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.2022年10月31日；6（1）：e202201689。
doi:10.26508/lsa.202201689。 打印日期：2023年1月。

CRISPRi筛查揭示了外体和无囊泡tau之间共同的tau病理调节因子

胡安·卡洛斯·波兰科 1, 叶文·阿基莫夫 2, 阿维纳什·费尔南德斯 三, 亚当·布林纳 三, 加布里埃尔·里斯·汉德 三, 马洛斯·范·罗金 4, 朱塞佩·巴利斯特里 5, 吉尔根·戈茨 1
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CRISPRi筛查揭示了外体和无囊泡tau之间共同的tau病理调节因子

胡安·卡洛斯·波兰科等。 生命科学联盟. .

摘要

微管相关蛋白tau的聚集是阿尔茨海默病和其他tau病的特征。Tau病理学被认为是由游离Tau聚集体和胞外体样胞外囊泡内携带的Tau驱动的，两者都通过跨突触体传播，并通过腐败的接种过程在受体神经元中诱导Tau病理。在这里，我们对tau生物传感器细胞进行了全基因组CRISPRi筛选，并确定了tau种子的两种机制共享的细胞调节因子。我们确定ANKLE2、BANF1、NUSAP1、EIF1AD和VPS18是限制由外体和无囊泡tau种子启动的tau聚集的顶级验证调节因子。我们验证的命中率都没有影响任何一种形式的tau种子的摄取，这支持了它们通过种子摄取下游的细胞自主机制运作的观点。最后，对人脑组织的验证研究也表明，阿尔茨海默病患者大脑中的一些已确定的蛋白质表达下调，这表明他们的活性降低可能是人脑tau病理学出现或发展所必需的。

