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.2023年6月30日；9（26）：阅读6308。
doi:10.1126/sciadv.ade6308。 Epub 2023年6月30日。

N个-乙酰神经氨酸丙酮酸裂解酶控制肌肉再生和功能所必需的肌肉糖蛋白的唾液酸化

阿菲茨·达·席尔瓦 1, 朱尼奥·多特 1, 扎卡里亚·奥尔菲 1, 潘雪芳 1, Sjanie Huang女士 2, Ikhui Kho公司 1 三, 艾米莉·赫克尔 1, 贾科莫·穆斯卡内拉 1, 帕特里克·皮特·范·弗利特 1, 路易斯·斯图里亚尔 4, 安吉拉·梅西纳 4, 多娜塔·阿加塔·罗密欧 4, 克拉拉·D·M·凡·卡内贝克 5, 小燕文 6, 亚历山大·希内克 7, 托马斯·莫利纳 1, 格雷戈·安德芬格 1, 本杰明·埃勒扎姆 1, 山中义郎 8, 埃尔南多·J·奥利沃斯 9, 卡洛斯·莫拉莱斯 三, 珍妮·塞巴斯蒂安·乔亚尔 1, 德克·勒菲伯 2 10, 多梅尼科·加罗佐 4, 尼古拉斯·阿杜蒙特 1 11, 阿列克谢·V·普谢泽茨基 1 三
附属公司

N个-乙酰神经氨酸丙酮酸裂解酶控制对肌肉再生和功能至关重要的肌肉糖蛋白的唾液酸化

阿菲茨·达·席尔瓦等。 科技进步. .

摘要

有害变体N个-乙酰神经氨酸丙酮酸裂解酶（NPL）可引起人类和斑马鱼的骨骼肌病变和心脏水肿，但其生理作用尚不清楚。我们报告了该疾病小鼠模型的生成：Npl公司63C兰特携带人类p.Arg63Cys变异体Npl公司del116（删除116）116-bp外显子缺失。在这两个菌株中，NPL缺乏导致游离唾液酸水平急剧增加，骨骼肌力量和耐力降低，心毒素诱导的肌肉损伤后愈合较慢，新形成的肌纤维尺寸较小，糖酵解增加，线粒体功能部分受损，以及肌营养不良聚糖和线粒体LRP130蛋白的异常唾液酸化。禁食和受伤后，以及遗传性肌肉营养不良的人类患者和小鼠模型中，肌肉中NPL催化的唾液酸降解增加，表明NPL对肌肉功能和再生至关重要，是肌肉损伤的一般标志。口服N个-乙酰甘露糖胺治疗骨骼肌病，以及线粒体和结构异常Npl公司63C兰特小白鼠，提示对人类患者有潜在的治疗作用。

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数字

图1。
图1.纯合子Npl公司63C兰特和Npl公司del116（删除116）小鼠表现出组织中NPL缺乏和大量尿游离Sia排泄。
(A类)骨骼肌、内脏器官和大脑匀浆中的NPL活性Npl公司63C兰特,Npl公司del116（删除116）和WT小鼠。(B类)相对Npl公司肾组织mRNA水平Npl公司63C兰特,Npl公司del116（删除116）和WT小鼠。每组分析四只小鼠（两只雄性/两只雌性）。使用Tukey事后检验的单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析。(C类)小鼠肾组织的Western blot显示两者均无36-kDa NPL交叉反应蛋白带Npl公司63C兰特和Npl公司del116（删除116）老鼠。使用用表达WT人FLAG-（DYKDDDDK）标记的NPL[分子量（MW），37kDa]的质粒转染的HEK细胞的裂解物作为阳性对照。底部面板显示负载控制，β-actin。(天)WT尿液中游离Sia总浓度，不良贷款63C兰特、和不良贷款del116（删除116）老鼠。每组分析四只小鼠（两只雄性/两只雌性）。使用单向方差分析和Tukey事后检验进行统计分析。
图2。
图2.纯合子Npl公司63C兰特和Npl公司del116（删除116）老鼠表现出肌肉无力。
