分子科学杂志. .

摘要

在ALK阳性间变性大细胞淋巴瘤（ALK+ALCL）中，已发现一小部分以高Myc表达为特征的癌干样（或RR）细胞。我们假设NPM-ALK有助于其高Myc表达。转染时NPM-ALK公司进入HEK293细胞后，通过抑制其蛋白体降解（PD-Myc）有效地增加了Myc，当全长NPM1（FL-NPM1）被shRNA下调时，这种作用显著减弱，突显了NPM-ALK:FL-ALK异二聚体在这方面的重要性。与这一概念一致，免疫沉淀实验表明，异二聚体仅在RR细胞中大量存在，其中Myc的半衰期大大长于体细胞。Fbw7γ是PD-Myc的关键分子，被RR细胞中的异源二聚体隔离，这一发现与Myc磷酸化模式相关，表明PD-Mmyc无效。利用共焦显微镜和免疫荧光染色，我们发现异二聚体特征的ALK和FL-NPM1之间的融合信号与细胞株和患者样本中ALK+ALCL细胞的Myc水平相关。总之，我们的发现揭示了NPM-ALK在细胞核中的一种新的致癌功能。具体而言，NPM-ALK:FL-NPM1异二聚体通过阻断PD-Myc和促进Myc在癌干样细胞亚群中的积累来增加癌干细胞。

