SCON-a Short Conditional intrON for conditional knockout with one-step zygote injection

doi:10.1038/s12276-022-00891-0

.2022年12月；54（12）：2188-2199。

doi:10.1038/s12276-022-00891-0。 Epub 2022年12月9日。

SCON-一种用于一步注射合子的条件敲除的短条件内含子

附属机构

¹奥地利科学院分子生物技术研究所（IMBA），维也纳生物中心（VBC），Bohr-Gasse博士3，1030，奥地利维也纳。samwu202@gmail.com。
²维也纳生物中心博士项目，维也纳大学博士学院和维也纳医科大学，1030年，奥地利维也纳。samwu202@gmail.com。
^三奥地利科学院分子生物技术研究所（IMBA），维也纳生物中心（VBC），Bohr-Gasse博士3，1030，奥地利维也纳。
⁴韩国大田市裕兴区Expo-ro 55基础科学研究所基因组工程中心，邮编34126。
⁵维也纳生物中心博士项目，维也纳大学和维也纳医科大学博士院，1030，维也纳，奥地利。
⁶分子病理学研究所（IMP），维也纳生物中心（VBC），Campus-Vienna-BioCenter 1，1030，维也纳，奥地利。
⁷韩国布钦天主教大学医学和生物科学系，14662，韩国。
⁸转基因设施，莱顿，中央动物设施，莱顿大学医学中心，邮政巴士9600，2300 RC，荷兰莱顿。
⁹奥地利维也纳分子病理研究所IMP/IMBA转基因服务。
¹⁰奥地利科学院分子生物技术研究所（IMBA），维也纳生物中心（VBC），Bohr-Gasse博士3，1030，奥地利维也纳。koobk@ibs.re.kr。
¹¹韩国大田市裕兴区Expo-ro 55基础科学研究所基因组工程中心，邮编34126。koobk@ibs.re.kr。

^#贡献均等。

PMID： 36494589
预防性维修识别码：项目经理C9794761
内政部： 10.1038/s12276-022-00891-0

SCON-一种用于一步注射合子的条件敲除的短条件内含子

苏希恩·山姆·吴等。实验-分子-药物. 2022年12月.

.2022年12月；54（12）：2188-2199。

doi:10.1038/s12276-022-00891-0。 Epub 2022年12月9日。

附属机构

¹奥地利科学院分子生物技术研究所（IMBA），维也纳生物中心（VBC），Bohr-Gasse博士3，1030，奥地利维也纳。samwu202@gmail.com。
²维也纳生物中心博士项目，维也纳大学博士学院和维也纳医科大学，1030年，奥地利维也纳。samwu202@gmail.com。
^三奥地利科学院分子生物技术研究所（IMBA），维也纳生物中心（VBC），Bohr-Gasse博士3，1030，奥地利维也纳。
⁴韩国大田市裕兴区Expo-ro 55基础科学研究所基因组工程中心，邮编34126。
⁵维也纳生物中心博士项目，维也纳大学和维也纳医科大学博士院，1030，维也纳，奥地利。
⁶分子病理学研究所（IMP），维也纳生物中心（VBC），Campus-Vienna-BioCenter 1，1030，维也纳，奥地利。
⁷韩国布钦天主教大学医学和生物科学系，14662，韩国。
⁸转基因设施，莱顿，中央动物设施，莱顿大学医学中心，邮政巴士9600，2300 RC，荷兰莱顿。
⁹奥地利维也纳分子病理研究所IMP/IMBA转基因服务。
¹⁰奥地利科学院分子生物技术研究所（IMBA），维也纳生物中心（VBC），Bohr-Gasse博士3，1030，奥地利维也纳。koobk@ibs.re.kr。
¹¹韩国大田市裕兴区Expo-ro 55基础科学研究所基因组工程中心，邮编34126。koobk@ibs.re.kr。