(A类)带WT的后腿悬架测试(n个=9，5只雄性和4只雌性），Npl公司63C兰特(n个=7，4只雄性和3只雌性），以及Npl公司del116（删除116）(n个=10，5只雄性和5只雌性）10日龄小鼠。(B类)带WT的前肢悬挂测试(n个=13，8只雄性/5只雌性），Npl公司63C兰特(n个=13，7只雄性/6只雌性），以及Npl公司del116（删除116）(n个=10，5只雄性和5只雌性）6周龄小鼠。(C类)使用WT进行握力测试(n个=7，4只雄性和3只雌性），Npl公司63C兰特(n个=7，4名男性和3名女性），以及Npl公司del116（删除116）(n个=7，3只雄性/4只雌性）10周龄小鼠。所有统计分析均采用单向ANOVA检验和Tukey事后检验。EDL肌肉的等轴测收缩特性显示为比力(天)和最大力(E类)在2个月大的WT中，Npl公司del116（删除116）、和Npl公司63C兰特老鼠。数据以平均值±SEM表示n个=每组6只（3只雄性和3只雌性）小鼠。使用双向ANOVA检验和Bonferroni事后检验进行统计分析***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001. ns，不显著。(F类)来自WT的EDL肌肉的离体等长疲劳特征，Npl公司德尔116、和Npl公司63C兰特老鼠。条形图显示了60次收缩后产生的初始力的百分比。(G公司)2个月大的WT的股四头肌、三头肌、腓肠肌和胫骨前肌质量正常，Npl公司63C兰特、和Npl公司del116（删除116）老鼠(n个=6，每个基因型3只雄性和3只雌性）。(H（H）)Npl公司del116（删除116）和Npl公司63C兰特小鼠体重增加正常(n个=每性别每基因型4个）。(我)2月龄WT肌纤维直径分布，Npl公司63C兰特、和Npl公司del116（删除116）老鼠。通过对WT、，Npl公司del116（删除116）、和Npl公司63C兰特使用ImageJ的小鼠；n个=每性别每基因型3个。比例尺，150μm。使用双向ANOVA检验和Bonferroni事后检验进行统计分析****P（P）< 0.0001.
图3。
图3。。Npl公司63C兰特在心脏毒素诱导的肌肉损伤后，小鼠表现出较慢的愈合和较小直径的肌纤维。
(A类)肌注心脏毒素后再生第14天和第21天胫前肌的组织学变化。面板显示了苏木精和伊红（H&E）染色后具有代表性的小鼠肌肉横截面。比例尺，150μm。三个WT和三个Npl公司63C兰特对小鼠（两只雄性，一只雌性）进行分析。(B类)受伤WT和Npl公司63C兰特损伤后21天，用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）和抗层粘连蛋白抗体（绿色）标记小鼠。比例尺，150μm。(C类)损伤WT和WT肌纤维直径的分布Npl公司63C兰特小鼠伤后21天。通过对三个WT和三个WT3的胫骨前断面的形态计量分析来量化肌纤维的直径Npl公司63C兰特使用ImageJ软件的小鼠（两只雄性/一只雌性）。采用双向方差分析进行统计分析**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，以及****P（P）< 0.0001. (天)三个WT和三个WT3的代表性胫骨前断面Npl公司63C兰特伤后14天，用DAPI（蓝色）和抗肌生成素抗体（绿色）标记小鼠（两只雄性/一只雌性）。比例尺，50μm。(E类)肌生成素密度+单元格/mm2三个WT和三个Npl公司63C兰特小鼠（两只雄性/一只雌性）。每只小鼠用三个切片进行定量。使用Student’st吨测试，P（P）< 0.0001.
