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.2022年11月8:38:141-155。
doi:10.1016/j.jot.2022.10.004。 eCollection 2023年1月。

诱导的多能干细胞源性细胞外囊泡对在体外和体内骨关节炎模型

余焕学 1 2, 瓦拉德耶·佛科赛 2, Phung Ngan Le村 2, 容义图 三, 黄显昌 2, 淮恩路 4 5, 陈文良 6, 袁坤图 2
附属公司

诱导的多能干细胞源性细胞外囊泡对在体外和体内骨关节炎模型

余焕学等人。 J正交变换. .

摘要

背景/目标：骨关节炎（OA）是一种与软骨细胞退化和炎症相关的多因素关节疾病。OA的治疗仅旨在减轻疼痛和改善关节功能。最近，干细胞分泌的细胞外囊泡（EV）已成为包括OA在内的几种退行性疾病的细胞再生工具。我们假设诱导多能干细胞（iPSC）衍生的EV有利于软骨细胞再生和OA治疗。因此，我们旨在研究iPSC-EV对白细胞介素1β（IL-1β）诱导的软骨细胞行为的影响在体外OA模型和前交叉韧带横断（ACLT）诱导体内兔关节软骨OA模型。

方法：通过连续超速离心从48小时培养的iPSC条件培养基中分离iPSC-EV。通过透射电镜、western blot分析和动态光散射对分离的iPSC-EV进行表征。分析了iPSC-EV对人原代软骨细胞活力和细胞衰老的影响。长期与低剂量过氧化氢孵育可诱导细胞过早衰老。探讨iPSC-EV对OA软骨细胞的治疗作用在体外IL-1β诱导软骨细胞损伤。从THP-1单核细胞激活炎症巨噬细胞，观察iPSC-EV对巨噬细胞极化的影响。通过ELISA和western blot分析评估暴露于iPSC-EV的巨噬细胞的表型。将原代软骨细胞与不同表型的巨噬细胞共同培养，观察软骨细胞中II型胶原和分解代谢酶的表达。用ACLT诱导的OA模型将iPSC-EV关节内注射到兔子体内。通过肉眼和组织病理学研究评估病变进展。

结果：我们发现，iPSC EVs通过调节p21和II型胶原的表达，显著刺激原代人类软骨细胞的增殖，并抑制细胞衰老。iPSC-EV降低基质降解酶和IL-6的表达，并减弱IL-1β介导的软骨细胞死亡。此外，iPSC-EV调节巨噬细胞极化，从而在炎症微环境中拯救受损的软骨细胞。在兔ACLT模型中，iPSC-EV改善了OA样病变，包括炎症、软骨下骨突出和关节软骨破坏。组织病理学研究一致显示，iPSC_EV减弱了ACLT介导的MMP13和ADAMTS5的改变以及II型胶原的表达。

结论：iPSC-EV通过促进细胞增殖、抑制过早衰老、维持II型胶原合成和基质降解酶（如基质金属蛋白酶（MMPs）和ADAMTS5）的体内平衡来保护软骨细胞。iPSC-EV还能减少IL-1β介导的软骨细胞损伤中的细胞死亡。在兔ACLT诱导的OA模型中，iPSC-EV注射减少了软骨破坏，如胶原II的上调和MMP13和ADAMTS5的下调所示。总的来说，我们的结果表明iPSC-EV具有治疗潜力，可以用作OA治疗方案。

本文的翻译潜力：这项研究强调了iPSC-EV作为软骨细胞再生和OA治疗的治疗选择的潜力。

关键词：胞外小泡；炎症；巨噬细胞；骨关节炎。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者没有与本文相关的利益冲突。