^#贡献均等。

PMID： 36494589
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勘误表in

作者更正：SCON-一种短的条件内含子，用于通过一步受精卵注射进行条件敲除。
Wu SS、Lee H、Szép-Bakonyi R、Colozza G、Boese A、Gert KR、Hallay N、Lee JH、Kim J、Zhu Y、Linssen MM、Pilat-Carotta S、Hohenstein p、Theussl HC、Pauli A、Koo BK。 Wu SS等人。实验分子医学，2023年6月；55(6):1278-1280. doi:10.1038/s12276-023-01039-4。《实验分子医学》，2023年。 PMID：37340143 免费PMC文章。没有可用的摘要。

摘要

使用CRISPR技术产生条件等位基因仍然具有挑战性。在这里，我们引入了一种短条件内含子（SCON，189 bp），它能够通过一步受精卵注射快速产生条件等位基因。在这项研究中，两个不同的实验室共成功生成了13个SCON小鼠系。SCON在各种脊椎动物物种中具有条件内含子功能，其靶点插入与CRISPR/Cas9介导的基因标记一样简单。

PubMed免责声明

利益冲突声明

这里描述的SCON技术是S.W.和B.K.K.为发明者的专利申请的主题。

数字

**图1。SCON是一种新的cKO方法，在体外显示所需的内含子功能。**
一重组前后SCON序列。完整的SCON是189 bp长，序列注释如下：两端以绿色和深橙色突出显示的核苷酸分别代表剪接供体和剪接受体；以深黄色突出显示的核苷酸代表假定的分支点；带下划线的序列代表多嘧啶束；蓝色和红色的核苷酸代表由13个组成的loxP位点 bp识别位点和8个 bp垫片。在重组SCON形式中，为55 bp长，其余成分包括剪接供体、一个loxP、多嘧啶束和剪接受体；这三个编码框包含由一个方框和核苷酸上方的星号表示的终止密码子。b条在包括完整eGFP、eG SCON FP和重组eG SC FP的eGFP过表达构建体中的SCON功能测试的示意图。SD，剪接供体；BP，分支点；SA，拼接受体。**c（c）**转染HEK293T细胞第1天的图像，带有完整的eGFP、eG-SCON-FP和重组eG-SC-FP。所有构建物均与mCherry过表达质粒共转染。比例尺，1 毫米。d日,**e（电子）**转染HEK293T细胞的流式细胞术分析直方图显示eGFP（红色）和eG-SCON-FP（蓝色）之间的比较(d日)，在eGFP（红色）和eG-DECAI-FP（蓝色）之间(**e（电子）**)，以及各自的重组形式eG-SC-FP和eG-DE-FP（黄色）(d日,**e（电子）**).（f）用流式细胞术分析整合了转染Cre表达质粒（黄色）或空载体（蓝色）的piggyBac-eG-SCON-FP的小鼠ES细胞。

**图2。通过A拉伸突变分析SCON盒内的功能序列。**
一13个A延伸变异体的示意图，其中6–10个核苷酸转换为腺嘌呤，涵盖从SD到SA的所有序列，不包括LoxP位点。PPT，聚嘧啶束。b条单用mCherry、eGFP、eG-SCON-FP和13个A-streatch变异体转染的HEK293T细胞流式细胞术分析的测量标度值箱线图。红点表示平均值。灰色水平虚线表示eGFP的平均值。*表示统计显著性(第页=======================================================================0）与eGFP的平均强度值相比具有负的平均差值。**c（c）**流式细胞术分析转染变体A-1、A-11、A-12或A-13（蓝色）的HEK293T细胞与完整eGFP（红色）和空载体或mCherry单独（灰色）的比较。

**图3。SCON在各种脊椎动物中都是适用的和中性的。**
一–d日C6的流式细胞术分析(一)，LLC-MK2型(b条)，PK-15(**c（c）**)和Vero(d日)转染eGFP（红色）、eG-SCON-FP（蓝色）、eG-SC-FP（黄色）或空载体或mCherry单独（灰色）的细胞。**e（电子）**流式细胞术分析比较转染eG-DECAI-FP（灰色）或eG-SCON-FP（黄色）的不同细胞系中的GFP水平*第页<0.001，来自未配对t检验。**（f）**,克爪蟾以及注射eGFP、eG-SCON-FP或eG-SC-FP构建物的斑马鱼胚胎，24 注射后h。使用含有mCherry的质粒作为注射对照。比例尺，500 μm。

