The histone demethylase KDM5C functions as a tumor suppressor in AML by repression of bivalently marked immature genes

doi:10.1038/s41375-023-01810-6

.2023年3月；37(3):593-605.

doi:10.1038/s41375-023-01810-6。 Epub 2023年1月12日。

组蛋白去甲基化酶KDM5C通过抑制二价标记的未成熟基因在AML中发挥抑癌作用

附属公司

¹芬森实验室，哥本哈根大学医院-Rigshospitalet，哥本哈根，丹麦。
²哥本哈根大学生物技术研究与创新中心，丹麦哥本哈根。
^三诺和诺德基金会干细胞生物学中心，丹麦哥本哈根大学健康科学学院丹斯特姆分校。
⁴丹麦哥本哈根大学自然科学学院生物系生物信息中心。
⁵丹麦欧登塞南丹麦大学生物化学与分子生物学系和VILLUM生物分析科学中心。
⁶瑞典赫丁格卡罗琳斯卡研究所医学部。
⁷丹麦哥本哈根Rigshospitalet血液科。
⁸丹麦哥本哈根大学健康与医学科学学院临床医学系。
⁹美国纽约州纽约市斯隆-凯特琳纪念癌症中心细胞生物学项目和表观遗传学中心。
¹⁰英国伦敦癌症研究所（ICR）。
¹¹芬森实验室，哥本哈根大学医院-Rigshospitalet，哥本哈根，丹麦。bo.porse@finsenlab.dk。
¹²哥本哈根大学生物技术研究与创新中心，丹麦哥本哈根。bo.porse@finsenlab.dk。
¹³诺和诺德基金会干细胞生物学中心，丹麦哥本哈根大学健康科学学院丹斯特姆分校。bo.porse@finsenlab.dk。
¹⁴丹麦哥本哈根大学健康与医学科学学院临床医学系。bo.porse@finsenlab.dk。

^#贡献均等。

PMID： 36631623
预防性维修识别码： PMC9991918
内政部： 10.1038/s41375-023-01810-6

组蛋白去甲基化酶KDM5C通过抑制二价标记的未成熟基因在AML中发挥抑癌作用

梅特·路易斯·特伦佩诺等。白血病. 2023年3月.

.2023年3月；37(3):593-605.

doi:10.1038/s41375-023-01810-6。 Epub 2023年1月12日。

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¹芬森实验室，哥本哈根大学医院-Rigshospitalet，哥本哈根，丹麦。
²哥本哈根大学生物技术研究与创新中心，丹麦哥本哈根。
^三诺和诺德基金会干细胞生物学中心，丹麦哥本哈根大学健康科学学院丹斯特姆分校。
⁴丹麦哥本哈根大学自然科学学院生物系生物信息中心。
⁵丹麦欧登塞南丹麦大学生物化学与分子生物学系和VILLUM生物分析科学中心。
⁶瑞典哈丁格卡罗林斯卡研究所医学部。
⁷丹麦哥本哈根Rigshospitalet血液科。
⁸丹麦哥本哈根大学健康与医学科学学院临床医学系。
⁹美国纽约州纽约市斯隆-凯特琳纪念癌症中心细胞生物学项目和表观遗传学中心。
¹⁰英国伦敦癌症研究所（ICR）。
¹¹芬森实验室，哥本哈根大学医院-Rigshospitalet，哥本哈根，丹麦。bo.porse@finsenlab.dk。
¹²哥本哈根大学生物技术研究与创新中心，丹麦哥本哈根。bo.porse@finsenlab.dk。
¹³诺和诺德基金会干细胞生物学中心，丹麦哥本哈根大学健康科学学院丹斯特姆分校。bo.porse@finsenlab.dk。
¹⁴丹麦哥本哈根大学健康与医学科学学院临床医学系。bo.porse@finsenlab.dk。

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PMID： 36631623
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摘要

