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.2022年11月29日；6（2）：e202201801。
doi:10.26508/lsa.202201801。 打印日期：2023年2月。

果蝇pVALIUM10 TRiP RNAi线路导致基于网关的转基因的非期望沉默

迪米特里耶·斯坦科维奇 1, 加博尔·索尔达斯 2, 米尔卡·乌利洛娃 三
附属机构

果蝇pVALIUM10 TRiP RNAi线路导致基于网关的转基因的非期望沉默

迪米特里耶·斯坦科维奇等。 生命科学联盟. .

摘要

使用双链RNA的转录后基因沉默技术彻底改变了功能遗传学领域，使各种生物的基因功能快速而容易地被破坏。在果蝇，许多转基因RNAi株已在大规模工作中产生，包括果蝇转基因RNAi项目（TRiP），促进体内几乎所有果蝇具有时空分辨率的基因。可用的转基因RNAi系代表了苍蝇群落的基本资源，为解决与基础和生物医学研究领域相关的广泛生物学问题提供了前所未有的机会。然而，应注意RNAi方法的效率和特异性。在这里，我们证明了基于pVALIUM10的RNAi株（占总TRiP收集量的约13%）（13410株基于pVARIUM TRiP的RNAi株中的1808株）会导致从Gateway目的载体表达的转基因的非目标沉默。沉默是通过靶向通过位点特异性重组产生并包含在转录mRNA中的attB1和attB2序列介导的。从Gateway表达载体中删除这些attB位点可防止沉默并恢复预期的转基因表达。

