Loss of Mature Lamin A/C Triggers a Shift in Intracellular Metabolic Homeostasis via AMPKα Activation

doi:10.3390/cells11243988

.2022年12月9日；11(24):3988.

doi:10.3390/cells11243988。

成熟层蛋白A/C的缺失通过AMPKα激活触发细胞内代谢平衡的改变

瀛洲¹, 杨佳杰¹, 袁诚², 葛宣峰¹, 杨荣辉¹, 袁媛^三, 李勇旺⁴, Miao Wang（苗王）⁵, 吕坤（Lu Kong）¹

附属公司

¹首都医科大学生物化学与分子生物学系，北京100069。
²首都医科大学生理学系，北京100069。
^三首都医科大学病理学系，北京100069。
⁴首都医科大学分子生物学中心实验室，北京100069。
⁵首都医科大学第二临床医学院北京友谊医院病理科，北京100050。

PMID： 36552752
预防性维修识别码：项目经理C9777081
内政部： 10.3390/单元11243988

成熟层蛋白A/C的缺失通过AMPKα激活触发细胞内代谢平衡的改变

瀛洲等。单元格. 2022.

.2022年12月9日；11(24):3988.

doi:10.3390/cells11243988。

作者

瀛洲¹, 杨家杰¹, 袁诚², 葛宣峰¹, 杨荣辉¹, 袁媛^三, 李勇旺⁴, Miao Wang（苗王）⁵, 陆空¹

附属公司

¹首都医科大学生物化学与分子生物学系，北京100069。
²首都医科大学生理学系，北京100069。
^三首都医科大学病理学系，北京100069。
⁴首都医科大学分子生物学中心实验室，北京100069。
⁵首都医科大学第二临床医学院北京友谊医院病理科，北京100050。

PMID： 36552752
预防性维修识别码：项目经理C9777081
内政部： 10.3390/单元11243988

摘要

层粘连蛋白A/C在脂肪细胞分化和骨骼肌脂质代谢中的作用与家族性部分性Dunnigan脂肪营养不良（FPLD）有关。我们确认了LMNA公司小鼠脂肪间充质干细胞（AD-MSCs）中的敲除（KD）阻止脂肪细胞成熟。重要的是，在体外实验中，我们发现丝氨酸22或392位点（pLamin a/C-S22/392）磷酸化层粘连蛋白a/C水平显著增加，同时一个肝细胞系（7701细胞）和两个肝癌细胞系（HepG2和MHCC97-H细胞）的脂质合成增加。此外，肝癌细胞在术后不能存活LMNA公司敲除（KO）或甚至KD。显然，肝组织和脂肪组织的层粘连蛋白A/C的功能不同。迄今为止，核层粘连蛋白A/C介导的肝细胞脂质代谢机制尚不清楚。我们的深入研究旨在确定层粘连蛋白A/C和pLamin A/C、肝脏脂质代谢和肝癌之间的分子联系。为了研究7701细胞的功能变化和相关的分子通路，进行了功能增强和功能丧失实验。当在层粘连蛋白A/C缺失或法尼基转移酶抑制剂（FTI）治疗后观察到功能层粘连A/C异常时，腺苷5'单磷酸活化蛋白激酶α（AMPKα）被激活。活性AMPKα直接磷酸化乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1），随后抑制脂质合成，但诱导肝癌细胞和正常细胞的糖酵解。根据质谱分析，层粘连蛋白A/C可能通过其伴侣蛋白、ATP酶或ADP/ATP转运体2调节AMPKα的活化。Lonafarnib（一种FTI）联合低血糖条件下通过抑制糖酵解或前层胺A的成熟，比单独使用Lonafarrib更有效地抑制两种肝癌细胞系的增殖。

关键词：AMPK；LMNA；肝细胞癌；脂质代谢。

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利益冲突声明

作者没有利益冲突需要声明。

数字

图1
pLamin A/C聚集在脂滴周围。通过连续八周喂饲动物高脂饮食，诱导SD大鼠肥胖。(A类)人脂肪和肝组织中层粘连蛋白A/C和pLamin A-S392的IHC染色代表性图像（20×）。红色箭头表示pLamin A/C集中在肝组织中的脂滴周围(n个= 3). (B类)典型的Western blot图像显示OBE大鼠脂肪和肝组织中FASN、ACC1、lamin A/C或pLamin A/C水平，相应的β-actin显示定量分析(n个= 5). 数据以平均值±SD表示*第页< 0.05.

图2
层蛋白A/C在肝细胞和脂肪细胞的代谢中具有不同的功能。(A类)进行油红O染色以显示原代培养的AD MSCs或分化刺激8天后或稳定培养的AD MSCs中的TG合成*LMNA公司*-通过CRISPR生成的KD细胞–Cas9(n个= 3). (B类)Western blot分析不同条件下层粘连蛋白A/C的表达。*LMNA公司*经Western blotting验证，从7701细胞中稳定删除。(C类)CCK-8测定显示*LMNA公司*-KD AD-MSC或*LMNA公司*-KO 7701细胞与干扰shRNA-表达或WT细胞的比较(n个= 8). (D类)在7701个细胞中定量TG和乳酸合成(n个= 4). (E类)脂肪酸从头合成中关键酶和蛋白质的表达水平*LMNA公司*-KO 7701细胞与相应的定量分析图一起显示(n个= 3). 数据显示为平均值±SD。纳秒,第页> 0.05, *第页< 0.05, **第页<0.01，以及***第页< 0.001.