表观遗传调节因子在包括急性髓细胞白血病（AML）在内的血液系统恶性肿瘤中经常发生突变。因此，识别和表征影响AML生物学的新表观遗传驱动因素有可能提高我们对AML的基本认识，并发现治疗干预的新选择。为了确定AML中新的肿瘤抑制表观遗传调控因子，我们在CEBPA突变AML的背景下进行了体内短发夹RNA（shRNA）筛选。这确定了组蛋白3赖氨酸4（H3K4）脱甲基酶KDM5C是一种肿瘤抑制因子，我们表明，减少KDM5C/KDM5C的表达会导致人类和小鼠AML细胞系以及Cebpa突变和inv（16）AML小鼠模型的体内生长加快。从机制上讲，我们表明KDM5C通过其在启动子上的去甲基化酶活性发挥转录阻遏物的作用。具体而言，KDM5C敲除导致全球H3K4me3水平升高，与二价标记的未成熟基因上调相关。这伴随着去分化表型，可通过调节几个直接和间接下游介质的水平来逆转。最后，KDM5C水平与女性AML患者长期无病生存率的相关性强调了我们研究结果的临床相关性，并确定KDM5C是AML中一种新的女性肿瘤抑制因子。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**图1。*5千马克*-击倒与AML的竞争优势和降低潜伏期有关。**
A类靶向染色质相关因子的体内shRNA筛选示意图。 B类基于基因本体分析的shRNA-library中靶向染色质相关因子的相对比例。该文库包含849个靶向315个基因的shRNAs。C类体内（顶部面板）和体外（底部面板）竞争性分析的示意图。通过BMT对靶向shRNA（GFP-selection）或非靶向竞争性shRNA（YFP-selection）以1:1 GFP/YFP比率转导的Lp30细胞进行体内竞争性分析。3周后通过BM的流式细胞术测定竞争优势。对于体外竞争分析，在每一代细胞培养物的一部分通过流式细胞仪进行分析。D类shControl和*5千马克*-KD组。靶向shRNA-转导的细胞是GFP-阳性细胞，而YFP-阳性BM细胞是通过竞争性非靶向对照shRNA转导的。E类Lp30的性能*5千马克*-BMT中的KD细胞归一化为目标/竞争细胞的输入比率(n个 = 每组4个）。F类小鼠移植shControl或*5千马克*-KD Lp30细胞(n个 = 每组8个）。**G公司**的相对表达式*5千马克*a、，*5亿丹麦马克，*和*5千马克*shControl中的c和*5千马克*-KD组通过RT-qPCR检测并归一化为*Actb公司*表达式。**H（H）**Inv移植小鼠存活分析（16）/*测试2*^−/−用shControl或sh转导的细胞*5千马克*.Insert：的相对表达式*科威特马克5a*在shControl和*5千马克*-KD组通过RT-qPCR检测并归一化为Actb表达。的相对表达式*5千马克*shControl中的c和*5千马克*-通过RT-qPCR对KD细胞进行分析，并将其归一化为*Actb公司*表达式。这些数据是两个独立实验的典型示例。我控制竞争文化和Kdm5c-KD Inv（16）/*测试2*^−/−细胞。