图4。
图4 ManNAc治疗可缓解NPL缺乏患者的肌肉无力并加速肌肉损伤愈合Npl公司del116（删除116）老鼠。
(A类)未经治疗的10日龄婴儿后肢悬吊试验中的跌倒潜伏期Npl公司63C兰特老鼠(n个=10，5名男性/5名女性）和接受ManNAc的患者(n个=11，6只雄性/5只雌性）。采用方差分析和Tukey事后检验进行统计分析。(B类)未经治疗的6周大婴儿在前肢悬吊试验中的跌倒潜伏期(n个=10，5名男性/5名女性）和ManNAc治疗(n个=11，6只雄性/5只雌性）Npl公司63C兰特小鼠在治疗期间和停止治疗24小时后。采用方差分析和Tukey事后检验进行统计分析。(C类)10周龄WT的握力(n个=10，5只雄性/5只雌性），未经治疗Npl公司63C兰特(n个=11，5只雄性/6只雌性），并接受ManNAc治疗Npl公司R63C型老鼠(n个=8，4只雄性/4只雌性）。数据表示为归一化为体重的平均力。使用方差分析测试和Tukey事后检验进行统计分析。EDL肌肉的等长收缩特性显示为最大力(天)和比力(E类)在2个月大的WT中，Npl公司63C兰特、和Npl公司63C兰特用ManNAc治疗的小鼠。数据以平均值±SEM表示(n个=5，每组3只雄性/2只雌性）。使用双向ANOVA检验和Bonferroni事后检验进行统计分析***P（P）<0.001和****P（P）< 0.0001. 传输电子图像，放大倍数×4800(F类), ×9300 (G公司)和×13000(H（H）)WT胫骨前肌纵切面，Npl公司63C兰特,Npl公司del116（删除116）和ManNAc治疗Npl公司63C兰特老鼠。在NPL缺乏小鼠的肌肉中，红色箭头显示不规则形状的肌管，黄色箭头显示畸形的线粒体。面板显示了每组四只小鼠（两只雄性/两只雌性）的代表性结果。
图5。
图5 ManNAc挽救了Npl公司63C兰特老鼠。
(A类)肌肉注射心脏毒素后再生第14天和第21天胫骨前肌的组织学变化。H&E染色后，面板显示具有代表性的肌肉横截面。比例尺，150μm。三个WT，三个Npl公司63C兰特和三个ManNAc治疗Npl公司63C兰特对每组小鼠（两只雄性/一只雌性）进行分析。(B类)伤后第21天取小鼠胫骨代表性前断面，用DAPI（蓝色）和抗层粘连蛋白抗体（绿色）染色。比例尺，150μm。(C类)伤后21天小鼠肌纤维直径分布。使用ImageJ软件对胫骨前断面进行形态计量分析，量化肌纤维直径。每组研究三只小鼠（两只雄性/一只雌性）。使用双向方差分析和Bonferroni事后检验进行统计分析*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，以及****P（P）< 0.0001. (天)成肌细胞延迟融合和肌管成熟Npl公司63C兰特和Npl公司63C兰特ManNAc拯救了这些老鼠。面板显示了来自WT、，Npl公司63C兰特、和Npl公司del116（删除116）小鼠在分化为肌管的第5天，在没有或存在800μM ManNAc的情况下培养。用DAPI（蓝色）和MF20抗体（肌球蛋白重链，绿色）标记细胞。图中显示了每根肌管的细胞核数以及用ImageJ软件量化的肌球蛋白阳性肌管直径。比例尺，20μm。数据以平均值±SEM表示（每个条件建立三个独立培养物；每个培养物分析20到30个细胞）。使用单向方差分析检验和Tukey事后检验进行统计分析。
图6。
图6：NPL缺乏小鼠体内Sia合成途径的代谢物升高。
Neu5Ac水平(A类)，Neu5Gc(B类)和Sia-核苷酸，CMP-Neu5Ac(C类)和CMP-Neu5Gc(天)在WT的肌肉组织中测量，Npl公司del116（删除116）,Npl公司63C兰特，和ManNAc治疗Npl公司63C兰特老鼠。总Sia水平(E类)，Neu5Ac(F类)和Neu5Gc(G公司)在WT的尿液中测量，Npl公司del116（删除116）,Npl公司63C兰特和ManNAc治疗Npl公司R63C型老鼠。图表显示了每组用五到七只小鼠进行的实验的单个值、平均值和SD。使用单向方差分析检验和Tukey事后检验进行统计分析。
