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.2023年2月；27(2):47.
doi:10.3892/mmr.2023.12934。 Epub 2023年1月12日。

ASK1抑制剂NQDI‑1通过ASK1/p38和JNK信号通路降低大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的氧化应激和神经细胞凋亡

段佳佳 1, 文苑 2, 姜娟（Juan Jiang） 三, 王继凯 4, 燕晓欣 三, 刘飞 4, 刘爱华 1
附属公司

ASK1抑制剂NQDI‑1通过ASK1/p38和JNK信号通路降低大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的氧化应激和神经细胞凋亡

段佳佳等。 分子医学代表. 2023年2月.

摘要

氧化应激和神经细胞凋亡是蛛网膜下腔出血（SAH）后的关键病理过程。本研究在大鼠模型中评估了凋亡信号调节激酶1（ASK1）抑制剂乙基-2,7‑二氧代-2,7−二氢-3H‑萘酚（1,2,3‑de）喹啉-1-羧酸盐（NQDI-1）在SAH后早期脑损伤（EBI）中的抗氧化和抗凋亡神经保护作用。共使用191只大鼠，采用单丝穿孔法建立SAH模型。随后采用蛋白质印迹法检测蛋白质的内源性表达水平。然后用免疫荧光法确认ASK1的神经细胞定位。SAH后24小时，使用改良的Garcia评分和梁平衡测试评估短期神经功能，而使用旋转试验和Morris水迷宫测试评估长期神经功能。SAH后24h，TUNEL染色检测神经元凋亡，二氢乙硫磷染色检测氧化应激。SAH后磷酸化（p‑）ASK1和ASK1的蛋白表达水平升高。SAH后1小时，侧脑室注射NQDI‑1，显示出短期和长期神经功能的显著改善，并显著降低氧化应激和神经元凋亡。注射NQDI‑1后，p‑ASK1、p‑p38、p‐JNK、4羟基壬醛和Bax的蛋白质表达水平显著降低，血红素加氧酶1和Bcl‑2的蛋白表达水平显著升高。p38抑制剂BMS‑582949或JNK抑制剂SP600125的使用分别导致p‑p38或p‑JNK的蛋白表达水平显著降低，氧化应激和神经元凋亡显著降低；然而，这些抑制剂对p‑ASK1或ASK1蛋白表达水平没有影响。总之，NQDI‑1可能通过抑制ASK1磷酸化、ASK1/p38和JNK信号通路，改善了大鼠SAH后EBI的神经功能，降低了氧化应激和神经元凋亡。NQDI‑1可能被视为治疗SAH患者的潜在药物。

