Discovery of RUF6 ncRNA-interacting proteins involved in P. falciparum immune evasion

doi:10.26508/lsa.202201577

.2022年11月15日；6（1）：e202201577。

doi:10.26508/lsa.202201577。打印日期：2023年1月。

RUF6 ncRNA相互作用蛋白的发现恶性疟原虫免疫逃避

格雷琴·M·迪芬达尔^1 2, 安娜·巴康斯·西蒙^1 2 三, 塞巴斯蒂安·鲍姆加滕⁴, 佛罗伦特·丁丽⁵, Damarys腰部⁵, 阿图尔·谢尔夫⁶

附属公司

¹巴黎城市大学巴斯德研究所，寄主-寄生虫相互作用生物学单元，INSERM U1201，CNRS EMR9195，法国巴黎。
²法国巴黎索邦大学博士学位复合体ED515。
^三德国慕尼黑路德维希·马克西米利安大学医学院生理化学部生物医学中心。
⁴法国巴黎巴斯德研究所疟原虫RNA生物学。
⁵居里研究所，巴黎理工大学PSL研究中心，居里科技质谱蛋白质组学，法国巴黎。
⁶巴黎城市大学，巴斯德研究所，宿主-寄生虫相互作用生物学单位，INSERM U1201，CNRS EMR9195，法国巴黎artur.scherf@pastur.fr。

PMID： 36379669
预防性维修识别码： PMC9670795型
内政部： 10.26508/lsa.202201577

RUF6 ncRNA相互作用蛋白的发现恶性疟原虫免疫逃避

格雷琴·M·迪芬达尔等。生命科学联盟. 2022.

.2022年11月15日；6（1）：e202201577。

doi:10.26508/lsa.202201577。打印日期：2023年1月。

作者

格雷琴·M·迪芬达尔^1 2, 安娜·巴康斯·西蒙^1 2 三, 塞巴斯蒂安·鲍姆加滕⁴, 佛罗伦特·丁丽⁵, Damarys腰部⁵, 阿图尔·谢尔夫⁶

附属公司

¹巴黎城市大学巴斯德研究所，寄主-寄生虫相互作用生物学单元，INSERM U1201，CNRS EMR9195，法国巴黎。
²法国巴黎索邦大学博士学位复合体ED515。
^三德国慕尼黑路德维希·马克西米利安大学医学院生理化学部生物医学中心。
⁴法国巴黎巴斯德研究所疟原虫RNA生物学。
⁵居里研究所，巴黎理工大学PSL研究中心，居里科技质谱蛋白质组学，法国巴黎。
⁶巴黎城市大学巴斯德研究所，寄主-寄生虫相互作用生物学单元，INSERM U1201，CNRS EMR9195，法国巴黎artur.scherf@pastur.fr。

PMID： 36379669
预防性维修识别码： PMC9670795型
内政部： 10.26508/ls.202201577

摘要

非编码RNA（ncRNAs）是免疫逃避和传播恶性疟原虫RUF6是一个由RNA聚合酶III转录的ncRNA基因家族，但积极调节Pol II转录的无功功率，无功功率毒力基因家族。目前尚不清楚RUF6 ncRNA如何与下游效应器连接。我们开发了一种RNA-directed proteomic discovery（ChIRP-MS）协议，以确定体内RUF6 ncRNA-protein相互作用。用生物素化反义寡核苷酸纯化RUF6 ncRNA相互作用组。定量无标签质谱鉴定了几种与基因转录相关的独特蛋白质，包括RNA Pol II亚基、核小体组装蛋白和DEAD盒解旋酶5（DDX5）的同源物。对最初由RUF6-ChIRP协议发现的Pf-DDX5鉴定蛋白进行亲和纯化，验证了该技术对鉴定非编码RNA相互作用体的稳健性恶性疟原虫核Pf-DDX5的诱导位移导致活性无功功率，无功功率基因。我们的工作确定了RUF6 ncRNA-protein复合物，该复合物与RNA Pol II相互作用以维持无功功率，无功功率基因表达，包括一种解旋酶，该解旋酶可分解G-四链体二级结构无功功率，无功功率促进转录激活和进展的基因。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明他们没有利益冲突。