图7。
图7……蛋白质糖基化异常Npl公司63C兰特老鼠。
(A类)MALDI-TOF型材（质量范围米/z1100和4100）N个-代表WT的肌肉组织糖蛋白聚糖，Npl公司63C兰特和ManNAc治疗Npl公司63C兰特小鼠样本。物种检测为[M+Na]+分子离子（单同位素质量）。(B类)不同物种的相对峰面积比较（显示为平均值±SEM，并归一化为表S1中报告的42个物种的总面积）N个-WT和NPL突变小鼠肌肉组织糖蛋白中的聚糖群体。采用单因素方差分析和Tukey事后检验进行统计分析*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001. (C类)超唾液酸化双天线物种的MALDI-TOF/TOF分析米/z3243.59显著积聚在Npl公司63C兰特样本，并在ManNAc处理后减少。整体裂解模式表明，在二异丙基天冬氨酸处额外Neu5Gc的位置存在两种不同的异构体。在所有面板中，聚糖的图形表示基于糖生物学基础(59)：GlcNAc，蓝色方形；人，绿色圆圈；Gal，黄色圆圈；Neu5Ac，紫色钻石；Neu5Gc，浅蓝色钻石；Fuc，红色三角形；%一、 强度百分比
图8。
图8.大鼠肌肉组织中α-DG和线粒体LRP130的唾液酸化增加Npl公司63C兰特小鼠通过ManNAc治疗恢复。
(A类)来自WT肌肉提取物的α-DG，Npl公司del116（删除116）,Npl公司63C兰特和ManNAc治疗Npl公司63C兰特用免疫沉淀法纯化小鼠，并用抗α-DG抗体、克隆IIH6C4（右）和SNL（左）进行印迹分析。图中显示了用SNL标记的α-DG带的组合强度（单个值、平均值和SD），并用用IIH6C4抗体标记的α-DG带的组合密度进行了归一化。Ponceau染色证实蛋白质负载量相等。每组分析四只小鼠。(B类)线粒体匀浆中的蛋白质，从WT肌肉中纯化，Npl公司63C兰特,Npl公司63C兰特和ManNAc治疗Npl公司del116（删除116）用SNL凝集素、抗LRP130抗体、PNA凝集素和ConA凝集蛋白对小鼠进行印迹分析。图中显示了用凝集素或抗体标记的蛋白质条带的强度（单个值、平均值和标准偏差），并通过Ponceau染色测量的总蛋白质丰度进行了归一化。每组分析三只小鼠。(C类)WT和WT的线粒体蛋白匀浆Npl公司del116（删除116）用SNL凝集素分析经细菌泛特异性唾液酸酶处理或未经处理的小鼠。处理显著降低了LRP130蛋白带对SNL的亲和力。所有统计分析均采用单向ANOVA检验和Tukey事后检验。
图9。
图9.NPL缺陷小鼠肌肉和成肌细胞中的线粒体异常。
乳酸增加(A类)和丙酮酸(B类)WT股四头肌，Npl公司63C兰特、和Npl公司del116（删除116）但未经ManNAc治疗Npl公司63C兰特老鼠。N个=4（每组2只雄性/2只雌性）。(C类)免疫印迹（左）显示WT的股四头肌中COX4蛋白增加，Npl公司63C兰特、和Npl公司del116（删除116）但未经ManNAc治疗Npl公司63C兰特老鼠。通过总蛋白标准化的COX4带强度的量化（右）。显示了每组三只小鼠实验的个体值、平均值和SD。使用单向方差分析检验和Tukey事后检验进行统计分析。(天)免疫印迹（左）显示WT肌肉纯化线粒体中COX4的水平相似，Npl公司63C兰特、和Npl公司del116（删除116）老鼠。COX4条带强度的量化（右）由总蛋白质丰度标准化。显示了每组三只小鼠实验的个体值、平均值和SD。(E类)NPL缺乏小鼠肌管中线粒体丰度增加。WT原代成肌细胞衍生肌管的荧光显微镜图像（左），Npl公司63C兰特-,Npl公司del116（删除116）-、和Npl公司63C兰特-在分化第3天处理小鼠，用DAPI和MitoTracker标记。比例尺，20μm。用ImageJ进行MitoTracker荧光定量（右）。每组用六种培养物的细胞进行实验的个人数据、平均值和SD。氧气消耗率降低(F类)和ATP相关呼吸(G公司)在培养的原代成肌细胞中Npl公司R63C型和Npl公司del116（删除116）使用XFe-24细胞外通量分析仪检测小鼠。图表显示了对每组三只小鼠的单个细胞培养物进行的三个实验的平均值和SD。使用Tukey事后检验（a）至（E）的ANOVA检验和Bonferroni事后检验（F）的双向ANOVA检验进行统计分析***P（P）<0.0001（WT与NPL缺乏小鼠）。
