Chemically modified small interfering RNA targeting Hedgehog signaling pathway for rheumatoid arthritis therapy

doi:10.1016/j.omtn.2022.12.008

.2022年12月12:31:88-104。

doi:10.1016/j.omtn.2022.12.008。 eCollection 2023年3月14日。

化学修饰小干扰RNA靶向Hedgehog信号通路治疗类风湿关节炎

郎林¹, 朱尚玲¹, 黄宏宇², 吴林平^三, 黄建林¹

附属公司

¹中华人民共和国广州市中山大学附属第六医院风湿科，邮编510655。
²加拿大安大略省多伦多市多伦多大学达拉·拉纳公共卫生学院临床公共卫生科和卫生政策、管理和评估研究所，邮编：M5T 3M7。
^三中国科学院广州生物医药卫生研究所化学生物学与药物发现中心，广州510530，中华人民共和国。

PMID： 36618268
预防性维修识别码：项目经理C9813581
内政部： 2016年10月10日/j.omtn.2022.12.008

化学修饰小干扰RNA靶向Hedgehog信号通路治疗类风湿关节炎

郎林等。摩尔热核酸. 2022.

.2022年12月12:31:88-104。

doi:10.1016/j.omtn.2022.12.008。 eCollection 2023年3月14日。

作者

郎林¹, 朱尚玲¹, 黄宏宇², 吴林平^三, 黄建林¹

附属公司

¹中华人民共和国广州市中山大学附属第六医院风湿科，邮编510655。
²加拿大安大略省多伦多市多伦多大学达拉·拉纳公共卫生学院临床公共卫生科和卫生政策、管理和评估研究所，邮编：M5T 3M7。
^三中国科学院广州生物医药卫生研究所化学生物学与药物发现中心，广州510530，中华人民共和国。

PMID： 36618268
预防性维修识别码：项目经理C9813581
内政部： 2016年10月10日/j.omtn.2022.12.008

摘要

类风湿关节炎（RA）是一种导致残疾的炎症性疾病；然而，现有的治疗方法仍然不能令人满意。活化的成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）在RA滑膜炎形成和关节破坏中起着重要作用。刺猬信号通路异常激活，导致RA-FLS的攻击性表型。然而，抑制Hedgehog信号通路的关键成分Smoothened（SMO）是否是RA的有效治疗方法仍不确定。在这里，我们设计了一系列小干扰RNA（siRNAs），专门针对SMO公司基因。通过精确的化学修饰，siRNAs的功效和稳定性显著提高，离靶效应最小化。优化的化学修饰的siRNA（si-S1A3-Chol）在没有转染试剂的情况下降低RA-FLS的增殖和侵袭性。此外，在胶原蛋白诱导的关节炎小鼠模型中，关节内注射si-S1A3-Chol可有效缓解关节破坏并改善运动功能。因此，我们的结果表明，靶向Hedgehog信号通路的化学修饰siRNA可能是RA的潜在治疗方法。