数字

图1。 — **图1.开发ChIRP-MS以识别RUF6 ncRNA结合蛋白。**
**（A）**RUF6 ncRNA与活性蛋白相关的假设模型示意图*va公司*r基因启动子。**（B）**使用生物素化RUF6 ncRNA探针（Pf3D7_1241000）进行的电泳迁移率变化分析在核提取物存在的情况下给出了特定的变化，而核提取物与使用过量（200×）的未标记探针竞争。**（C）**ChIRP-MS协议概述。RNP复合物在加入生物素化反义寡核苷酸之前在体内交联。用珠子提取目标ncRNAs，并通过LC-MS/MS鉴定RNA-结合蛋白生物呈现网站.（D）根据RNA结构生物信息网络服务器预测，由PF3D7_0412800编码的RUF6的最低自由能二级结构。用于ChIRP-MS的四个寡核苷酸探针沿着其ncRNA结构的结合区域显示。奇数探针1和3为蓝色，偶数探针2和4为红色。**（E）**与使用奇数、偶数和混乱的探针组和RNase处理的样本的输入样本相比，ChIRP MS中RNA检索的百分比。转录水平通过RT-qPCR进行评估，果糖-二磷酸醛缩酶（PF3D7_1444800）水平作为阴性对照。

图2。 — **图2 RUF6 ncRNA相互作用蛋白的ChIRP-MS鉴定。**
**（A）**571无标签定量蛋白质组分析的RUF6 ChIRP-MS火山图*恶性疟原虫*与对照组相比，目标样品（甚至探针）中所有四个重复的蛋白质都存在：打乱的探针和RNase处理的样品。蓝点颜色表示目标（偶数探针）与控制（RNase-treated），绿点颜色表示靶（偶数探测器）与控制量（置乱探针）。每个点代表一种蛋白质，其大小对应于两种条件下用于量化浓缩比率的肽的总和。x个-轴=对数₂（折叠变化），年-轴=−log₁₀(*P（P）*-值），水平红线表示已调整*P（P）*=0.05，垂直绿线表示绝对折叠变化=2.0。侧面板表示在任一样品中唯一识别的蛋白质(年-轴=每100个氨基酸的肽数）。所有单独的比较都可以在补充图中找到。红色突出显示的方框显示，与每个对照组相比，目标样品中有386种蛋白质显著富集或独特。**（A、B）**相关图比较了（A）中386个蛋白质的靶点（偶数探针）与对照点（经RNase处理），以及靶点（偶探针）与控制点（加扰探针）。红色突出显示的方框显示，与两种对照相比，目标样品中的蛋白质显著富集或独特。**（C）**显示的分子功能分组代表与仅在RUF6靶样品中富集而在对照样品中未富集的基因分子功能相关的基因本体术语，这些样品使用PlasmoDB进行可视化准备(等离子数据库.org)和REViGO工具(http://revigo.irb.hr/). 蛋白质具有*P（P）*-值截止值为0.05。**（D）**选定候选蛋白质的蛋白质ID。此图的源数据可用。

图S1。 — **图S1 RUF6 ChIRP-MS候选蛋白的鉴定。**
**（A、B、C）**无标签定量蛋白质组分析火山图*恶性疟原虫*样品中所有四个重复出现的蛋白质：（A）靶向（偶数探针）与对照（RNase处理的）相比，（B）靶向的（偶数探头）与控制（加扰探针）相比，以及（C）对照（RNase处理的）与控制相比较（加扰探头）。每个点代表一种蛋白质，其大小对应于两种条件下用于量化浓缩比率的肽的总和。x轴=对数₂（折叠变化）和y轴=210个氨基酸。**（D）**强度图*恶性疟原虫*所有四个生物复制品的蛋白质分布（蓝色=靶向（偶数探针），绿色=对照（RNase处理），黑色=对照（打乱探针））。