关键词：ALK阳性间变性淋巴瘤；Myc；癌干；蛋白酶体降解。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
NPM-ALK促进HEK293细胞中Myc的积累。(A类). Western blot研究显示，HEK293细胞中Myc蛋白在NPM-ALK公司基因转染（车道1 vs.车道3）。在没有NPM-ALK的情况下，添加蛋白酶体抑制剂MG132（10μM）2小时也会增加Myc的表达（通道1 vs.通道2），这一发现表明PD-Myc在HEK293细胞中相对有效。相比之下，在存在外源性NPM-ALK的情况下，Myc没有明显增加（车道3与车道4）。总之，这些结果表明，NPM-ALK通过抑制PD-Myc来增加Myc的蛋白质水平。直方图中显示的数字代表波段密度测定结果。进行了三个复杂的实验，并显示了典型实验的结果。使用Student’st吨-测试****第页< 0.0001 (B类). Western blot研究表明，shRNA敲除FL-NPM1导致Myc在用空载体转导的HEK293细胞中显著积累（通道1 vs.通道2）。相反，在存在外源性NPM-ALK的情况下，FL-NPM1的shRNA敲除降低了Myc（车道3 vs.车道4）。值得注意的是，NPM-ALK蛋白水平不受FL-NPM1基因敲除的影响。本实验使用了三种硅酸盐，并显示了典型实验的结果。
图2
图2
与RU细胞相比，Myc在RR细胞中的降解效率较低。(A类). Western blot研究表明，来源于SupM2的RU和RR细胞在Myc蛋白水平上存在显著差异（车道1与车道3）。此外，尽管MG132（10μM）处理2 h后，RU细胞中的Myc显著上调（车道1 vs.车道2），但在RR细胞中，Myc水平没有发生实质性变化（车道3 vs.车道4）。用ImageStudioLite软件计算带密度，用Graphpad制作直方图。结果显示在下部面板中。(B类). 时间进程实验的结果显示了RU和RR细胞中Myc降解速度的差异。本实验中使用了总共10μM的环己酰亚胺（CHX）。每10分钟收集一次细胞。直方图中显示的数字代表ImageStudioLite计算的带密度测定结果，数据显示为平均值±标准偏差（SD），n个= 3, *第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001，学生t吨-测试。带密度测定分别在0分钟时归一化为RU或RR细胞。RU细胞的半衰期大约为10–20分钟，而RR细胞的半衰期大约是30–40分钟。进行了三个独立的实验，并显示了一个代表性实验的结果。
图3
图3
NPM1是Myc的保护剂，因为Myc在RR中的降解效率很低，而在RU亚群中没有。左面板：FL-NPM1敲除前后来自SupM2的RU和RR细胞的Western blot分析。RU细胞中Myc水平的变化相对较小（车道1对车道2，频带强度1.00对0.89，第页>0.05），可能是因为PD-Myc在这些细胞中相对有效，并且残留的FL-NPM1足以阻止Myc的蛋白质积累。相比之下，相同的治疗导致RR中Myc的显著降低（3车道对4车道，带宽强度1.44对0.77，第页>0.01），这与我们的模型一致，即FL-NPM1介导的PD-Myc在RU和RR细胞之间是不同的。右图：在shRNA敲除FL-NPM1后，用10μM MG132处理RR细胞，并在0、2和4 h收集细胞。MG132治疗后Myc的积累（第5道vs.第6和7道）支持以下概念：RR细胞中FL-NPMl敲除导致Myc减少是通过PD-Myc通路的抑制。用ImageStudioLite软件计算带密度，并将结果归一化为RU-EV组。学生的t吨-使用GraphPad进行测试，结果显示在下部面板中*第页< 0.05, **第页< 0.01. 进行了三个复杂的实验，并说明了典型实验的结果。
图4
图4
NPM-ALK通过抑制蛋白酶体降解，促进RR细胞中Myc蛋白的高水平。(A类). 使用来自用siRNA处理以敲低ALK 24小时的RR细胞（SupM2）的裂解物进行蛋白质印迹研究。Myc表达显著降低（泳道1对泳道2、条带强度1.00对0.30，第页< 0.0001). 将10μM的MG132添加到细胞培养物中2 h，有效地恢复了Myc的表达，表明NPM-ALK通过阻断PD-Myc促进Myc的积累。所有显示的条带均在同一印迹上获得。(B类). 进行了类似的实验，但包括150 nM Crizotinib处理的细胞。虽然Crizotinib也降低了Myc的表达，但使用MG132未能有效恢复其表达（第3道vs.第6道，条带强度0.41 vs.0.44，第页= 0.28). 用ImageStudioLite软件计算带密度测定，结果分别归一化为RR-siCtrl加或不加DMSO组。学生的t吨-使用GraphPad进行测试，结果显示在下部面板中**第页< 0.01, ***第页< 0.001, ****第页< 0.0001. 进行了三个复杂的实验，并显示了典型运行的结果。
图5
图5
核NPM-ALK:FL-NPM1异二聚体在RR细胞中更为丰富。(A类,B类). 使用RU和RR细胞（来源于SupM2）的细胞裂解物和抗ALK抗体进行免疫沉淀实验((A类). 左上面板）或FL-NPM1((B类). 左中面板）。两个实验的结果都支持NPM-ALK:FL-NPM1异二聚体在RR细胞中更为丰富。蛋白质输入显示在左下面板中。(C). RU和RR细胞（SupM2）的核裂解物经过大小排阻色谱。然后进行蛋白质印迹研究以确定NPM-ALK和FL-NPM1的分布。大多数NPM-ALK和FL-NPM1蛋白在组分1-5中发现，代表最大的蛋白质复合物。在RU细胞中，大部分在组分1中发现，其中仅发现相对少量的FL-NPM1。在RR细胞中，NPM-ALK和FL-NPM1似乎在所有5个组分中共存。进行了三个独立的实验，并显示了典型运行的结果。
图6
图6
Myc的蛋白酶体降解机制在RR细胞中相对无效，这一发现与其与NPM-ALK的物理联系有关。使用RU和RR细胞（来自SupM2）的裂解物和Fbw7γ抗体进行的免疫沉淀实验表明，RU细胞中的pS62/pT58比率显著降低（0.8比1.2*第页< 0.05). 蛋白质输入显示在右侧面板中。进行了三个独立的实验，并显示了代表性研究的结果。
图7
图7
RR细胞中发现NPM-ALK:FL-NPM1融合信号显著增高，这些信号与Myc信号显著相关。(A类). 来自UCONN-L2细胞的RU和RR细胞的免疫荧光染色的代表性图像。使用蔡司LSM710共焦显微镜在40倍油透镜下拍摄照片。用抗结合型Myc-AF488抗体、以Alexa Fluor 647为二级抗体的ALK和以Alexa555为二级抗原的FL-NPM1对细胞进行染色。为了显示ALK和FL-NPM1之间更好的相关性，我们将Myc-AF488的颜色设置为橙色，而ALK和FLA-NPM1分别设置为红色或绿色。最后一个面板中显示了合并的ALK和FL-NPM1通道（比例尺（水平红线）等于10µm）。(B类). 对RU和RR细胞（左面板）或患者样本（右面板）进行线性回归分析和皮尔逊相关分析。从RU或RR细胞中选择7个细胞以及随机选择的22个肿瘤细胞进行分析，并通过使用ImageJ软件进行像素强度计算。RU/RR细胞和肿瘤的相关系数分别为0.9和0.8(第页分别<0.001和<0.0001）。
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物质

赠款和资金

这项研究得到了阿尔伯塔大学授予RL的内部研究拨款的支持。