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利益冲突声明

提交人声明他们没有利益冲突。

数字

图1。
图1.pVALIUM10和KK RNAi线路可有效沉默。
（A、B、C）pVALIUM10的表达BuGZ公司RNAi[行程JF02830]（B，B’）和基于KKBuGZ公司RNAi[KK104498]使用球蛋白Gal4,UAS-myr-mRFP驾驶员(nub>mRFP，淡蓝色）导致BuGZ显著减少FlyFos[v318366]翼盘（WDs）囊区相对于铰链和凹槽的转基因蛋白质，并控制WD（A，A'）。显微照片显示了从7日龄AEL三龄幼虫分离的WDs的多个共焦切片的投影。多岩坑-标记为BuGZFlyFos[v318366]用抗GFP抗体（白色）免疫染色观察蛋白质。用DAPI（洋红色）对细胞核进行复染。比例尺：100µ米。（D）用于克隆和过度表达dsRNA的各种载体的示意图。在缺乏靶向特异性抗体的情况下，可以在内源性调控序列的控制下，借助表达多孔标记蛋白的FlyFos转基因来评估RNAi功效。
图2。
图2基于pVALIUM10的株系导致RNase H1:：GFP转基因报告子的非靶向沉默。
（A）转基因的示意图pUWG-R酶H1表达多泛素C末端GFP标记的RNase H1:：GFP蛋白的报告构建(乌比)启动程序。这个核糖核酸酶H1编码序列的两侧是通过LR克隆酶催化的网关介导的重组产生的attB1和attB2位点。（B、C、D、E、F、G）GFP特异性抗体的免疫染色显示，nubbin域（mRFP，浅蓝色）中RNase H1:：GFP水平显著降低，其中pVALIUM10基于BuGZ公司RNAi[行程JF02830]（C） 和myc公司RNAi[TRiP.JF01761]（E） RNAi系使用球蛋白Gal4,UAS-myr-mRFP驾驶员(nub>mRFP). 在对照WD（B）和KK-based表达后，未观察到RNase H1:：GFP信号的下调BuGZ公司RNAi[KK104498]（D） ，基于pVALIUM20myc公司RNAi[TRiP.HMS01538]（F） ，或基于GDmyc公司RNAi[GD2948]（G） ●●●●。显微照片显示了从7日龄AEL三龄幼虫分离的WDs的多个共焦切片的投影。用DAPI（洋红色）对细胞核进行复染。比例尺：100µ米。（H）RNase H1:：GFP信号的定量描述为眼袋和凹口区域之间的相对强度比。采用Tukey多重比较检验，通过单因素方差分析确定统计显著性；n≥3**P（P）< 0.01, ****P（P）<0.0001，不适用，无显著性。（I）pVALIUM10 RNAi株的产生依赖于LR克隆酶介导的dsRNA片段从进入载体到pVALIUM10目的载体的重组（Ni等人，2009年）。由pVALIUM10 dsRNA表达载体产生的dsRNA发夹是siRNA物种的来源，siRNA物种不仅针对感兴趣的转录物（目标ORF），还针对通过相同重组机制产生的任何网关表达载体中的attB1和attB2位点。此图的源数据可用。
图3。
图3.pVALIUM10 RNAi系通过attB1和attB2位点沉默Gateway转基因。
（A）转基因示意图pUWG-m樱桃色和突变型pUWG公司ΔattB-m樱桃色报告构建。mCherry由多泛素表达(联合国大学)启动程序。（B、C） ubi-m樱桃和突变型联合国大学ΔattB-m樱桃色记者在翅膀的影像盘上显示出类似的表达模式。（D、E、F、G、H、I、J、K、L、M） ubi-m樱桃被pVALIUM10有效下调BuGZ公司RNAi[行程JF02830]和myc公司RNAi[TRiP.JF01761]在球蛋白Gal4驾驶员(节点>)相对于WD的其余部分（D、H、I、M）。（东、西、中、日）相反，attB1和attB2序列的缺失使得联合国大学ΔattB-m樱桃色报告者对pVALIUM10 RNAi介导的沉默具有耐药性（E，H，J，M）。（F、G、H、K、L、M）都不是基于KK(BuGZ公司RNA干扰[KK104498])也不基于pVALIUM20(myc公司RNAi[TRiP.HMS01538])RNAi株系影响未修饰或突变报告基因结构（F、G、H、K、L、M）表达的mCherry水平。显微照片显示了用抗mRFP抗体（白色）免疫染色的第7天AEL三龄幼虫分离的WDs的多个共焦切片的投影。用DAPI（洋红色）对细胞核进行复染。比例尺：100µ米。（小时，米）mCherry信号的量化描述为眼袋和眼窝区域（H，M）之间的相对强度比。每组中的上标文字表示使用的RNAi类型。采用Tukey多重比较检验，通过单因素方差分析确定统计显著性；n≥3**P（P）< 0.01, ****P（P）<0.0001，不适用，无显著性。（N、O、P、Q）pVALIUM10的表达BuGZ公司RNAi[行程JF02830]（O） 在翼袋中使用球蛋白Gal4,无人机-mRFP驾驶员(nub>mRFP)与对照组（N）和基于KK的SmD3:：3xHA水平相比降低BuGZ公司RNAi[KK104498]（P） ●●●●。注意SmD3的病灶：对照组中的3xHA蛋白（N“）和BuGZ公司RNAi[KK104498]不存在于BuGZ公司RNAi[行程JF02830]-表达细胞（O”）。显微照片显示了用抗-HA抗体（白色，N'，O'，P'；红色，N“，O”，P“）免疫染色的第7天AEL三龄幼虫分离的WDs的多个或单个共焦切片的投影。用DAPI（洋红色）对细胞核进行复染。比例尺：100或5μm（N“，O”，P“）。（问）眼袋区SmD3:：3xHA信号强度（Q，左）和SmD3::：3xHA-阳性点刺（Q，右）的定量。分别采用Tukey多重比较检验和Kruskal–Wallis检验进行单因素方差分析，确定统计学显著性；n≥6**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，无显著性差异。此图的源数据可用。
图S1。
图S1..pVALIUM10 RNAi线通过attB1和attB2位点沉默Gateway转基因。
（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P）重量ubi-m樱桃但不是联合国大学ΔattB-m樱桃色缺乏attB1和attB2序列的报告者通过靶向pVALIUM10 RNAi株在眼袋区域有效下调附件3（A、B）、，yki公司，（C，D），行动β（E，F），ftz-f1型（G，H），DH44型（I，J），嘴唇4（K，L），杂志（M，N），和小子（O，P）转录本在球蛋白Gal4驾驶员(结节>)相对于WD的其余部分。显微照片显示了用抗mRFP抗体（白色）免疫染色的第7天AEL三龄幼虫分离的WDs的多个共焦切片的投影。用DAPI（洋红色）对细胞核进行复染。交叉保持在29°C。比例尺：100µ米。
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