关键词：NQDI‑1；细胞凋亡；凋亡信号调节激酶1；早期脑损伤；氧化应激；蛛网膜下腔出血。

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数字

图1。
图1。
SAH后大鼠脑组织中ASK1的表达变化和细胞定位。（A） 假手术组和SAH 24小时组大鼠脑组织的代表性图像。（B） SAH建模后24小时大鼠的SAH评分（n=6；使用Scr siRNA作为siRNA对照）。（C） 蛋白质印迹图像和（D）ASK1和（E）p-ASK1/ASK1蛋白表达水平的半定量分析（n=6）。ASK1与（F）NeuN-阳性神经元、（G）Iba-1-阳性小胶质细胞和（H）GFAP阳性星形胶质细胞的免疫荧光。白色方框表示缩放图的位置，白色箭头表示ASK1与神经元细胞共同定位。比例尺，50µm。所有数据均表示为平均值±标准偏差*与假手术组相比，P<0.05。凋亡信号调节激酶1；蛛网膜下腔出血；Scr，加扰；小干扰RNA；NQDI-1，乙基-2,7-二氧基-2,7--二氢-3H-萘（1,2,3-de）喹啉-1-羧酸盐；胶质纤维酸性蛋白；ns，不显著。
图2。
图2。
ASK1抑制剂NQDI-1改善SAH后的短期和长期神经功能。NQDI-1对SAH后24小时大鼠（n=6）的（A）改良Garcia评分和（B）光束平衡评分的治疗作用。SAH后第7、14和21天，以（C）5和（D）10 rpm的初始速度进行Rotarod试验的大鼠跌倒潜伏期（n=10）。（E） 莫里斯水迷宫测试中游泳轨迹的典型图像。（F） SAH后第4周莫里斯水迷宫测试第1天至第5天的游泳距离和（G）逃避潜伏期训练阶段（n=10）。（H） SAH后第4周莫里斯水迷宫测试阶段（n=10），目标象限的平均游泳速度和（I）探针持续时间。数据表示为平均值±标准偏差*与假手术组相比P<0.05；#与SAH+车辆相比P<0.05；@与SAH+NQDI-1（1.0µg/kg）相比，P<0.05。凋亡信号调节激酶1；蛛网膜下腔出血；NQDI-1，乙基-2,7-二氧基-2,7--二氢-3H-萘（1,2,3_de）喹啉-1-羧酸盐；胶质纤维酸性蛋白；ns，不显著；rpm，每分钟转数。
图3。
图3。
ASK1抑制剂NQDI-1降低SAH后24小时的氧化应激和神经元凋亡。（A） DHE染色的显微照片。比例尺，50µm。（B） TUNEL染色的显微照片。比例尺，50µm。（C） DHE染色的定量分析（n=4）。（D） TUNEL染色定量分析（n=4）。所有数据均以平均值±标准偏差表示*与假手术组相比P<0.05；#与SAH+车辆相比，P<0.05。凋亡信号调节激酶1；蛛网膜下腔出血；NQDI-1，乙基-2,7-二氧基-2,7--二氢-3H-萘（1,2,3-de）喹啉-1-羧酸盐；二氢乙硫醚。
图4。
图4。
ASK1 siRNA、p38抑制剂BMS 582949和JNK抑制剂SP600125改善SAH后24小时的短期神经功能。（A） 大鼠SAH后24小时的改良Garcia评分和（B）光束平衡评分（n=6）。以Scr siRNA为对照。所有数据均以平均值±标准偏差表示*与假手术组相比P<0.05；#与SAH+车辆相比P<0.05；&与SAH+Scr siRNA.ns相比，P<0.05，无显著性差异；凋亡信号调节激酶1；蛛网膜下腔出血；Scr，加扰；小干扰RNA。
图5。
图5。
NQDI-1通过降低ASK1、p38和JNK的磷酸化来减轻SAH后的氧化应激和凋亡。（A） p-ASK1和ASK1的蛋白质印迹图像。半定量分析（B）ASK1蛋白表达水平（n=6）和（C）p-ASK1/ASK1蛋白表达水平。（D） p38和p38的蛋白质印迹图像。（E） p-p38/p38蛋白表达水平的半定量分析（n=6）。（F） p-JNK和JNK的Western blotting图像。（G） p-JNK/JNK蛋白表达水平的半定量分析（n=6）。（H） 4-HNE和HO-1的Western blotting图像。半定量分析（I）4-HNE蛋白表达水平（n=6）和（J）HO-1蛋白表达水平。（K） Bax和Bcl-2的免疫印迹图像。（L）Bax蛋白表达水平（n=6）和（M）Bcl-2蛋白表达水平的半定量分析（n=5）。以Scr siRNA为对照。所有数据均以平均值±标准偏差表示*与假手术相比P＜0.05；#与SAH+车辆相比P<0.05；&与SAH+Scr siRNA、ASK1、凋亡信号调节激酶1相比P<0.05；蛛网膜下腔出血；NQDI-1，乙基-2,7-二氧代-2,7-二氢-3H-萘（1,2,3-de）喹啉-1-羧酸盐；p、 磷酸化；4-氢萘，4-羟基壬醛；血红素加氧酶1；Scr，加扰；小干扰RNA。
图6。
图6。
p38抑制剂BMS 582949降低p-p38的蛋白表达，但对p-ASK1、ASK1或p-JNK的蛋白表达水平没有影响。（A） p-ASK1和ASK1的蛋白质印迹图像。半定量分析（B）ASK1蛋白表达水平（n=6）和（C）p-ASK1/ASK1蛋白表达水平。（D） p38和p38的蛋白质印迹图像。（E） p-p38/p38蛋白表达水平的半定量分析（n=6）。（F） p-JNK和JNK的Western blotting图像。（G） p-JNK/JNK蛋白表达水平的半定量分析（n=6）。（H） 4-HNE和HO-1的Western blotting图像。半定量分析（I）4-HNE蛋白表达水平（n=6）和（J）HO-1蛋白表达水平。（K） Bax和Bcl-2的免疫印迹图像。（L）Bax蛋白表达水平（n=6）和（M）Bcl-2蛋白表达水平的半定量分析。数据表示为平均值±标准偏差*与假手术组相比P<0.05；#与SAH+车辆相比P<0.05；&与SAH+NQDI-1、凋亡信号调节激酶1相比，P<0.05；蛛网膜下腔出血；NQDI-1，乙基-2,7-二氧基-2,7--二氢-3H-萘（1,2,3-de）喹啉-1-羧酸盐；p、 磷酸化；4-羟基壬烯醛；血红素加氧酶1；Scr，加扰；小干扰RNA；ns，不显著。
图7。
图7。
JNK抑制剂SP600125降低p-JNK的表达，但对p-ASK1、ASK1或p-p38无影响。（A） p-ASK1和ASK1的蛋白质印迹图像。半定量分析（B）ASK1蛋白表达水平（n=6）和（C）p-ASK1/ASK1蛋白表达水平。（D） p-p38和p38的蛋白质印迹图像。（E） p-p38/p38蛋白表达水平的半定量分析（n=6）。（F） p-JNK和JNK的Western blotting图像。（G） p-JNK/JNK蛋白表达水平的半定量分析（n=6）。（H） 4-HNE和HO-1的蛋白质印迹图像。半定量分析（I）4-HNE蛋白表达水平（n=6）和（J）HO-1蛋白表达水平。（K） Bax和Bcl-2的免疫印迹图像。半定量分析（L）Bax蛋白表达水平（n=6）和（M）Semi-Bcl-2蛋白表达水平。所有数据均表示为平均值±标准偏差*与假手术组相比P<0.05；#与SAH+车辆相比P<0.05；&与SAH+NQDI-1、凋亡信号调节激酶1相比，P<0.05；蛛网膜下腔出血；NQDI-1，乙基-2,7-二氧基-2,7--二氢-3H-萘（1,2,3-de）喹啉-1-羧酸盐；p、 磷酸化；4-氢萘，4-羟基壬醛；血红素加氧酶1；Scr，加扰；小干扰RNA；ns，不显著。
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物质

赠款和资金

本研究得到了国家自然科学基金（批准号81870944）、北京市科学技术计划课题：北京-天津-河北协同创新促进项目（批准号Z181100009618035）、国家自然科学研究基金（批准编号81771233）、，北京市医院管理局提升计划（批准号：DFL20190501）和中国高危脑卒中患者干预适宜技术研究与推广计划（批准编号：GN-2020R0007）。