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.2023年5月；62(5):59.
doi:10.3892/ijo.2023.5507。 Epub 2023年3月31日。

YY1/miR-HCC2/BAMBI轴对肝癌细胞干性的调节作用

高慧杰 1, 洪霞扇 1, 洪燮 1
附属公司

YY1/miR‑HCC2/BAMBI轴对肝癌细胞干度的调节作用

高慧杰等。 国际癌症杂志. 2023年5月.

摘要

肿瘤干细胞在肝癌复发和转移中起着关键作用。因此，本研究评估了干细胞因子表达的新调节因子，以确定针对肝癌干细胞的新治疗策略。进行深度测序以确定肝癌组织中特异性改变的新microRNA（miRNAs）。通过逆转录定量PCR和western blotting检测干细胞标记的表达水平。球体形成分析和流式细胞术用于评估肿瘤球体形成能力和评估分化簇90的人群+细胞。肿瘤异种移植分析用于评估肿瘤的致瘤性、转移和干细胞体内进行生物信息学分析和增强型绿色荧光蛋白报告基因分析或萤光素酶报告基因分析，以确定miR‑HCC2及其上游转录因子的直接靶点。MiR‑HCC2强烈促进肝癌细胞的癌干细胞样特性体外; 它也有助于致瘤性、转移和干细胞体内骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂同源物是miR‑HCC2的直接靶点，激活Wnt/β‑catenin信号通路以促进肝癌细胞的干化。转录因子YY1结合到miR‑HCC2的启动子并激活其转录。本研究证明了miR‑HCC2在肝癌干细胞诱导中的重要性，为肝癌转移和复发提供了新的见解。

关键词：YY1年；骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂同源物；肝癌；miR‑HCC2；茎干。