图10。
图10饥饿、肌肉损伤和肌肉营养不良诱导NPL催化的Sia裂解。
(A类)禁食可以减少延迟Npl公司63C兰特但对加速旋转试验中的WT小鼠则不适用。N个=每组16只（8只雄性/8只雌性）小鼠。(B类)Neu5Ac和(C类)禁食者尿中Neu5Gc增加Npl公司63C兰特但不禁食WT小鼠。N个=每组7只（4只雄性/3只雌性）。(天和E类)股四头肌中的Neu5GcNpl公司63C兰特禁食会增加小鼠的体重，但WT小鼠除外。(F类和G公司)禁食会增加大鼠股四头肌中CMP-Neu5Gc的水平，但不会增加CMP-Neu5Ac的水平Npl公司63C兰特老鼠。N个=每组7只（4只雄性/3只雌性）小鼠。(H（H）和我)禁食会增加WT股四头肌的NPL和NEU2活性。N个=每组6只（3只雄性/3只雌性）小鼠。(J和K（K）)注射心脏毒素10天后，胫前肌匀浆中的NPL和NEU2活性增加。N个=每组4只（2只雄性/2只雌性）小鼠。(L（左）和M（M）)与各自的WT对照组相比，Duchenne肌营养不良症（mdx）和强直性肌营养不良1型（DMXL）小鼠模型的胫骨前肌组织匀浆中NPL和NEU2活性增加。N个=每组5只（2只雄性/3只雌性）mdx小鼠及其对照组小鼠，3只雄性DMXL小鼠及其对照。(N个)与年龄/性别匹配的非肌病对照组相比，骨密度患者股四头肌活检组织匀浆中的NPL活性呈增加趋势，NEU2活性增加。显示了技术副本的单个结果、平均值和SD。使用双向方差分析和Bonferonni事后检验（a）进行统计分析，使用单向方差分析和Tukey事后检验（B）到（H）和（K），以及t吨测试（H）至（J）和（L）至（N）。
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    1. A.Varki，唾液酸与人类健康和疾病。《分子医学趋势》14，351–360（2008）。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. S.J.Moons、G.J.Adema、M.T.Derks、T.J.Boltje、C.Büll，使用N-乙酰甘露糖胺和唾液酸类似物的唾液酸糖化工程。糖生物学29433-445（2019）。-公共医学
    1. H.H.Freeze、G.W.Hart、R.L.Schnaar，糖基化前体，摘自《糖生物学精要》，A.Varki、R.D.Cummings、J.D.Esko、P.Stanley、G.W-Hart、M.Aebi、A.G.Darvill、T.Kinoshita、N.H.Packer、J.H.Prestegard、R.L Schnaar、P.H.Seeberger，Eds.（冷泉港实验室出版社，2015年），第51–63页。
    1. A.Varki、R.L.Schnaar、R.Schauer，唾液酸和其他非醛酸，摘自《糖生物学精要》，A.Varky、R.D.Cummings、J.D.Esko、P.Stanley、G.W.Hart、M.Aebi、A.G.Darvill、T.Kinoshita、N.H.Packer、J.H.Prestegard、R.L Schnaar和P.H.Seeberger，Eds.（冷泉港实验室出版社，2015年），第179-195页。-公共医学
    1. O.Pogoryelova，J.A.González Coraspe，N.Nikolenko，H.Lochmüller，A.Roos，《GNE肌病：从临床和遗传学到病理学和研究策略》。孤儿J.罕见疾病。13, 70 (2018).-项目管理咨询公司-公共医学