关键词：刺猬信号；MT：寡核苷酸：治疗和应用；平滑；化学改性；类风湿关节炎；小干扰RNA。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
化学修饰的siRNA通过高效抑制SMO表达（A）沉默效率筛选抗SMO siRNA。相对*SMO公司*用不同的siRNA（50nM）转染RA FLS 48小时后，通过qPCR评估mRNA表达，显示为与si-NC（50nM）相比的倍数变化（n=12）。（B）沉默状态下siRNA的浓度依赖性*SMO公司*在RA-FLSs以指定浓度（0.001–50 nM）转染si-h-5（左）或si-h/m-2（右）48 h后，通过qPCR测定mRNA表达。相对表达显示为相对于si-NC（50 nM，n=4）的倍数变化。（C）在RA-FLSs转染指定浓度（10、20和50 nM）的si-h/m-2 72 h后，通过western blot测定si-h/m-2在抑制SMO蛋白水平方面的浓度依赖性。GAPDH用作负荷对照。相对表达以SMO/GAPDH的比率计算，并表示为相对于si-NC（50 nM）的折叠变化（n=12）。（D） si-S1A3-Chol化学修饰图案的代表性示意图。（E）具有不同化学修饰模式的siRNA沉默效率筛选。相对*SMO公司*用裸siRNA或化学修饰的siRNA（50 nM）转染RA-FLSs 48 h后，通过qPCR评估mRNA表达，显示出与si-NC（50 nM）相比的倍数变化（左）（n=3）。热图（右）显示了RA-FLS中不同修饰的siRNA的平均抑制率百分比。（F）选定的化学修饰抗SMO siRNA的半数最大抑制浓度。沉默状态下siRNAs的浓度依赖性*SMO公司*在RA-FLSs转染裸siRNA或化学修饰的siRNA（指示浓度为0.01、0.1、1、2、5、10、20和50 nM）48 h后，通过qPCR评估mRNA表达，以si-NC（50 nM，n=3）的百分比表示。（G）所选化学修饰siRNA的蛋白质沉默效率。RA-FLSs转染si-h/m-2、si-S1A3或si-S1A4（50 nM）72 h后SMO蛋白的代表性western blot。GAPDH用作负载对照。相对表达以SMO/GAPDH的比率计算，并表示为相对于si-NC（50 nM）的折叠变化（n=6）。（H）沉默状态下si-S1A3-Chol的浓度依赖性*SMO公司*在RA-FLSs以指定浓度转染si-S1A3-Chol（不含任何转染试剂）48小时后，通过qPCR测定mRNA表达。以脂质体3000转染的si-S1O3（50 nM）作为阳性对照，相对表达显示为相对于si-NC（50 nM）的倍数变化（n=4）。数据表示为平均值±标准偏差ns，p>0.05；**使用Dunnett检验进行多重比较的单向方差分析，与si-NC组（A、C和H）或si-H/m-2（带转染试剂的裸siRNA）组（E和G）相比，p<0.01、***p<0.001、***p<0.0001。

图2
胆固醇结合化学修饰的siRNA逆转RA-FLSs功能障碍（A）si-S1A3-Chol处理后对SMO蛋白水平的抑制作用。用si-Scr-Chol或si-S1A3-Chol（800 nM）处理RA-FLSs 72 h后，总蛋白中SMO蛋白的代表性western印迹。使用GAPDH作为负荷对照。相对表达以SMO/GAPDH的比率计算，并表示为相对于si-Scr-Chol的折叠变化（n=6）。（B） si-S1A3-Chol处理后对GLI1蛋白水平的抑制作用。用si-Scr-Chol或si-S1A3-Chol（800nM）处理RA FLS 72小时后，核蛋白中GLI1蛋白的代表性蛋白质印迹。组蛋白H3用作负载对照。相对表达以GLI1/组蛋白H3的比率计算，并以与si-Scr-Chol的倍数变化表示（n=6）。（C） ELISA检测用si-Scr-Chol或si-S1A3-Chol（800 nM）处理RA-FLS 72 h（n=4）后，细胞培养上清液中细胞因子IL-6、IL-8、MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13的浓度。（D）用si-Scr-Chol或si-S1A3-Chol（800 nM）处理RA-FLSs 0、24、48和72 h后，通过CCK-8分析评估对细胞活力的影响，并在指定的时间点（n=6）检测吸光度。（E）流式细胞术检测细胞增殖。用si-Scr-Chol或si-S1A3-Chol（800 nM）处理RA-FLSs 48 h后，检测EdU-阳性细胞的百分比，如条形图所示（n=6）。（F）用si-Scr-Chol或si-S1A3-Chol（800 nM）处理RA-FLSs 48 h后，用流式细胞仪检测细胞周期的相分布，并测定S和G细胞的百分比₂/条形图中显示了M个相位（n=6）。（G）采用划痕伤口愈合试验检测si-S1A3-Chol处理后RA-FLSs的迁移能力。用si-Scr-Chol或si-S1A3-Chol（800 nM）处理RA-FLS 24小时后，拍摄到代表性图像，划痕线外迁移的细胞数量如条形图所示（n=6）。比例尺，400μm。（H）用si-Scr-Chol或si-S1A3-Chol（800 nM）处理RA-FLSs 48 H后，用趋化性试验检测其迁移能力12 H。采集典型图像，迁移细胞数量如条形图所示（n=6）。比例尺，200μm。（I）在用si-Scr-Chol或si-S1A3-Chol（800nM）处理RA FLS 48小时后，使用带有Matrigel涂层膜的transwell室评估侵袭能力。捕获代表性图像，侵入细胞的数量如条形图所示（n=6）。比例尺，200μm。数据以平均值±标准差ns表示，p>0.05；*通过单因素方差分析和Dunnett检验进行多重比较，得出与si-Scr-Chol组相比，p<0.05，***p<0.01，***p<0.0001。

