Lateral confined growth of cells activates Lef1 dependent pathways to regulate cell-state transitions

doi:10.1038/s41598-022-21596-4

.2022年10月15日；12(1):17318.

doi:10.1038/s41598-022-21596-4。

细胞的侧向限制性生长激活Lef1依赖性通路以调节细胞状态转换

袁略珍^1 2 三, 比哈斯·罗伊^1 三 4, 普拉苏纳·拉特纳^三, 卡罗琳·乌勒⁵, G V Shivashankar公司^6 7 8 9

附属公司

¹Paul Scherrer研究所生物与化学系，5232，瑞士维利根。
²瑞士苏黎世ETH健康科学与技术部，8092，苏黎世。
^三新加坡国立大学机械生物学研究所，新加坡，117411。
⁴意大利癌症研究基金会分子肿瘤学研究所，20139年，意大利米兰。
⁵美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院。
⁶瑞士维利根，5232，保罗·谢尔研究所，生物和化学部。shiva.gvs@gmail.com。
⁷瑞士苏黎世ETH健康科学与技术部，8092，苏黎世。shiva.gvs@gmail.com。
⁸新加坡国立大学机械生物学研究所，新加坡，117411。shiva.gvs@gmail.com。
⁹意大利癌症研究基金会分子肿瘤学研究所，20139年，意大利米兰。shiva.gvs@gmail.com。

采购管理信息： 36243826
预防性维修识别码： PMC9569372型
DOI（操作界面）： 10.1038/s41598-022-21596-4

细胞的侧向限制性生长激活Lef1依赖性通路以调节细胞状态转换

袁略珍等。科学代表. 2022.

.2022年10月15日；12(1):17318.

doi:10.1038/s41598-022-21596-4。

作者

袁略珍^1 2 三, 比哈斯·罗伊^1 三 4, 普拉苏纳·拉特纳^三, 卡罗琳·尤勒⁵, G V Shivashankar公司^6 7 8 9

附属公司

¹瑞士维利根，5232，保罗·谢尔研究所，生物和化学部。
²瑞士苏黎世ETH健康科学与技术部，8092，苏黎世。
^三新加坡国立大学机械生物学研究所，新加坡，117411。
⁴意大利癌症研究基金会分子肿瘤学研究所，20139年，意大利米兰。
⁵美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院。
⁶瑞士维利根，5232，保罗·谢尔研究所，生物和化学部。shiva.gvs@gmail.com。
⁷瑞士苏黎世ETH健康科学与技术部，8092，苏黎世。shiva.gvs@gmail.com。
⁸新加坡国立大学机械生物学研究所，新加坡，117411。shiva.gvs@gmail.com。
⁹意大利癌症研究基金会分子肿瘤学研究所，20139年，意大利米兰。shiva.gvs@gmail.com。

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摘要

组织微环境中长期持续的机械化学信号调节细胞状态转变。在最近的研究中，我们发现成纤维细胞的侧向限制生长可诱导去分化程序。然而，这种机械诱导的细胞-状态转变的分子机制尚不清楚。在本文中，我们确定Lef1是一个关键的体细胞转录因子，用于去分化途径的机械调节。应用于延时RNA-seq数据的网络优化方法确定Lef1依赖信号作为此类细胞状态转换的潜在调节器。我们表明，Lef1基因敲除导致成纤维细胞去分化的下调，并且Lef1直接与下游重编程因子的启动子区域相互作用。我们还评估了Lef1的潜在上游激活途径，包括Smad4、Atf2、NFkB和Beta-catenin途径，从而确定Smad4和Atf2可能对Lef1激活至关重要。总之，我们描述了一种重要的机械转导途径，包括Lef1，它在激活时，通过进行性的横向细胞限制，导致成纤维细胞去分化。

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数字

图1
在侧向限制下生长的成纤维细胞的全局基因表达分析揭示了它们的去分化。（A）横向限制生长4、6或10天的细胞的差异干涉对比图像。插图显示了Oct4染色（红色）和细胞核（蓝色）的荧光图像。插入比例尺为20 um(B类)第4天、第6天和第10天的球体大小方框图显示，细胞在微模式上组织成球体，并逐渐增大****P（P）* < 0.001; 第4天、第6天和第10天的n=499、440、153；采用双侧Student t检验。(C类)基因表达谱的主成分分析显示了通过去分化来改变细胞状态。参与该分析的基因与调节的第页值<0.01和|log2折叠变化|>2(D类,E类,F类)去分化期间四个时间点Oct4、Nanog或Sox2基因表达（RPM）的条形图，以及与其他细胞类型的比较。MEF：小鼠胚胎成纤维细胞；E3.5ICM:E3.5内部细胞质量；E4.5ICM:E4.5内细胞质量；F123:F123细胞系；E14:ES-E14TG2a细胞系在小鼠ES细胞培养基中培养；E14_2i:ES-E14TG2a细胞系在2i条件下培养。误差线代表±SD(**G公司**)维恩图显示了去分化过程中四个时间点上调基因的数量。例如，与3小时和3天的时间点相比，第6天和第10天有4024个基因上调。上调基因具有FDR（调整第页值）<0.01。(小时)在第3天时间点（207个基因）、第3小时和第3天的时间点（420个基因）以及第6天和第10天的时间点通过表达的基因（4024个基因）的功能注释。