**图2。*5千马克*-KD导致H3K4me3富集和H3K4me1置换。**
A类,B类顶部面板：启动子处平均H3K4me1、H3K4me3、H3K27me3和H3K27ac读取密度（百万转录物，TPM）的平均线图(A类)和增强剂(B类)控制中vs5千马克-击倒（sh5千马克-I） Lp30细胞。箭头表示H3K4me1的位移和H3K4me3水平的增加。较浅阴影的色带表示平均值的标准误差。底部面板：所有启动子的平均H3K4me1、H3K4me3、H3K27me3和H3K27ac信号的热图(A类)和增强剂(B类)Lp30 shControl和sh中*5千马克*-I细胞基于H3K4me3峰宽进行排名（绘制单个TSS的5'至3'）。没有检测到H3K4me3峰的区域被随机聚类。小箭头表示TSS或增强子峰的中心。已将ESC和NPC中的KDM5C绑定包括在内进行比较。C类H3K4me1（左）、H3K4me3（中）和H3K27ac（右）的差异峰火山图*5千马克*-KD（什*5千马克*-一） vs对照Lp30细胞。根据生物复制品ChIP-seqs进行量化。D类全球组蛋白修饰差异表达比率的火山图*5千马克*-KD（什*5千马克*-一）质谱法测定对照Lp30细胞。E类,F类H3K4下翻译后修饰（PTM）的比率(D类)和K27(E类)组蛋白3的两个变体（H3.1和H3.3）*5千马克*-KD（什*5千马克*-一） vs对照Lp30细胞。*P（P）*-使用双尾法计算值T型-测试（未针对多次测试进行调整）。

**图3。启动子和增强子处的H3K4me3增益与二价和受抑制基因的上调相关。**
A类基因表达变化的火山图*5千马克*-KD与对照Lp30细胞的比较。从生物三倍体的RNA-seq中定量。B类右侧面板：RNA-seq和ChIP-seq数据之间的偶联分析的示意图概述。基因启动子根据转录调控（向上、向下和中性）进行划分，并比较启动子或附近增强子的ChIP信号*5千马克*-I和shControl单元。左图：基因启动子及其与不同H3修饰的相关性示意图(C类–F类)缺口箱线图显示H3K4me1-(C类)，H3K4me3-(D类)，H3K27me3-(E类)，或H3K27ac-signal(F类)中上调、下调或中性调控基因的启动子*5千马克-*KD（什*5千马克*-一）细胞与对照。未显示异常值。**G公司**显示ESCs中KDM5C信号的缺口箱线图（Outchkourov等人2013）[34]*5千马克*-I vs shControl单元。未显示异常值。**H（H）**shControl细胞中受抑制（H3K27me3）、活性（H3K 4me3）和二价启动子（H3k 4me3、H3K27 me3）的ESCs中KDM5C信号的陷线箱线图（Outchkourov等人，2013年）[34]。未显示异常值。我显示不同启动子类型（定义于**H（H）**)sh中上调的基因*Kdm5c-I公司*vs shControl Lp30细胞。J型活性启动子、二价启动子和抑制启动子的分数（定义见**H（H）**)sh中上调、下调或中性调控基因*5千马克*-KD细胞。

**图4。*5千马克*-KD导致去分化表型。**
A类基因集富集分析显示特定基因集的富集或缺失：髓系分化（NG_D_MY）、胎儿长期HSC（XHSC_LTHSC_fetal）、成人长期HSC和预后不良的AML特征（VALK_AML_CLUSTER_10）。B类在正常髓系分化阶段（未成熟到成熟）上调、下调和中性调控基因的平均Log2表达。LSK林⁻Sca-1型⁺c-套件⁺细胞、前GM前粒细胞/单核细胞前体、GMP粒细胞-单核细胞生成物、Gr粒细胞和单核细胞。数据来源于[54]。C类Lp30 AML（单线态，7-AAD阴性）的流式细胞术门控策略。D类控制频率和*5千马克*-KD Lp30细胞具有未成熟（c-Kit+）和成熟（Mac-1+）免疫表型。E类Lp30 shControl和*5千马克-*KD细胞。从三倍体小鼠中分离出的每5000个接种GFP+细胞的密集菌落数量。