图3。 — **图3 ChIRP-MS候选蛋白的验证。**
**（A）**RT-qPCR结果来自WT 3D7核提取物的RNA免疫沉淀分析：功能未知的蛋白质（Pf3D7_1423700）和Pf-DDX5 RNA解旋酶（Pf3D 7_1445900）。RT-qPCR引物为果糖-二磷酸醛缩酶（FBA），Pf3D7_1444800；整个基因家族的RUF6；丙氨酸tRNA Pf3D7_0411500。结果显示为输入的%。错误栏显示了三个生物复制。**（B）**IDC中细胞质和核提取物中Pf-DDX5的Western blot（环、滋养体和裂殖体）。**（C）**典型的免疫荧光图像显示候选蛋白Pf-DDX5的亮场、DAPI、GFP和DAPI-GFP融合。

图4。 — **图4.Pf-DDX5相互作用部分。**
**（A）**Pf-DDX5与对照蛋白（一种功能未知的蛋白）所有五个重复的Co-IP-MS火山富集图（Pf3D7_1423700）；蛋白质被标示和标记。每个点代表一种蛋白质，其大小对应于两种条件下用于量化浓缩比率的肽的总和。x个-轴=对数₂（折叠变化），年-轴=−log₁₀(*P（P）*-值），水平红线表示已调整*P（P）*=0.05，垂直绿线表示绝对折叠变化=2.0。侧面板表示在任一样品中唯一识别的蛋白质(年-轴=每100个氨基酸中的肽数），至少有三个总肽。已调整*P（P）*-值0.05显示为水平红线，大于2的折叠变化标记为垂直绿线。**（B）**维恩图显示了RUF6 ChIRP-MS和DDX5 IP-MS中发现的共享蛋白质总数。**（C）**显示的生物过程分组代表使用PlasmoDB制备用于可视化的RUF6 ChIRP-MS和DDX5 IP-MS中的共享重要蛋白质(等离子数据库.org)和REViGO工具(http://revigo.irb.hr/). 蛋白质具有*P（P）*-数值截止值为0.05。**（D）**Pf-DDX5样品中富集的重要蛋白质与原始ChIRP-MS选择的候选蛋白质相同。此图的源数据可用。

图5。 — **图5.Pf-DDX5的敲击道。**
**（A、B）**添加雷帕霉素后，使用质膜定位剂pLyn-FRB-mCherry对Pf-DDX5-GFP-2FKBP定位错误的IFA图像。（B） Western blot显示加入雷帕霉素后Pf-DDX5蛋白从细胞核中去除。组蛋白H3用作核提取物对照。使用图像分析工具，雷帕霉素的添加导致细胞核水平下降10倍（标准化为H3）。总提取物显示添加雷帕霉素前后存在Pf-DDX5。**（C）**在有雷帕霉素（250 nM最终浓度，+雷帕霉素）或无雷帕霉素的情况下培养的Pf-DDX5-GFP-2FKBP寄生虫的4 d生长曲线。误差条表示来自三个独立实验的SD。

图S2。 — **图S2：采集用于RNA-seq分析的环状寄生虫的Giemsa染色（12 hpi）。**
**（A、B）**图片显示了在没有（−Rap）雷帕霉素（A）或（+Rap）雷帕霉素（B）的情况下培养的环状寄生虫。

图S3。 — **图S3..皮尔逊热图第页在±雷帕霉素样本的转录水平和参考转录组数据集的转录水平之间计算的相关系数（Bozdech等人，2003年）。**

图6。 — **图6..Pf-DDX5涉及*无功功率，无功功率*基因转录。**
**（A、B）**RUF6基因家族的转录谱和（B）*无功功率，无功功率*通过控制−Rap和处理+Rap样品的RNA测序分析12 hpi的基因家族。**（C）**活性物质的转录水平*无功功率，无功功率*通过对对照−Rap和处理+Rap样品的RNA测序分析12 hpi的基因和相关RUF6成员。**（A，D）**MA对数图₂（雷帕霉素处理/未处理，M）绘制了12 hpi时每个基因（A）的平均丰度。具有显著较高（以上x个-轴）或更低（低于x个-轴）雷帕霉素存在时的丰度以红色突出显示(q个≤ 0.05). 活动的*无功功率，无功功率*基因以绿色突出显示(q个= 2.59 × 10⁻⁶). 对未经治疗和雷帕霉素治疗的寄生虫进行了三次重复试验。*P（P）*-根据DESeq2（Love等人，2014）中实施的负二项广义线性模型，通过Wald检验计算系数的显著性。q个=Bonferroni修正*P（P）*-值。显示了三个独立实验的Mean_SEM。