图2
Prize-Collecting-Steiner-Tree分析强调了成纤维细胞侧向限制生长期间Lef1依赖的信号传导。(A类–D类)热图显示了通过基因本体注释发现的转录调控因子的表达变化。它们包含术语GO:0044212（转录调控区DNA结合）、GO:0035326（增强子结合）、GO:0008301（DNA结合和弯曲）和GO:0001047（核心启动子结合）。这些数值是指与3小时样本相比log2倍的变化。(E类)使用Prize-Collecting-Steiner树方法推导的转录调控网络。橙色、红色和粉红色的节点表示第三天上调的基因以及连接它们的重要中间产物。红色和粉红色的节点是转录调节器。蓝色和绿松石色的节点表示第6天上调的基因。其中，绿松石节点代表重新编程的因素。(F类,**G公司**)放大的图片(E类)显示转录调节因子（粉红色和Lef1及其与绿松石边界的相互作用因子），其可以调节重编程因子的表达或与重编程因子的基因座结合（绿松石）。(小时)转录调控因子的排名（中的粉红色节点(E类)).

图3
Lef1的敲除以及Lef1和Oct4的时间进程研究表明Lef1在成纤维细胞去分化中的关键作用。(A类,B类)Lef1和Oct4 mRNA表达水平随时间变化的条形图，误差线表示±SD(C类)Lef1和Oct4核荧光强度散点图。每个点代表一个原子核的平均强度。皮尔逊相关系数r为0.64。（D）第2天、第4天、第6天和第10天细胞的Lef1（红色）和细胞核（蓝色）的荧光图像。比例尺为20微米(E类)方框图显示了平均核Lef1强度随时间的量化；n分别为244、279和673。(F类)第2天、第4天、第6天和第10天细胞的Oct4（红色）和细胞核（蓝色）的荧光图像。比例尺为20微米(**G公司**)方框图显示了随时间变化的平均核Oct4强度的量化；n分别为481、1486、1248和2472。(小时)对照细胞和Lef1 siRNA处理细胞的Oct4（洋红色）和细胞核（青色）的荧光图像。比例尺为50 um(我)Oct4核强度的量化显示了对照和Lef1 siRNA样本的不同分布****P（P）* < 0.001; n分别为2708和3171。

图4
在机械诱导的成纤维细胞脱分化过程中，Lef1与重编程因子的基因位点结合。(A类)热图显示Lef1在第4天与选定基因的启动子区域结合。也显示了在2D培养基上生长的控制细胞。单位是输入的百分比。(B类)Lef1启动子占位的折叠变化，与第4天样品和对照样品进行比较**P（P）* < 0.05. （C/D）条形图显示Lef1与Nanog和Oct4启动子区域的结合在第3小时、第2天和第4天增加。

图5
Lef1激活可能受Smad4和Atf2途径的调节。(A类)可与Lef1相互作用的已识别基因表、与Lef1共享靶点的数量以及作为靶点的共享重编程因子。(B类)条形图显示第3天到第6天上调或下调的基因数量。Up（Shared）：与Lef1共享的上调目标。向下（共享）：与Lef1共享的下调目标。这些目标用调整后的第页值<0.01。(C类,D类,E类)Lef1、Smad4和Nucleus染色；Lef1、Atf2和细胞核；以及第4天样本中的Lef1、Beta-catenin和Nucleus。比例尺为20微米(F类,**G公司**,小时)显示Lef1和Smad4平均核荧光强度的散点图；Lef1和Atf2；Lef1和Beta-catenin以及线性拟合和相应的Pearson相关系数。Lef1/Smad4/RNA pol II联合染色的代表性图像(我)，Lef1/Atf2/RNA pol II(J型). 插图是来自各个图像的小白框区域的缩放。(**K（K）**)条形图显示了从2D培养条件到D4（第4天样品）共定位的变化。单位是共定域体积与原子核体积之比。每个点代表一个核。前两条是Lef1和RNA pol II的共定位。中间的两条是Lef1、Atf2和RNA pol II的共定位。最后两条是Lef1、Smad4和RNA pol II的共定位。

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1. Kim DH等，《胚胎发育、组织修复和癌症中的上皮-间充质转化：综合综述》。《临床医学杂志》2017；7:1. doi:10.3390/jcm7010001。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Przybyla L、Muncie JM、Weaver VM。发育和癌症中上皮-间充质转化的机械控制。每年。Rev.细胞发育生物学。2016;32:527–554. doi:10.1146/annurev-cellbio-111315-125150。-内政部-公共医学
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