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数字

图1。
图1.使用汇总的CRISPRi屏幕和萨科西尔不溶性τ，无偏发现τ聚集调节物。
（A）对从P301L tau转基因rTg4510小鼠大脑中获得的sarkosyl-soluble和sarkosy-lin-soluble组分进行Western blot分析。不溶性部分显示磷酸化τ（pS422）和高分子量总τ（Tau5）。（B、C）用红霉素可溶性（B）和红霉素不溶性τ（C）处理48小时后，表观荧光显微镜检测τ生物传感器细胞中的τRD-YFP。代表τ聚集体的亮点（箭头）仅出现在用沙克糖不溶性τ处理的细胞中。比例尺：50µm。（D）共用CRISPRi屏幕的示意图。表达FRET对Tau RD-CFP和Tau RD-YFP以及慢病毒KRAB-dCas9（BSKRAB）的Tau生物传感器细胞通过Dolcetto CRISPRi文库转导，该文库包含靶向约18000个基因的慢病毒sgRNAs集合，然后与sarkosyl-in-soluble Tau（无囊泡Tau种子）孵育。48小时后，利用FACS将细胞分为FRET（+）和FRET（−）群体。对样本进行处理，生成NGS测序库，并在NextSeq 500仪器上测序。（E）所有样本中平均sgRNA读取计数的频率分布。57050个sgRNAs中有39个（0.068%）未检测到。（F）显示成因测井的火山图2sgRNA计数与假发现率的倍数变化。错误发现率值基于MAGeCK的稳健排名聚合（Li等人，2014）。追踪的基因以红色突出显示。（G）通过CRISPRi筛选和富集相关通路确定的前200个τ聚集阳性调节物的基因本体论术语富集分析。
图2。
图2：使用单个CRISPRi敲除，然后用外泌体样EV和无囊泡tau种子培养，对生物信息学点击进行功能验证。
（A）功能验证工作流的示意图。使用单个sgRNAs沉默tau生物传感器细胞（BSKRAB-KD）中与KRAB-dCas9结合的相应基因，然后用sarkosyl-in-soluble tau（无囊泡tau种子）或exosome-like EVs处理72 h，然后使用FRET流式细胞仪检测和量化tau聚集。同样的一部分BSKRAB-KD细胞也被培养了72小时，以证实蛋白质表达被Western blots击倒。（B、C、D、E、F、G）综合FRET强度表示击倒不同靶点时τ聚集的水平。对照黑柱（NT）是三份独立的非靶向sgRNAs（n=3）的平均值。对照细胞与单独靶向的敲除细胞（1、2和3）进行比较。误差条代表n=3的SEM*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001; 以及****P（P）< 0.0001. 每个单一靶向sgRNA都增加了tau与外体和无囊泡tau种子的聚集。（C、D）有趣的是，ANKLE2和BANF1（C，D）似乎对类外泌体EVs诱导的τ聚集有较强的影响。（H）BSKRAB-KD敲除细胞的定量Western blot分析。每一个sgRNA都会产生一个靶基因的蛋白质敲除。注意，ANKLE2特异性抗体与几种亚型反应，包括大小为104–117 kD的典型变体（红框轮廓）；然而，当ANKLE2基因座沉默时，所有亚型均下调。类似地，EIF1AD抗体识别19kD的典型亚型和一个低分子量的额外变体，两者都被针对EIF1AD的单个sgRNA沉默。（一）不同靶基因蛋白质敲除程度的量化。误差条代表n=3的SEM*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; 和****P（P）< 0.0001.
图3。
图3 ANKLE2、BANF1、VPS18、EIF1AD或NUSAP1的个体敲除不会诱导tau自发聚集。
（A）未添加外源tau种子的敲除和控制细胞（非靶向sgRNA）的FACS图。在检测到FRET阳性细胞的象限（Q2用黄色阴影表示）中，ANKLE2、BANF1、VPS18、EIF1AD和NUSAP1的对照（NonT）和敲除细胞中都没有FRET信号，表明没有自发tau聚集。（B）然而，这些细胞（底部面板）仅在添加τ种子（400 ng石杉醇τ）后才显示FRET阳性细胞，这意味着需要外源τ种子来触发内源性τ的聚集。显示了第2季度FRET阳性细胞的百分比（n=3，平均±SEM，分析了40000个细胞/实验）。
图S1。
图S1.使用单个CRISPRi击倒进行功能验证的其他生物信息点击。
（A）功能验证工作流。使用单个sgRNAs沉默tau生物传感器细胞（BSKRAB-KD）中与KRAB-dCas9结合的靶基因，然后用沙棘糖不溶性tau或外体tau种子处理72 h，然后使用FRET流式细胞仪检测和量化tau聚集。（B、C、D、E）综合FRET强度表示不同基因点击的敲除条件下τ聚集水平。对照黑柱（NT）是三份独立的非靶向sgRNAs（n=3）的平均值。对照细胞与单独靶向的敲除细胞（1、2和3）进行比较。PIK3R4、SIK3和KANSL1L的个体沉默并没有导致τ聚集的显著增加。VPS37A的敲除导致τ聚集的弱增强，特别是在类外泌体EV中的τ。误差条代表n=3的SEM****P（P）< 0.0001; ns，不显著。
图4。
图4不同敲除细胞对τ种子摄取水平的分析。
（A）量化外体和无囊泡τ种子摄取的工作流程示意图。用远红色标记的tau种子，Alexa Fluor 647标记的sarkosyl tau或CVC标记的外泌体样EV处理BSKRAB-KD敲低细胞1小时，然后使用流式细胞术检测携带标记的tau种子的细胞。通过测量远红外线阳性细胞的平均荧光强度来量化Tau摄取。（B、C）没有一个基因敲除导致tau种子吸收显著增加（虚线），这表明这些基因是tau种子内化的下游，因此通过细胞自主机制影响tau聚集。将三种不同的非靶向sgRNA（n=3）作为对照（黑柱），与靶向每个基因的三种敲除sgRNA进行比较，并将其合并进行比较。至于对照，使用三种独立的非靶向sgRNAs（灰色柱；Dyn，动力蛋白抑制剂；以及4°C下的冷培养）完成摄取抑制控制。误差条表示n＝9的SEM*P（P）<0.05和****P（P）< 0.0001.
图5。
图5阿尔茨海默病患者死后脑组织中新验证调节因子的定量Western blot分析。
（A）使用来自阿尔茨海默病患者（AD）的死后皮层脑样本（上额叶皮层）对经验证的新型调节物进行Western blot分析。患者的病理数据见表1。使用了针对人类VSP18、NUSAP1、EIF1AD和ANKLE2的抗体。（B）检测人脑样本中的人类tau（tau-13抗体）和在Ser422磷酸化的tau（pS422抗体）。（C、D、E、F）对对照组和AD样本中蛋白质水平的量化显示，AD患者的VPS18（C）、NUSAP1（D）和EIF1AD（E）显著下调。（F）然而，ANKLE2水平（F）没有统计学差异。值得注意的是，大小为104–117 kD（红框轮廓）的标准亚型是人脑中检测到的主要亚型，因此，仅对该亚型进行了量化。（G）pS422/hTau-13比率的量化显示AD样本中Ser422处tau磷酸化显著增加。误差条代表n=6的SEM*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ns，不显著。
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