图3
胆固醇结合化学修饰的siRNA改善CIA小鼠的关节炎进展并保持步态功能（A）CIA小鼠siRNA治疗示意图。在第0天和第21天免疫DBA/1小鼠，并从第7天到第56天每周关节内注射一次siRNA。分别将si-S1A3-Col（250 nmol/kg体重）、si-Scr-Col（250nmol/kg-kg体重）或等量生理盐水注入双侧胫股关节。处死所有小鼠，并在第63天采集标本。（B）关节炎评分从第21天到第63天进行，关节炎评分大于4表示CIA模型的成功诱导。si-S1A3-Chol对关节炎发生的影响由关节炎发病率的百分比决定，si-Scr-Chol组作为阴性对照组（n=6）。（C）从第21天到第63天的平均（SD）关节炎评分显示了si-S1A3-Chol对CIA小鼠关节炎进展的影响（n=6）。（D）右后爪的典型宏观视图显示了si-S1A3-Chol对减轻CIA小鼠关节炎严重程度的作用。（E）通过步态分析评估CIA小鼠的运动功能。典型的腹部图像由高速摄像机拍摄，数字足迹由这些图像生成。（F）通过步态参数评估si-S1A3-Chol对CIA小鼠步态功能的影响。代表性剖面图显示了不同处理组的后爪区域随步幅持续时间的动态变化。（G）前爪和后爪的平均（SD）集合面积随集合时间而变化，表明si-S1A3-Chol对CIA小鼠（n=6）运动功能障碍的逆转作用。（H）通过步态分析（n=6）测量si-S1A3-Chol对CIA小鼠爪子面积、爪子角度、步幅持续时间和步长的影响。（一）典型的显微CT上视图和侧视图显示了si-S1A3-Chol对CIA小鼠后爪骨侵蚀的保护作用。骨密度作为骨侵蚀的指标进行计算，如条形图所示（n=6）。比例尺，2 mm。数据以平均值±标准差ns表示，p>0.05；*通过单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett多重比较检验，比较各组之间的p<0.05、***p<0.01、***p<0.0001。

图4
胆固醇结合化学修饰的siRNA减轻CIA小鼠的炎症水平和病理损伤（A）CIA小鼠后爪SMO和GLI1蛋白的典型免疫组织化学图像显示了si-S1A3-Chol对Hedgehog信号通路活性的影响。相对IOD表示为与正常组相比的折叠变化（n=6）。比例尺，400μm。（B） ELISA测定了用si-Scr-Chol或si-S1A3-Chol（n=6）治疗的CIA小鼠的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平。（C） CIA小鼠的代表性H&E染色、藏红O染色和TRAP染色显示了si-S1A3-Chol的病理损伤预防作用。滑膜炎症、骨侵蚀和软骨损伤的组织病理学评分从0分到3分，TRAP染色阳性破骨细胞的数量手动计数（n=6）。比例尺，400μm。数据以平均值±标准差ns表示，p>0.05；*通过单因素方差分析和Dunnett多重比较检验，组间比较p<0.05，**p<0.01。

图5
体内胆固醇结合化学修饰siRNA对CIA小鼠的毒性（A）图片显示了不同治疗组CIA小鼠器官（肝、肾、肺、心脏和脾）在第63天收获的H&E染色切片。比例尺，100μm。（B）用CIA小鼠（n=6）血清ALT、AST、BUN和CREA水平作为肝功能和肾功能的指标。数据以平均值±标准偏差ns表示，与si-Scr-Chol组相比，通过单因素方差分析和Dunnett检验进行多重比较，p>0.05。