请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

Rrp6通过疟疾寄生虫的ncRNA RUF6衰变调节异色基因沉默。
Fan Y、Shen S、Wei G、Tang J、Zhao Y、Wang F、He X、Guo G、Shang X、Yu X、Ma Z、He X、Liu M、Zhu Q、Le Z、Wei G、Cao J、Jiang C、Zhang Q。 Fan Y等人。 mBio公司。2020年6月2日；11（3）：e01110-20。doi:10.1128/mBio.01110-20。 mBio公司。2020 PMID：32487761 免费PMC文章。
克隆变异GC-Rich非编码RNA家族的CRISPR干扰导致无功功率，无功功率恶性疟原虫的基因。
巴康-西蒙A、科尔登·奥布拉斯C、吉泽蒂J、布莱恩特·JM、谢尔夫A。 Barcons-Simon A等人。 mBio公司。2020年1月21日；11（1）：e03054-19。doi:10.128/生物.03054-19。 mBio公司。2020 PMID：31964736 免费PMC文章。
非编码RNA作为恶性疟原虫毒力基因表达的新调节因子。
Vembar SS，谢尔夫A，西格尔田纳西州。 Vembar SS等人。当前操作微生物。2014年8月；20:153-61. doi:10.1016/j.mib.2014.06.013。Epub 2014年7月12日。当前操作微生物。2014 PMID：25022240 免费PMC文章。审查。
var表达位点的反式作用GC-rich非编码RNA调节疟疾寄生虫的基因计数。
Guizetti J、Barcons-Simon A、Scherf A。 Guizetti J等人。核酸研究2016年11月16日；44(20):9710-9718. doi:10.1093/nar/gkw664。Epub 2016年7月27日。 2016年核酸研究。 PMID：27466391 免费PMC文章。
非编码RNA：哺乳动物转录机制的调节器。
Eidem TM、Kugel JF、Goodrich JA。 Eidem TM等人。分子生物学杂志。2016年6月19日；428(12):2652-2659. doi:10.1016/j.jmb.2016.02.019。Epub 2016年2月23日。分子生物学杂志。2016 PMID：26920110 免费PMC文章。审查。

查看所有类似文章

引用人

DEAD-box RNA解旋酶DDX5（p68）在癌症DNA修复、免疫抑制、癌症代谢控制、病毒感染促进和人类微生物群（微生物群）负面影响中的作用。
Li F、Ling X、Chakraborty S、Fountzilas C、Wang J、Jamroze A、Liu X、Kalinski P、Tang DG。李峰等。《实验临床癌症研究杂志》2023年8月19日；42(1):213. doi:10.1186/s13046-023-02787-x。《2023年实验与临床癌症研究杂志》。 PMID：37596619 免费PMC文章。审查。
解码核组织对寄生虫抗原变异的影响。
Barcons-Simon A、Carrington M、Siegel TN。 Barcons-Simon A等人。自然微生物。2023年8月；8(8):1408-1418. doi:10.1038/s41564-023-01424-9。Epub 2023年7月31日。自然微生物。2023 PMID：37524976 审查。