图3
*LMNA公司*缺失通过AMPKα磷酸化抑制从头合成脂肪。(A类)AMPKα及其磷酸化形式的表达水平*LMNA公司*-KO 7701细胞与相应的定量分析图一起显示(n个= 3) (B类). (C类)CO-C IP分析用于评估7701细胞中pLamin-A和pAMPKα-T172之间或lamin-A/C和pAMPKα-T172之间的内源性相互作用。IgG作为阴性对照，输入用于检测pAMPKα-T172和层粘连蛋白a/C的水平(D类)在7701细胞系中进行了外源性反向下拉实验。7701细胞被瞬时转染*AMPK公司*α-FLAG质粒或控制载体48h。使用抗FLAG抗体免疫沉淀细胞裂解物。(E类)HEK293T细胞与含有*LMNA公司*cDNA和*AMPKα*-N、 -C和-F质粒或控制载体。用抗FLAG抗体免疫沉淀核裂解物。数据以平均值±SD表示。纳秒,第页>0.05时*第页< 0.05, **第页<0.01，以及***第页< 0.001.

图4
拉明A/C功能异常触发AMPKα激活。(A类)中的突变*LMNA公司*结构和序列显示：D203N位于杆状结构域，R482W、G465D和T528R位于LTD。Western blotting用于检测通过转染细胞膜修复层粘连蛋白A/C表达后，层粘连蛋白质A/C、层粘连蛋白酶A/C、AMPKα和pAMPKβ-T172水平的变化*LMNC公司*cDNA，*LMNA-GFP公司*cDNA和*LMNA公司*突变体，以及GAPDH归一化后获得的相应半定量数据。(B类)对不同转染组的TG和乳酸合成进行定量(n个= 3). (C类)采用Western blotting方法评估lonafarnib处理的7701、HepG2和MHCC97-H细胞中层粘连蛋白A/C、pLamin A/C、AMPKα、pAMPKβ、pACC1和ACC1水平的浓度依赖性变化。通过GAPDH标准化获得相应的定量数据。数据表示为至少三个独立实验±SD的平均值*第页< 0.05, **第页<0.01，以及***第页< 0.001.

图5
层粘连蛋白A/C不是pAMPKα的底物，ATP酶是层粘连蛋白质A/C的一个伴侣(A类)核内免疫沉淀剂与层粘连蛋白A/C相互作用的质谱分析。显示免疫沉淀剂分离片段的银染凝胶；红色三角形显示用于质谱分析的目标带。(B类)在线STRING分析使用质谱法鉴定的前30种蛋白质的GO术语。列出了前10个GO术语。(C类)左图：化合物C以浓度依赖的方式抑制AMPKα的激活。右图：当AMPK被A-769662激活时，7701、HepG2和MHCC97-H细胞中的层粘连蛋白A/C和pLamin A/C水平仍然降低。显示斑点的半定量值。

图6
pLamin A/C是脂质合成增加的指标。(A类)在7701、HepG2和MHCC97-h细胞中，25 mM葡萄糖处理12 h可促进层粘连蛋白A/C磷酸化和FASN表达。显示了印迹的半定量分析。(B类)TG合成被量化(n个= 3). (C类)在7701和HepG2细胞中，25 mM葡萄糖以时间依赖性方式增加了层蛋白A/C磷酸化。显示斑点的灰度值。(D类)在用25 mM葡萄糖处理的7701、HepG2或MHCC97-H细胞中，AMPKα激活受到抑制。显示斑点的半定量分析。(E类)图中显示了pLamin A与FASN或pAMPKα-T172之间的相关分析。数据显示为至少三个独立实验±SD的平均值*第页<0.05和**第页< 0.01.

图7
Lonafarnib联合二甲双胍显著抑制HepG2和MHCC97-H细胞的生长。(A类)左侧面板：*LMNA公司*根据TCGA数据库的数据，随着肝癌分级，表达逐渐增加(n个= 407). 右侧面板：高危患者的生存率*LMNA公司*水平明显低于低/中度患者*LMNA公司*水平。(B类)不同恶性程度HCC细胞株层粘连蛋白A/C水平及其灰度值(n个= 3). (C类)Western blotting显示，洛那非尼以浓度依赖的方式降低层粘连蛋白A/C和HMGCR的表达。(D类)采用CCK-8分析评估用4μM洛那非尼和250μM二甲双胍处理的癌细胞的生长(n个=6）。单独使用洛那非尼的剂量为16μM。进行了三个独立的实验。数据以平均值±SD表示*第页<0.05和***第页< 0.001.

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