Single-molecule and super-resolved imaging deciphers membrane behavior of onco-immunogenic CCR5

doi:10.1016/j.isci.2022.105675

.2022年11月25日；25(12):105675.

doi:10.1016/j.isci.2022.105675。 eCollection 2022年12月22日。

单分子和超分辨率成像破译癌免疫原性CCR5的膜行为

帕特里克·亨特¹, 亚历克斯·L·佩恩-德怀尔^1 2, 迈克尔·肖^三 4, Nathalie Signoret公司⁵, Mark C泄漏^1 2

附属公司

¹英国约克大学生物学系YO10 5DD。
²约克大学物理、工程与技术学院，约克YO10 5DD，英国。
^三英国米德尔塞克斯TW11 0LW特丁顿汉普顿路国家物理实验室。
⁴英国伦敦WC1E 6EA伦敦大学学院计算机科学系。
⁵约克大学赫尔约克医学院，约克YO10 5DD，英国。

PMID： 36561885
预防性维修识别码：项目经理C9763858
内政部： 2016年10月10日/j.isci.2022.105675

单分子和超分辨率成像破译癌免疫原性CCR5的膜行为

帕特里克·亨特等。 i科学. 2022.

.2022年11月25日；25(12):105675.

doi:10.1016/j.isci.2022.105675。 eCollection 2022年12月22日。

作者

帕特里克·亨特¹, 亚历克斯·L·佩恩-德怀尔^1 2, 迈克尔·肖^三 4, Nathalie Signoret公司⁵, Mark C泄漏^1 2

附属公司

¹约克大学生物系，约克YO10 5DD，英国。
²约克大学物理、工程与技术学院，约克YO10 5DD，英国。
^三英国米德尔塞克斯TW11 0LW特丁顿汉普顿路国家物理实验室。
⁴英国伦敦WC1E 6EA伦敦大学学院计算机科学系。
⁵约克大学赫尔约克医学院，约克YO10 5DD，英国。

PMID： 36561885
预防性维修识别码：项目经理C9763858
内政部： 2016年10月10日/j.isci.2022.105675

摘要

肿瘤建立致瘤微环境的能力是寻找新疗法的重要研究点。肿瘤形成微环境的部分原因是免疫细胞通过趋化轴（如CCR5-CCL5）吸引的“教育”。此外，癌细胞上调CCR5，再加上其与抗药性和转移等原癌特征的关联，表明CCR5是一个治疗靶点。然而，随着几个构象“池”的报道，表型研究必须能够揭示构象的异质性。为了应对这一挑战，我们对固定细胞中的CCR5进行了超分辨率结构照明显微镜（SIM）和单分子部分TIRF偶联HILO（PaTCH）显微镜检查。SIM数据显示CCR5集合的非随机空间分布，而PaTCH图像中CCR5集合体的强度追踪显示二聚亚单位独立于CCL5扰动。这些生物物理方法可以为肿瘤免疫原性受体和许多其他生物分子的结构和功能提供重要的见解。

关键词：生物物理学；癌症；免疫学。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
用DyLight 650-MC-5（A–G）标记的CHO-CCR5细胞的SIM图像CHO-CR5细胞的单个SIM图像平面，从基底膜到顶端膜，以500 nm的步长，显示细胞边界分割和放大的插图。（H） A–F所示图像上的颜色深度投影）。（一） a-g）所示细胞图像的三维重建。（比例尺2μm，（放大插图1μm））。

图2
用DyLight 650-MC-5（A）标记的CHO-CCR5细胞基底膜中CCR5的图像和定量聚类指标代表性CHO-CCR细胞基底膜的宽视野图像（标尺2μm）。（B）同一小区的SIM重建。（C） SIM图像的二值化掩码显示阈值CCR5点。D）单个点状质心的数量密度分布，范围为0至6.4μm⁻²（E）说明了Ripley的H分析在均匀、聚集和分散点分布研究中的作用。（F）真实代表性CHO-CCR5单元（品红色）的Ripley H值分布，以及从随机泊松分布（蓝色）中采样其位移分离的点的生成2D图。图中还显示了描述通用分散点分布（绿色虚线）的预期结果的说明性曲线。插图显示了在0-1μm范围内CHO-CCR5单元（品红色）和随机点分布（蓝色）的Ripley H值的相同分布，并提供了二进制CHO-CCR 5点（N=10个单元）的平均最近邻距离。（G）以f）表示的CHO-CCR5细胞的Ripley H值分布梯度，为CHO-CCR 5（N=10细胞）提供了模式平均聚类梯度。

图3
使用流式细胞术和PaTCH显微镜对转染CHO细胞中GFP-CCR5的表达进行表征，证实了高于对照样品的增加（A）GFP发射强度在数百个细胞上的分布，无论是对照样品还是GFP-CCR阳性样品。（B）对照组和GFP-CCR5阳性细胞基底膜的PaTCH图像。细胞边界分割显示为白色。（比例尺2μm）。（C）对照细胞和GFP-CCR5阳性细胞前向散射面积的GFP范围发射强度散点图。a）和c）均显示了门控去除碎片和双重物后的细胞数量。（另见图S2）。

图4
GFP-CCR5 CHO细胞与已建立的CHO-CCR5细胞的比较在（A和B）使用PaTCH显微镜成像的表达GFP-CCR的CHO细胞和（B）使用SIM成像的DyLight 650标记的CHO-CR5细胞中，荧光标记物在细胞膜上明显分布。细胞边界分割显示为白色。（比例尺2μm，（放大插图1μm））。（另请参见图S1）。

图5
周期性化学计量分布表明CCR5组装体包括二聚亚基。通过PaTCH显微镜在GFP-CCR5转染的CHO细胞（N=9个细胞）中检测到的GFP-CCR5相关病灶（N=460个轨道）的化学计量和（插图）周期性化学计量间隔的核密度估计。核宽度=0.6分子，对应于单分子化学计量中的总不确定度，而非统计波动。因此，在较低的化学计量比下，概率密度或化学计量比的测量间隔更可靠。（另请参见图S3）。

图6
使用SIM和PaTCH显微镜（A–G）研究CCR5与激动剂CCL5的干扰。CCL5干扰的CHO-CCR5细胞的单个SIM图像，以500 nm的增量从基底膜到顶膜进行光学切片，包括细胞边界分割和放大插图。（H）（A–F）中所示细胞图像的颜色深度投影。（一）（A–G）所示细胞图像的3D重建（比例尺2μm，放大插页1μm）。（J）每个单元检测到的GFP-CCR5轨迹数，有CCL5扰动和无CCL5干扰，表示为水平分布的点，以允许单个可视化（分别为9个或11个单元）。（K） GFP-CCR5组件化学计量比的小提琴分布（有CCL5扰动和无CCL5干扰）表示为水平分布的点，以允许单独可视化（N=460或507轨道）。条、框和须分别表示中位数、四分位数间距（IQR）和2.5×IQR，十字表示j和k的平均值±SEM（另见图S2、S4和S5）。

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