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利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
MiR-HCC2在肝癌组织中上调，并在人类肝癌细胞中促进干细胞样特性。（A） 通过深度测序鉴定的五种代表性miRNA的测序读数和统计数据。（B） 肝癌组织和邻近非肿瘤组织中miR-HCC2的相对水平（n=13）。U6 RNA用于归一化。通过RT-qPCR和western blotting分析分别评估瞬时转染HepG2和Huh7细胞中干细胞标记物的相对（C）mRNA和（D）蛋白表达水平。箭头表示非特定条带。（E） 稳定miR-HCC2过度表达Huh7细胞中miR-HCCO2和干细胞标记物的mRNA和蛋白表达水平。样品来源于相同的实验，并并行处理印迹。（F） 肿瘤球体形成分析表明稳定的miR-HCC2过度表达Huh7细胞的球体形成能力增强。比例尺=100µm.（G）CD90比例评估+转染Huh7细胞中的细胞。所有实验均至少进行了三次。数据表示为平均值±标准偏差。*P<0.05，**P<0.01和***与相应对照组相比，P<0.001（miR-HCC2 vs.pcDNA3，ASO-miR-HCCO2 vs.ASO-NC，稳定miR-HCC2vs.pcDNA A3）。miR，microRNA；纳克，纳克同源盒；Sox2，性别决定区Y-box 2；Oct4，八聚体结合转录因子4；CD90，分化簇90；上皮细胞粘附分子EpCAM；反义寡核苷酸；NC，阴性对照。
图2
图2
MiR-HCC2增强肝癌细胞的增殖、转移和干细胞体内使用裸鼠肿瘤异种移植物模型来评估miR-HCC2对肿瘤生长和肿瘤转移的影响体内（A）从皮下注射的小鼠中分离出肿瘤。将pcDNA3载体和打乱的miRNA作为对照载体和对照miRNA。（B）从小鼠中分离肿瘤后，对肿瘤重量进行量化。（C） 注射后评估肿瘤体积。（D） 小鼠肿瘤结节中miR-HCC2、BAMBI和干细胞标记物的RNA表达水平。（E） 注射Huh7细胞的小鼠异种移植瘤中Sox2的H&E染色和免疫组织化学染色。比例尺=50µm.（F）从静脉注射的小鼠中分离的肺和肝组织的大体解剖评估。计数肺组织和肝组织切片中的肿瘤结节。（G） 肺和肝脏中Sox2的H&E染色和免疫组织化学染色。比例尺=50µ肺和肝脏中miR-HCC2、BAMBI和干细胞标记物的m（H）RNA表达水平。比例尺=50µ将所有结果与相应的对照组进行比较。数据表示为平均值±标准偏差。*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。miR，miRNA；miRNA，microRNA；纳克，纳克同源盒；Sox2，性别决定区Y-box 2；Oct4，八聚体结合转录因子4；CD90，分化簇90；上皮细胞粘附分子EpCAM；甲胎蛋白；BAMBI、骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂同源物；H&E、苏木精和曙红。
图3
图3
BAMBI促进人类肝癌细胞的干细胞样特性。分别采用逆转录定量PCR和western blotting分析评估转染肝癌细胞中BAMBI和干细胞标记物的（A和B）mRNA和（C和D）蛋白表达水平。样品来源于相同的实验，并并行处理印迹。箭头表示非特定条带。（E） 球形形成试验用于评估BAMBI对肿瘤球形形成能力的影响。比例尺=100µm.（F）CD90的比例+用流式细胞术检测肝癌细胞中的细胞。所有实验均至少进行了三次。数据以平均值±标准差表示。*P<0.05，**P<0.01和***与相应对照组相比，P<0.001（BAMBI vs.pcDNA3和shR-BAMBI vs.pSilencer-NC）。纳克，纳克同源盒；Sox2，性别决定区Y-box 2；Oct4，八聚体结合转录因子4；CD90，分化簇90；上皮细胞粘附分子EpCAM；短发夹RNA；BAMBI、骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂同源物；NC，阴性对照。
图4
图4
抑制BAMBI表达可消除miR-HCC2对人类肝癌细胞干细胞样特性的影响。在miR-HCC2存在下shR-BAMBI转染后，测定HepG2和Huh7细胞中干性标记物的（A和B）mRNA和（C和D）蛋白表达水平。样品来源于相同的实验，并并行处理印迹。箭头表示非特定条带。（E） 通过抑制BAMBI，miR-HCC2介导的肿瘤成球能力增加被消除。比例尺=100µm.（F）miR-HCC2介导的CD90比例增加+通过抑制BAMBI使细胞减少。所有实验至少进行三次。数据表示为平均值±标准偏差。*P<0.05，**P<0.01和***与相应的对照组相比，P<0.001（miR-HCC2+pSilencer-NC vs.pcDNA3+pSillecer-NC和miR-HCC2+shR-BAMBI vs.pcDNA A3+pSilencer-CC）。纳克，纳克同源盒；Sox2，性别决定区Y-box 2；Oct4，八聚体结合转录因子4；CD90，分化簇90；上皮细胞粘附分子EpCAM；shR短发夹RNA；BAMBI、骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂同源物；NC，阴性对照；miR，microRNA；ns，不显著。
图5
图5
BAMBI促进β-catenin的核转位并激活Wnt/β-catening信号。BAMBI在HepG2和Huh7细胞中的过度表达或敲除显著增加或降低了β-catenin的（A和B）mRNA和（C）蛋白表达水平，降低或增加了Axin2的mRNA和表达水平。（D） 在BAMBI过度表达或敲除后评估β-catenin的核转位。样本来自相同的实验，并且杂交是并行处理的。箭头表示非特定条带。（E和F）小鼠肿瘤中β-catenin和BAMBI表达水平的相关性分析。*P<0.05，**P＜0.01***与相应对照组相比，P<0.001（BAMBI vs.pcDNA3和shR-BAMBI vs.pSilencer-NC）。BAMBI、骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂同源物；NC，阴性对照；短发夹RNA；Axin2，轴抑制蛋白2；ns，不显著。
图6
图6
YY1结合启动子区域并增强miR-HCC2的转录。（A） 启动子2.0表明预测的转录起始位点位于前miR-HCC2上游1至4kb区域。预测的miR-HCC2启动子-2273至-2288 bp和-2883至-2898 bp核苷酸的YY1结合位点由hTF靶点识别。（B） 双荧光素酶分析显示了Huh7细胞中miR-HCC2启动子片段报告子的活性。基本用作阴性对照。***与基本值相比，P＜0.001。（C） 双荧光素酶分析显示与YY1或shR-YY1共转染后miR-HCC2启动子片段报告子的活性。碱性和pGL3-对照分别用作阴性和阳性对照。*P<0.05和***P<0.001（YY1 vs.pcDNA3和shR-YY1 v.pSilencer-NC）。（D） 采用双荧光素酶分析评估转染YY1或shR-YY1后miR-HCC2启动子2-mut1和miR-HCCO2启动子2-mut2的活性。***P<0.001（YY1 vs.pcDNA3和shR-YY1 v.pSilencer-NC）。（E） 转染YY1或shR-YY1后，使用RT-qPCR评估miR-HCC2的主要转录物。*P<0.05和***P<0.001（YY1 vs.pcDNA3和shR-YY1 v.pSilencer-NC）。（F） 用RT-qPCR检测13对肝癌组织中YY1的表达水平。（G） 肝癌组织中YY1和miR-HCC2表达水平的相关性分析。将所有结果与相应的对照组进行比较。数据表示为平均值±标准偏差。（H） YY1/miR-HCC2/BAMBI轴在肝癌细胞干细胞调节中的作用模型。miR，microRNA；基本，pGL3-Basic；ns，不显著；RT-qPCR、逆转录定量PCR；BAMBI、骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂同源物；前体、前体。
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赠款和资金

本研究得到了国家自然科学基金（批准号81602410和81773002）和天津市自然科学基金会（批准号17JCQNJC11300）的支持。