工具书类

1. Allen TA、Kaenel S、Goodrich JA、Kugel JF（2004）SINE编码的小鼠B2 RNA抑制mRNA转录以应对热休克。国家结构分子生物学11:816–821。10.1038/nsmb813-内政部-公共医学
1. Amit-Avraham I、Pozner G、Eshar S、Fastman Y、Kolevzon N、Yavin E、Dzikowski R（2015）反义长非编码rna调节恶性疟原虫的var基因激活。美国国家科学院院刊A 112:E982–E991。10.1073/pnas.1420855112-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Anders S、Pyl PT、Huber W（2015）HTSeq–一个用于处理高通量测序数据的python框架。生物信息学31:166–169。10.1093/生物信息学/btu638-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Arnold PR、Wells AD、Li XC（2019）增强子RNA在基因表达和细胞命运调控中的多样性和新兴作用。前细胞开发生物学7:377。10.3389/fc电话2019.00377-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Aurrecoechea C、Barreto A、Basenko EY、Brestelli J、Brunk BP、Cade S、Crouch K、Doherty R、Falke D、Fischer S等（2017）EuPathDB：真核病原体基因组数据库资源。核酸研究45:D581–D591。10.1093/nar/gkw1105-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

行动

MeSH术语

行动
行动
行动
行动
行动
行动

物质

行动
行动

LinkOut-更多资源

全文源

[1] Allen TA、Kaenel S、Goodrich JA、Kugel JF（2004）SINE编码的小鼠B2 RNA抑制mRNA转录以应对热休克。国家结构分子生物学11:816–821。10.1038/nsmb813-内政部-公共医学

[2] Allen TA、Kaenel S、Goodrich JA、Kugel JF（2004）SINE编码的小鼠B2 RNA抑制mRNA转录以应对热休克。国家结构分子生物学11:816–821。10.1038/nsmb813-内政部-公共医学

[3] Amit-Avraham I、Pozner G、Eshar S、Fastman Y、Kolevzon N、Yavin E、Dzikowski R（2015）反义长非编码rna调节恶性疟原虫的var基因激活。美国国家科学院院刊A 112:E982–E991。10.1073/pnas.1420855112-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[4] Amit-Avraham I、Pozner G、Eshar S、Fastman Y、Kolevzon N、Yavin E、Dzikowski R（2015）反义长非编码rna调节恶性疟原虫的var基因激活。美国国家科学院院刊A 112:E982–E991。10.1073/pnas.1420855112-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[5] Anders S、Pyl PT、Huber W（2015）HTSeq–一个用于处理高通量测序数据的python框架。生物信息学31:166–169。10.1093/生物信息学/btu638-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[6] Anders S、Pyl PT、Huber W（2015）HTSeq–一个用于处理高通量测序数据的python框架。生物信息学31:166–169。10.1093/生物信息学/btu638-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Arnold PR、Wells AD、Li XC（2019）增强子RNA在基因表达和细胞命运调控中的多样性和新兴作用。前细胞开发生物学7:377。10.3389/fc电话2019.00377-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Arnold PR、Wells AD、Li XC（2019）增强子RNA在基因表达和细胞命运调控中的多样性和新兴作用。前细胞开发生物学7:377。10.3389/fc电话2019.00377-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Aurrecoechea C、Barreto A、Basenko EY、Brestelli J、Brunk BP、Cade S、Crouch K、Doherty R、Falke D、Fischer S等（2017）EuPathDB：真核病原体基因组数据库资源。核酸研究45:D581–D591。10.1093/nar/gkw1105-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Aurrecoechea C、Barreto A、Basenko EY、Brestelli J、Brunk BP、Cade S、Crouch K、Doherty R、Falke D、Fischer S等（2017）EuPathDB：真核病原体基因组数据库资源。核酸研究45:D581–D591。10.1093/nar/gkw1105-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

将引文保存到文件

电子邮件引文

添加到集合

添加到我的书目

您保存的搜索

为外部引文管理软件创建文件

您的RSS源

RUF6 ncRNA相互作用蛋白的发现恶性疟原虫免疫逃避

附属公司

RUF6 ncRNA相互作用蛋白的发现恶性疟原虫免疫逃避

作者

附属公司

摘要

利益冲突声明

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

LinkOut-更多资源

全文源

摘要

利益冲突声明

数字

类似文章

引用人

工具书类

出版物类型

MeSH术语

物质

相关信息

LinkOut-更多资源

全文源