**图4。SCON小鼠可以通过一步胚胎注射产生，SCON在纯合子中可以耐受。**
一SCON成功靶向的等位基因列表以及使用的相应效率、基因型和重组位点。b条SCON瞄准ssODN的示意图，带有55和56 bp左右同源臂分别位于*Ctnb1号机组*基因。**c（c）**野生型、5′和3′等位基因的Sanger测序轨迹*Ctnb1号机组*和*Ctnb1号机组*^烤饼分别是。d日基因分型PCRCtnb1号机组^{斯科恩/斯科恩}（主页），*Ctnb1号机组*^+/烤饼（HET），以及*Ctnb1号机组*^+/+（WT），其中较低（403 bp）和上限（592 bp）条带分别对应于WT和敲入等位基因。**e（电子）**双杂合子杂交的基因型量化(*Ctnb1号机组*^+/烤饼). 后代总数，n个=======================================================================40（f）的示意图*Sox2系统*^烤饼等位基因。克基因分型PCRSox2系统^{斯科恩/斯科恩}（主页），*Sox2系统*^+/+（重量），以及*Sox2系统*^+/烤饼（HET），其中下部（206 bp）和更高（395 bp）条带分别对应于WT和敲入等位基因。小时杂合子杂交的基因分型量化(*Sox2系统*^+/烤饼). 后代总数，n个=======================================================================74

**图5。*Ctnb1号机组*^烤饼小鼠体内含有功能性条件等位基因。**
一WT中的小肠类有机物(*Ctnb1号机组*^+/+)和HOM(*维尔-克莱尔*^T2段*; Ctnb1号机组*^{斯科恩/斯科恩})用4-OH-三苯氧胺（4-OHT）或载体治疗小鼠8次 h.在第4天固定有机物，并对其进行β-连环蛋白（灰色）、卵磷脂（绿色）和DAPI（青色）染色。比例尺，100 微米。纯合子(*维尔-克莱尔*^T2段*; Ctnb1号机组*^{斯科恩/斯科恩})肠道健康，上皮隐窝绒毛形态正常(b条)细胞膜上的β-catenin(b条′）和Ki67标记隐窝中的增殖细胞(b条″). 杂合子(*维尔-克莱尔*^T2段*; Ctnb1号机组*^+/烤饼)肠道形态无变化(**c（c）**,**e（电子）**)，β-连环蛋白(**c（c）**′,**e（电子）**)或Ki67(**c（c）**″,**e（电子）**〃）三苯氧胺治疗后。在纯合子肠道中，三苯氧胺治疗会导致隐窝消失(d日)β-catenin染色(d日′）和Ki67染色(d日”）第3天。第5天，上皮细胞完全消失(**（f）**–**（f）**″). H&E、苏木精和曙红。比例尺，50 μm。克–j个小肠切片的smRNA-FISH与DAPI（蓝色），*奥尔夫姆4*（红色），和*重量3*（白色）。克,小时HET未诱导肠道切片(克)和HOM(小时)小鼠；我,j个诱导3天后每20毫克他莫昔芬 g HET体重(我)和HOM(j个)老鼠。比例尺，10 μm。

