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.2023年1月；51(1):2.
doi:10.3892/ijmm.2022.5205。 Epub 2022年11月16日。

层粘连蛋白α1作为通过调节纤维化机制治疗硬膜外纤维化的靶点

刘鹏然 # 1, Dan Zhang（丹·张） # 2, 黄桂雄 # 1, Mingdi薛 1, 应方 1, 林璐 1, 张嘉耀 1, 毛燮 1, 叶哲伟 1
附属机构

层粘连蛋白α1作为通过调节纤维化机制治疗硬膜外纤维化的靶点

刘鹏然等。 国际分子医学杂志. 2023年1月.

摘要

腰椎椎板切除术区成纤维细胞过度增殖和迁移可导致硬膜外纤维化，最终导致背部手术失败综合征。据报道，层粘连蛋白α1是细胞外基质中一种重要的生物功能性糖蛋白，参与多种纤维化相关疾病，如肺、肝和瘢痕疙瘩纤维化。然而，层粘连蛋白α1在硬膜外纤维化中的潜在机制尚不清楚。本研究旨在探讨层粘连蛋白α1在成纤维细胞增殖、凋亡和迁移以及硬膜外纤维化中的作用和机制。在建立椎板切除术模型后，分别用苏木精和伊红、Masson三色法和免疫组织化学染色测定硬膜外纤维化程度、成纤维细胞数量、胶原蛋白含量和硬膜外层粘连蛋白α1的表达水平。此外，使用稳定的小干扰RNA系统敲低成纤维细胞层粘连蛋白α1的表达。通过反转录定量PCR和免疫荧光染色证实了转染效率。采用Western blot分析、划痕试验、EdU掺入试验、流式细胞仪分析和细胞计数试剂盒8试验评估成纤维细胞的增殖、凋亡、迁移和活性，以及雷帕霉素（mTOR）信号相关蛋白AKT/机制靶点的表达水平。体内实验表明，层粘连蛋白α1与硬膜外纤维化呈正相关，且呈时间依赖性。此外，层粘连蛋白α1敲除可减弱细胞增殖、活力和迁移，并促进细胞凋亡。此外，结果显示AKT/mTOR信号通路的激活参与了上述过程。总的来说，目前的研究表明了层粘连蛋白α1与硬膜外纤维化之间的积极联系，并验证了层粘着蛋白α1对成纤维细胞增殖、凋亡和迁移的影响。此外，结果表明AKT/mTOR信号通路可能在调节层粘连蛋白α1‑诱导的成纤维细胞的行为中发挥重要作用。

关键词：AKT/mTOR信号通路；硬膜外纤维化；成纤维细胞；椎板切除术；层粘连蛋白α1。

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数字

图1
图1
术后硬膜外纤维化在椎板切除术区呈时间依赖性增加。（A） H&E染色显示，与对照组相比，三个手术组的硬膜外纤维化（红色矩形）过度，硬膜外粘连较厚；这与时间有关。放大倍数，×40。（B） H&E染色显示，与对照组相比，三个手术组的硬膜外成纤维细胞（红色箭头）均呈时间依赖性增加。淋巴细胞显示为绿色箭头。放大倍数，×200。（C和D）根据Masson三色染色测定，与对照组相比，三个手术组的硬膜外胶原（红色矩形）合成呈时间依赖性。放大倍数，（C）×40和（D）×200。（E） （B）中H&E染色的半定量；显示各组成纤维细胞的数量。（F） （D）中Masson三色染色的半定量；各组硬膜外胶原蛋白含量以平均OD值表示。数据显示为平均值±标准偏差。*P<0.05。H&E、苏木精和伊红；外径，光密度。
图2
图2
层粘连蛋白α1的表达在椎板切除术后呈阳性和时间依赖性增加。（A） 硬膜外纤维化组织层粘连蛋白α1的免疫组织化学染色显示，层粘连素α1的表达呈时间依赖性增加。结果显示为平均OD值。放大倍数，×200。（B） 硬膜外纤维化组织中α-SMA的免疫组织化学染色；三组间无显著差异。结果显示为平均OD值。放大倍数，×200。数据表示为平均值±标准偏差。*P<0.05。α-SMA、α平滑肌肌动蛋白；IHC、免疫组织化学；NS，不显著；外径，光密度。
图3
图3
通过免疫荧光染色和RT-qPCR测定层粘连蛋白α1 siRNA的转染效率。（A） 免疫荧光染色法检测三组间层粘连蛋白α1的表达水平；siRNA组的荧光密度显著降低。对照组和阴性对照组之间无统计学意义。放大倍数，×200。（B） RT-qPCR结果；siRNA组层粘连蛋白α1的mRNA表达水平下调。以GAPDH为对照。数据表示为平均值±标准偏差。*P<0.05。NS，不显著；小干扰RNA；RT-qPCR，逆转录定量PCR。
图4
图4
层粘连蛋白α1调节成纤维细胞的增殖、凋亡和迁移，并影响其生存能力。（A） 用EdU掺入法检测成纤维细胞增殖。层粘连蛋白α1被敲除后，增殖率降低。放大倍数，×200。（B） western blotting检测各组PCNA、cyclin D1、Bax、Bcl-2、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平。（C） Annexin V-FITC/PI双标记检测成纤维细胞凋亡，并给出凋亡率。（D） 使用细胞计数试剂盒-8检测成纤维细胞活性。（E） 成纤维细胞迁移通过划痕试验检测（放大倍数，×40）。数据表示为平均值±标准偏差。*P<0.05。基质金属蛋白酶；NS，不显著；增殖细胞核抗原；小干扰RNA。
图5
图5
层粘连蛋白α1干扰AKT/mTOR信号通路的激活。western blotting检测各组p-AKT、AKT、mTOR和p-mTOR蛋白表达水平。数据表示为平均值±标准偏差。*P<0.05。mTOR，雷帕霉素的机械靶点；NS，不显著；p-，磷酸化；小干扰RNA。
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赠款和资金

本研究由国家自然科学基金（批准号：81974355和82172524）和武汉市卫生健康委员会科研项目（批准号：WX20Q16）资助。