**图5。直接和间接下游调解人促进*5千马克*-KD表型。**
A类–C类mRNA水平*抄送x6*(A类),*部落3*(B类)和等4(C类)（由RNAseq决定）响应*5千马克*-杜兰特D类–F类KDM5C（ESC/NPC）的占有率和以下基因启动子处所示组蛋白标记的变化*抄送x6*(D类),*部落3*(E类)和*其他4*(F类)（方框）回应*5千马克*-KD Lp30细胞。**G公司**–我mRNA水平*5千马克*和*抄送x6*(**G公司**),*部落3*(**H（H）**)和等4(我)（由qPCR测定）对指示shRNA的转导反应J型–**L（左）**用对照或转导的Lp30细胞移植小鼠的Kaplan–Meier生存分析*5千马克*-shRNA与shScr、sh或*抄送x6*(J型)，嘘*部落3*(**K（K）**)或sh等4(**L（左）**) (n个 = 每组8个）。**M（M）**Lp30急性髓性白血病的选通策略（单胎、DAPI阴性、GFP阳性、YFP阳性、BMT后3周评估）。N个Lp30细胞未成熟（c-Kit）的频率⁺)用指示的shRNA构建物进行双重转导后的体内免疫表型。

**图6。KDM5C表达对人类AML的预后价值。**
A类对照组和KDM5C-KD HL-60细胞的倍增时间（小时）。B类相对mRNA表达*KDM5C系列*HL-60控制和*KDM5C系列*-KD组通过RT-qPCR检测并归一化为*波兰2A*表达式。C类加倍控制时间（小时）和*KDM5C系列*-KD NB-4细胞。D类相对mRNA表达*KDM5C系列*NB-4控制和*KDM5C型*-KD组通过RT-qPCR检测并归一化为*波兰2A*表达式。E类之间的相关性*KDM5C系列*女性患者的表达和总体生存状态（TCGA数据集）。P值通过未配对双尾计算T型-用韦尔奇的修正进行测试。F类女性AML患者的总体生存率（TCGA数据集）根据高表达（高于中位数）和低表达（低于中位数）分组*KDM5C型*如图所示。生存时间少于6个月的患者被排除在分析之外。**G公司**之间的相关性*KDM5C系列*女性患者的表达和无病生存状态（TCGA数据集）。*P（P）*-值是通过未配对的双尾计算的T型-用韦尔奇的修正进行测试。**H（H）**女性AML患者的无病生存率（TCGA数据集）根据高表达（高于中位数）和低表达（低于中位数）分组*KDM5C系列*患者被排除在外(F类).我最常见的突变发生在25%的*KDM5C系列*高低女性患者（TCGA数据集）。通过费希尔精确试验确定的P值。J型反洗钱KDM5C功能模型。降低*5千马克*表达导致H3K4me3在KDM5C靶向基因上普遍富集，为二价标记基因启动子（低活性）增加表达提供了余地，而不会影响高活性基因。这些KDM5C靶向的二价基因在未成熟分化阶段表达，因此它们在*5千马克-*KD Lp30细胞导致肿瘤有利的去分化。

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1. Jing Y.PML-RARα融合蛋白与急性早幼粒细胞白血病的靶向治疗。白血病淋巴瘤。2004;45:639–48. doi:10.1080/10428190310001609933。-内政部-公共医学
1. Flavahan WA，Gaskell E，Bernstein BE。表观遗传可塑性与癌症特征。《科学》（纽约州纽约市）。2017;357https://www.science.org/toc/science/357/6348.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Bernstein BE、Mikkelsen TS、Xie X、Kamal M、Huebert DJ、Cuff J等。双价染色质结构标志着胚胎干细胞中的关键发育基因。单元格。2006;125:315–26. doi:10.1016/j.cell.2006.02.041。-内政部-公共医学
1. Cui K、Zang C、Roh T-Y、Schones DE、Childs RW、Peng W等。多能干细胞中的染色质特征表明二价基因在分化过程中的命运。细胞干细胞。2009;4:80–93. doi:10.1016/j.stem.2008.11.011。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
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[8] Cui K、Zang C、Roh T-Y、Schones DE、Childs RW、Peng W等。多能干细胞中的染色质特征表明二价基因在分化过程中的命运。细胞干细胞。2009;4:80–93. doi:10.1016/j.stem.2008.11.011。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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