**图6。SCON插入位点数据库的建设方案。**
一从蛋白质编码转录物中选择目标外显子候选。b条单个外显子过滤器的基因覆盖率，如位置、大小和分裂外显子大小。**c（c）**SCON插入位点与CRISPR/Cas9靶位点的数据库摘要。

**图7。SCON小鼠1-2个杂交步骤的产生方案和特定靶基因的应用。**
一通过显微注射或电穿孔在单细胞期胚胎中产生SCON小鼠。胚胎要么（i）携带可诱导的CreER等位基因，要么（ii）为野生型。b条对F0创始小鼠进行SCON插入靶基因（基因X）的筛选。携带SCON插入物的小鼠相互交叉（i）或与携带CreER的小鼠交叉（ii）。**c（c）**由此产生的F1后代可能含有准备进行体内cKO研究的基因型（i）。d日携带X-SCON等位基因和CreER等位基因的F1后代相互杂交，获得F2代实验成熟cKO小鼠（ii）。**e（电子）**SCON插入单外显子基因的图示。**（f）**SCON插入到表达选择性剪接转录物的基因中的图示。SCON可以插入选择性剪接的外显子中，这将导致亚型1产生的蛋白质截短，而亚型2则完好无损。克SCON插入大外显子的图示（>1000 bp），这会导致各种大小的截断。

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使用人工内含子进行小鼠组织特异性敲除的证据指南。
McBeath E、Fujiwara K、Hofmann MC。 McBeath E等人。国际分子科学杂志。2023年6月17日；24(12):10258. doi:10.3390/ijms241210258。国际分子科学杂志。2023 PMID：37373404 免费PMC文章。审查。

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1. Pickar Oliver A，Gersbach CA。下一代CRISPR–Cas技术和应用。自然修订版分子细胞生物学。2019;20:490–507. doi:10.1038/s41580-019-0131-5。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Bouabe H，Okkenhaug K。小鼠基因靶向：综述。方法分子生物学。2013;1064:315–336. doi:10.1007/978-1-62703-601-6_23。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Gurumurthy CB等。CRISPR-Cas9方法在条件小鼠等位基因生成中的再现性：多中心评估。基因组生物学。2019;20:1–14. doi:10.1186/s13059-019-1776-2。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Economides AN等。通过反转产生条件等位基因是一种通用的方法。程序。国家。阿卡德。科学。2013年美国；110:E3179–E3188。doi:10.1073/pnas.1217812110。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Andersson-Rolf A等人。条件和可逆基因敲除的一步生成。自然方法。2017;14:287–289. doi:10.1038/nmeth.4156。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[1] Pickar Oliver A，Gersbach CA。下一代CRISPR–Cas技术和应用。自然修订版分子细胞生物学。2019;20:490–507. doi:10.1038/s41580-019-0131-5。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[2] Pickar Oliver A，Gersbach CA。下一代CRISPR–Cas技术和应用。自然修订版分子细胞生物学。2019;20:490–507. doi:10.1038/s41580-019-0131-5。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[3] Bouabe H，Okkenhaug K。小鼠基因靶向：综述。方法分子生物学。2013;1064:315–336. doi:10.1007/978-1-62703-601-6_23。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[4] Bouabe H，Okkenhaug K。小鼠基因靶向：综述。方法分子生物学。2013;1064:315–336. doi:10.1007/978-1-62703-601-6_23。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[5] Gurumurthy CB等。CRISPR-Cas9方法在条件小鼠等位基因生成中的再现性：多中心评估。基因组生物学。2019;20:1–14. doi:10.1186/s13059-019-1776-2。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[6] Gurumurthy CB等。CRISPR-Cas9方法在条件小鼠等位基因生成中的再现性：多中心评估。基因组生物学。2019;20:1–14. doi:10.1186/s13059-019-1776-2。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Economides AN等。通过反转产生条件等位基因是一种通用的方法。程序。国家。阿卡德。科学。2013年美国；110:E3179–E3188。doi:10.1073/pnas.1217812110。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Economides AN等。通过反转产生条件等位基因是一种通用的方法。程序。国家。阿卡德。科学。2013年美国；110:E3179–E3188。doi:10.1073/pnas.1217812110。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Andersson-Rolf A等人。条件和可逆基因敲除的一步生成。自然方法。2017;14:287–289. doi:10.1038/nmeth.4156。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Andersson-Rolf A等人。条件和可逆基因敲除的一步生成。自然方法。2017;14:287–289. doi:10.1038/nmeth.4156。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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