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.2023年3月；48(3):996-1008.
doi:10.1007/s11064-022-03833-4。 Epub 2022年11月27日。

GPR137抑制神经2a细胞增殖并促进神经分化

岩田贤介 1, 山崎安祖 1, 山本信治 1, 奇卡拉·哈鲁塔 1, Kei Maruyama先生 1, 吉川庆介 2
附属公司

GPR137抑制神经2a细胞增殖并促进神经分化

岩萨健辅等。 神经化学研究. 2023年3月.

摘要

孤儿受体G蛋白偶联受体137（GPR137）是一种与多种癌症相关的膜蛋白。GPR137广泛表达，包括在中枢神经系统（CNS）中。我们建立了GPR137敲除（KO）neuro2A细胞系来分析GPR137在神经元细胞中的功能。KO细胞由基因组编辑产生，使用簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9，并通过有限稀释培养为单个细胞。然后构建救援细胞，使用带有EF1-alpha启动子的表达载体在GPR137 KO神经2A细胞中重新表达GPR137。GPR137 KO细胞增加了细胞增殖，减少了神经突起的生长（即，较低水平的神经元分化）。此外，GPR137 KO细胞的细胞周期调节因子cyclin D1表达增加，神经元分化标志物NeuroD1表达减少。此外，GPR137 KO细胞的突起生长标记物STAT3和GAP43的表达水平较低。这些表型在救援细胞中都被消除了。总之，GPR137缺失增加了细胞增殖，降低了神经元分化，表明GPR137促进了神经2A细胞的细胞周期退出和神经元分化。GPR137对神经元分化的调节对于大脑发育过程中构建神经元结构至关重要。

关键词：CRISPR/Cas9；细胞周期退出；GPR137；神经2A；神经分化。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者没有相关的财务或非财务利益需要披露。

数字

图1
图1
137加仑利用CRISPR/Cas9系统建立KO神经2A细胞。A类对应于137加仑用相应的引物（用蓝色箭头表示）和PAM序列对KO细胞进行直接测序。B类WT和CRISPR/Cas9介导的氨基酸序列137加仑基因组编辑。在KO1和KO2中观察到的移码突变和过早终止。C类RT-PCR的凝胶电泳分析137加仑.D类WT、KO1、KO1 R、KO2和KO2 R组GPR137蛋白的Western blot分析
图2
图2
WT的细胞生长，137加仑KO神经2A（KO）细胞，以及137加仑KO神经2A+137加仑转染（KO R）细胞的含血清培养基。A类WT和KO细胞的细胞生长。B类WT、KO1和KO1 R细胞的细胞生长。C类WT、KO2和KO2 R细胞的细胞生长。数据为平均值±SEM，n个 = 每组5个。使用双向方差分析和事后Tukey检验进行统计分析（***，###第页 < 0.001).D类蛋白质表达水平通过western blot分析测定。PHH3的蛋白质水平(E类)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(F类). 数据为平均值±SEM，每组n=5。采用单因素方差分析和事后纽曼-凯尔斯检验进行统计分析(*第页 < 0.05; **第页 < 0.01)
图3
图3
WT的细胞分化率，137加仑KO神经2A（KO）细胞，以及GPR137型KO神经2A+137加仑转染（KO R）细胞在血清剥夺诱导的神经突起生长后进行评估。A类分化细胞的显微照片。黑色箭头表示分化明显的细胞。B类WT、KO和KO R细胞的Neurite长度。C类WT、KO和KO R细胞的分化率。数据为平均值±SEM，每组n=5。采用单因素方差分析和事后纽曼-凯尔斯检验进行统计分析(*第页 < 0.05; ***第页 < 0.001)
图4
图4
WT的细胞分化率，137加仑KO神经2A（KO）细胞，以及137加仑KO神经2A+137加仑转染（KO R）细胞通过在维甲酸存在下血清剥夺诱导的神经突起生长进行评估。A类无血清和无血清RA诱导分化细胞的显微照片。B类RA患者无血清和无血清的神经细胞长度。C类RA患者无血清和无血清细胞分化率。数据以平均值±SEM表示，每组n=5。使用学生的t检验进行统计分析(*第页 < 0.05; **第页 < 0.01).D类血清、无血清和无血清RA患者的GPR137蛋白水平。E类分化细胞的光镜照片。黑色箭头表示分化明显的细胞。F类WT、KO和KO R细胞的Neurite长度。G公司WT、KO和KO R细胞的分化率。数据为平均值±SEM，每组n=5。采用单向方差分析和事后纽曼-凯尔斯检验进行统计分析(*第页 < 0.05; **第页 < 0.01）
图5
图5
神经元分化相关分子在WT中的表达，137加仑KO神经2A（KO）细胞，以及137加仑KO神经2A+137加仑转染（KO R）细胞。A类蛋白质表达水平通过western blot分析确定。细胞周期蛋白D1的蛋白质水平(B类)，PROX1(C类)，神经D1(D类)，p-STAT3/STAT3(E类)、GAP43(F类). 细胞周期蛋白D1的mRNA表达(G公司)，PROX1(H（H）)，神经D1(我)，状态3(J型)，间隙43(K（K）). 数据为平均值±SEM，每组n=5。采用单向方差分析和事后纽曼-凯尔斯检验进行统计分析(*第页 < 0.05; **第页 < 0.01)
图6
图6
WT的细胞内信号，137加仑KO神经2A（KO）细胞，以及137加仑KO神经2A+GPR137型转染（KO R）细胞。A类蛋白质表达水平通过western blot分析确定。p-CREB/CREB(B类)，p-AKT/AKT(C类)，和p-ERK/ERK(D类). 数据为平均值±SEM，每组n=5。采用单向方差分析和事后纽曼-凯尔斯检验进行统计分析(*第页 < 0.05; ***第页 < 0.001)
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