请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

声波刺猬信号通路介导类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞的增殖和迁移通过MAPK/ERK信号通路。
Liu F、Feng XX、Zhu SL、Huang HY、Chen YD、Pan YF、June RR、Zheng SG和Huang JL。刘峰等。前免疫。2018年12月5日；9:2847. doi:10.3389/fimmu.2018.02847。2018年eCollection。前免疫。2018 PMID：30568656 免费PMC文章。
平滑调节类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞的迁移通过Rho GTPase信号的激活。
彭伟X、朱思乐、张碧、石英明、冯XX、刘峰、黄继良、郑世光。彭伟新等。前免疫。2017年2月15日；8:159. doi:10.3389/fimmu.2017.00159。2017年电子收集。前免疫。2017 PMID：28261216 免费PMC文章。
抑制平滑细胞减少类风湿关节炎滑膜细胞的增殖。
朱SL、黄JL、彭WX、吴DC、罗MQ、李QX、李ZX、冯XX、刘F、王MX、陈WQ、奥尔森N、郑SG。 Zhu SL等。细胞分子免疫学。2017年2月；14(2):214-222. doi:10.1038/cmi.2015.67。Epub 2015年7月20日。细胞分子免疫学。2017 PMID：26189371 免费PMC文章。
靶向siRNA的dickkopf-1损害了类风湿关节炎中成纤维样滑膜细胞的活性。
Liu YY、Wang SY、Li YN、Bian WJ、Zhang LQ、Li YeH、Long L、Liu X、Zhang-XW、Li ZG。 Liu YY等。《中华医学杂志》（英文）。2020年3月20日；133(6):679-686. doi:10.1097/CM9.000000000000697。《中华医学杂志》（英文）。2020 PMID：32068606 免费PMC文章。
糖代谢在成纤维细胞样滑膜细胞侵袭性表型中的作用：类风湿关节炎的最新证据和治疗方法。
Masoumi M、Mehrabzadeh M、Mahmoudzehi S、Mousavi MJ、Jamalzehi M、Sahebkar A、Karami J。 Masoumi M等人。国际免疫药理学。2020年12月；89（A部分）：107064。doi:10.1016/j.intimp.2020.107064。Epub 2020 10月8日。国际免疫药理学。2020 PMID：33039953 审查。

查看所有类似文章

引用人

探讨LncRNA DANCR对类风湿关节炎氧化应激中Keap1-Nrf2/ARE通路的调节作用。
蔡斯，孙毅，王毅，林姿。蔡S等。免疫炎症疾病。2024年1月；12（1）：e1163。doi:10.1002/iid3.1163。免疫炎症疾病。2024 PMID：38270324 免费PMC文章。审查。
基于RNA和细胞的骨关节炎治疗的工程方法。
德朱利叶斯·CR、沃尔顿·BL、科拉佐·JM、德阿尔西·R、弗朗西尼·N、布鲁恩·JM、杜瓦尔·CL。 DeJulius CR等人。 Nat Rev风湿病。2024年2月；20(2):81-100. doi:10.1038/s41584-023-01067-4。Epub 2024年1月22日。 Nat Rev风湿病。2024 PMID：38253889 审查。
线粒体分子特征概要为类风湿关节炎患者的治疗提供了新的视角。
王Q，高QC，王QC，吴莉，于Q，何PF。王强等。《运输医学杂志》，2023年8月22日；21(1):561. doi:10.1186/s12967-023-04426-7。《运输医学杂志》，2023年。 PMID：37608254 免费PMC文章。
口服GSH通过保护BBB完整性和抑制沙门菌诱导的细胞凋亡对实验性沙门菌脑膜炎起到治疗作用。
郭浩、金伟、刘坤、刘斯、毛斯、周Z、谢磊、王刚、陈毅、梁毅。郭华等。神经免疫药理学杂志。2023年6月；18(1-2):112-126. doi:10.1007/s11481-022-10055-6。Epub 2022年11月24日。神经免疫药理学杂志。2023 PMID：36418663