数字

图1
图1
iPSC衍生电动汽车特征。A.TEM图像显示iPSC-EV的杯状颗粒。，比例尺=100 nm。B.显示EV表面标记（TSG101、CD63、CD9和CD81）的代表性western blot图像。C.用DLS法测量iPSC-EV的粒度分布。D.在荧光显微镜下观察iPSC-EV在原代人软骨细胞中的内化。iPSC-EV被标记为DiI（红色）。分别用钙蛋白（绿色）和DAPI（蓝色）染色细胞体和软骨细胞核。比例尺=200μm。（为了解释这个图例中对颜色的引用，读者可以参考本文的网络版。）缩写：EVs：胞外小泡；DLS：动态光散射；iPSC：诱导多能干细胞；iPSC-EV：诱导的多能干细胞衍生细胞外囊泡
图2
图2
iPSC-EV增强人原代软骨细胞的增殖和抑制衰老。A.正常和补充iPSC-EV条件下软骨细胞培养的相控图像。比例尺500μm。B.图表显示使用CCK8分析评估软骨细胞增殖（n=4）C。H的示意方案2哦2-诱导软骨细胞衰老。D.软骨细胞的SA-β-半乳糖苷酶染色。比例尺=100μm。每张图片右下角的一个小方框显示阳性染色细胞的扩张。比例尺=20μm。黑色箭头表示不规则单元格。E.SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞的定量（n=5）F。典型的western blot图像显示了不同处理的软骨细胞中衰老标记物p21和II型胶原的表达水平。G.，H.p21和II型胶原的密度测定（n=3）*与对照组的显著差异：*p<0.05；**p<0.01。#各组之间的显著差异：#p<0.05。缩写：iPSC-EV：诱导多能干细胞衍生的细胞外囊泡；CCK-8：细胞计数试剂盒-8；H2O2：过氧化氢；SA-β-半乳糖苷酶：衰老相关-β-乳糖苷酶
图3
图3
iPSC EV减轻了IL-1β诱导的软骨细胞炎症和细胞死亡。A.具有代表性的western blot图像，显示了用IL-1β和iPSC-EV刺激的软骨细胞中MMP13、IL-6、ADAMTS5和II型胶原的表达水平。B.-E。western blot分析中蛋白质水平的量化（n=3） F.软骨细胞与IL-1β孵育24小时后，使用荧光显微镜观察活细胞和死细胞标记。比例尺=200μm。G.活细胞和死细胞分析中凋亡软骨细胞百分比的量化（n=4）*与对照组的显著差异：*p<0.05，**p<0.01，**p<0.005#组间显著差异：##p<0.01。缩写：iPSC-EV：诱导多能干细胞衍生的细胞外囊泡；IL-1β：白细胞介素-1β；MMP13：基质金属肽酶13；IL-6：白细胞介素6；ADAMTS5：一种具有血小板反应蛋白基序5的去整合素和金属蛋白酶。
图4
图4
iPSC-EV调节巨噬细胞极化和细胞因子分泌。A.显示M2标记（CD206）和M1标记（iNOS和TNF-α）在M0、M0中表达的典型western blot图像电动汽车+、M1和M1电动汽车+.B.-D.根据western blot结果定量蛋白质丰度（n=3）E-G.不同条件下巨噬细胞分泌细胞因子的ELISA分析（n=3）*与对照组的显著差异：**p<0.01#组间显著差异：#p<0.05，##p<0.01）。缩写：PSC-EV：诱导多能干细胞衍生的细胞外囊泡；IFN-γ：干扰素γ；iNOS：诱导型一氧化氮合酶；TNF-α：肿瘤坏死因子α
图5
图5
iPSC-EV处理巨噬细胞的微环境对软骨细胞的影响。A.典型的western blot图像，显示用巨噬细胞CM处理的软骨细胞表达的蛋白质。B.-D.western blot分析的密度测定（n=3）E.与不同巨噬细胞共同培养的软骨细胞中II型胶原（红色）和MMP13（绿色）的免疫荧光双重染色。比例尺=100μm。F.，G.胶原蛋白II和MMP13荧光信号强度的量化。H.软骨细胞CM在不同巨噬细胞CM中孵育后的MMP阵列分析。I.-K.根据MMP阵列分析得出的MMP3、MMP-10和TIMP-1的相对分泌水平。*与对照组的显著差异：*p<0.05，*p<0.01，*p<0.005，*p<0.001#组间显著差异：#p<0.05，##p<0.01。（关于本图例中颜色参考的解释，读者可参考本文的网络版。）缩写：iPSC EV：诱导多能干细胞胞外小泡；MMP：基质金属肽酶；金属蛋白酶组织抑制剂
图6
图6
兔前交叉韧带横断和iPSC-EV注射后关节软骨的大体损伤和组织病理学研究。A.接受ACLT的兔子的大体损伤显示关节软骨破坏，包括表面侵蚀和突起（红色箭头）。B.血红素-伊红（20x）、C.甲苯胺蓝（10x）和D.藏红-O（4x）染色显示兔软骨的病理结构。黑色宽箭头表示严重损坏的区域。黑色椭圆表示超细胞簇。窄白色箭头表示软骨下骨硬化。窄的黑色箭头表示软骨下囊肿带有纤维组织（B.标尺=100μm，C.和D.标尺=500μm）E.每组滑膜（40X物镜，标尺=50μm）F.样本的OARSI评分（对照n=9，iPSC-EV n=3，ACLT n=3、ACLT+​iPSC-EV n=3）*与对照组的显著差异p<0.001#组间差异显著####p<0.001。（为了解释此图例中的颜色参考，读者可以参考本文的Web版本。）缩写：ACLT：前交叉韧带横断；PSC-EV：诱导的多能干细胞衍生细胞外囊泡
图7
图7
免疫组织化学研究显示，不同处理的兔关节软骨组织中II型胶原、MMP13、ADAMTS5和TNF-α的蛋白表达不同。白色箭头表示阳性细胞。比例尺=50μm。
图1
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图2
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