工具书类

1. Smolen J.S.、Aletaha D.、McInnes I.B.类风湿关节炎。柳叶刀。2016;388:2023–2038.-公共医学
1. You S.、Koh J.H.、Leng L.、Kim W.U.和Bucala R.类风湿性滑膜的肿瘤样表型：分子分析和精确医学前景。风湿性关节炎。2018;70:637–652.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Aletaha D.，Smolen J.S.类风湿关节炎的诊断和治疗：综述。JAMA公司。2018;320:1360–1372.-公共医学
1. Fraenkel L.、Bathon J.M.、England B.R.、St Clair E.W.、Arayssi T.、Carandang K.、Deane K.D.、Genovese M.、Huston K.K.、Kerr G.等人。2021年美国风湿病学院类风湿关节炎治疗指南。关节炎护理研究2021；73:924–939.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Bottini N.、Firestein G.S.《RA中成纤维细胞样滑膜细胞的双重性：被动应答者和印迹侵略者》。自然修订版风湿病。2013;9:24–33.-项目管理咨询公司-公共医学

LinkOut-更多资源

全文源
其他
- NCI CPTAC分析门户

[1] Smolen J.S.、Aletaha D.、McInnes I.B.类风湿关节炎。柳叶刀。2016;388:2023–2038.-公共医学

[2] Smolen J.S.、Aletaha D.、McInnes I.B.类风湿关节炎。柳叶刀。2016;388:2023–2038.-公共医学

[3] You S.、Koh J.H.、Leng L.、Kim W.U.和Bucala R.类风湿性滑膜的肿瘤样表型：分子分析和精确医学前景。风湿性关节炎。2018;70:637–652.-项目管理咨询公司-公共医学

[4] You S.、Koh J.H.、Leng L.、Kim W.U.和Bucala R.类风湿性滑膜的肿瘤样表型：分子分析和精确医学前景。风湿性关节炎。2018;70:637–652.-项目管理咨询公司-公共医学

[5] Aletaha D.，Smolen J.S.类风湿关节炎的诊断和治疗：综述。JAMA公司。2018;320:1360–1372.-公共医学

[6] Aletaha D.，Smolen J.S.类风湿关节炎的诊断和治疗：综述。JAMA公司。2018;320:1360–1372.-公共医学

[7] Fraenkel L.、Bathon J.M.、England B.R.、St Clair E.W.、Arayssi T.、Carandang K.、Deane K.D.、Genovese M.、Huston K.K.、Kerr G.等人。2021年美国风湿病学院类风湿关节炎治疗指南。关节炎护理研究2021；73:924–939.-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Fraenkel L.、Bathon J.M.、England B.R.、St Clair E.W.、Arayssi T.、Carandang K.、Deane K.D.、Genovese M.、Huston K.K.、Kerr G.等人。2021年美国风湿病学院类风湿关节炎治疗指南。关节炎护理研究2021；73:924–939.-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Bottini N.、Firestein G.S.《RA中成纤维细胞样滑膜细胞的双重性：被动应答者和印迹侵略者》。自然修订版风湿病。2013;9:24–33.-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Bottini N.、Firestein G.S.《RA中成纤维细胞样滑膜细胞的双重性：被动应答者和印迹侵略者》。自然修订版风湿病。2013;9:24–33.-项目管理咨询公司-公共医学

将引文保存到文件

电子邮件引文

添加到集合

添加到我的书目

您保存的搜索

为外部引文管理软件创建文件

您的RSS源

化学修饰小干扰RNA靶向Hedgehog信号通路治疗类风湿关节炎

附属公司

化学修饰小干扰RNA靶向Hedgehog信号通路治疗类风湿关节炎

作者

附属公司

摘要

利益冲突声明

数字

类似文章

引用人

工具书类

LinkOut-更多资源

全文源

其他

摘要

利益冲突声明

数字

类似文章

引用人

工具书类

相关信息

LinkOut-更多资源

全文源

其他