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.2022年11月；19(11):1383-1392.
doi:10.1038/s41592-022-01618-9。 Epub 2022年10月3日。

通过抗体靶向标记原位分析染色质靶点处的RNA

纳迪亚·库扎 1, 史蒂文·海尼科夫 2 三, 卡米·艾哈迈德 4
附属公司

通过抗体靶向标记原位分析染色质靶点处的RNA

纳迪亚·库扎等人。 Nat方法. 2022年11月.

摘要

虽然染色质结合蛋白的绘制技术已经很成熟，但绘制染色质相关RNA仍然是一个挑战。在这里，我们描述了逆转录和标记（RT&Tag），其中与染色质表位相关的RNA被抗体靶向，随后是蛋白a-Tn5转座子。局部逆转录产生RNA/cDNA杂交，随后被Tn5转座子酶标记以进行下游测序。我们演示了RT&amp；在果蝇细胞中标记捕获具有剂量补偿复合物的非编码RNA roX2和与沉默组蛋白修饰相关的成熟转录物。我们还展示了RT&amp；Tag可以检测N6-甲基腺苷修饰的mRNA，并表明产生甲基化转录物的基因的特点是RNA聚合酶II的启动子广泛暂停。原位抗体栓系和标记的高效性使RT&amp；标签特别适合快速低成本分析染色质相关RNA。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者宣布了以下相互竞争的利益：新罕布什尔州弗雷德·哈钦森癌症中心（Fred Hutchinson Cancer Center，N.K.，K.A.和S.H.）正在申请一项关于标记RNA分析的美国专利。专利申请号——USPTO申请号63/334582。

数字

图1
图1。RT和标记一般工作流程。
一，概述RT&Tag步骤的示意图。b条，插图显示了本研究中描述的RT&Tag的应用，与基于免疫沉淀的技术相比，基于免疫沉淀技术需要针对每种类型的相互作用使用单独的方法。
图2
图2。RT&Tag捕获MSL2和roX2之间的交互。
一图中显示了用于捕获MSL2和roX2之间交互的RT和Tag。b条Tapestation凝胶图像和相应的电泳图，显示了两轮0.8×珠清理后MSL2 RT&Tag库的尺寸分布。这张图片代表了两个独立的实验。FU（荧光单位）。c（c），饼图显示MSL2 RT&Tag读取的比例(n个 = 4） 与分类为外显子、内含子或基因间的区域对齐。天，密度图，显示对齐的MSL2 RT和Tag读取的分布(n个 = 4） 按比例放大果蝇属基因体。e（电子），PCA显示IgG和MSL2 RT和Tag样品之间的分离(n个 = 4） 沿着第一主成分（PC1）和在第二主成分（PC2）中的重复之间的分离。前两个和最后两个重复已经在两个单独的流动细胞上测序，因此可以观察到批量效应。（f），火山图显示MSL2转录物在IgG RT和Tag上的差异富集（FC>2，FDR<0.05，n个 = 4). MSL2丰富的成绩单以红色突出显示，非丰富的为黑色，耗尽的为蓝色。克，基因组浏览器轨迹显示MSL2和IgG RT&Tag信号在roX2型。显示了四个副本的组合读取。小时，核型图显示MSL2 RT&Tag信号是IgG的四倍的bins（50 bp）(n个 = 4） 超过果蝇属染色体。我，剖面图显示MSL2（顶部）和H4K16ac（底部）围绕MSL2 RT&Tag富集或非富集转录物的TSS（顶部）以及基因体（底部）的CUT&Tag信号。显示了MSL2 CUT&Tag的两个复制品和H4K16ac CUT&Tag的一个复制品的组合读数。误差带表示标准误差。源数据
图3
图3。RT&Tag捕获多梳域内的转录物。
一图中显示了RT&Tag用于捕获H3K27me3划分的多梳域内的转录物。b条，火山图显示H3K27me3 RT和Tag在IgG上差异富集的转录物（FC>2，FDR<0.05，n个 = 5). 富含H3K27me3的基因以红色突出显示，未富集的基因以黑色突出显示，缺失的基因以蓝色突出显示。标记了两个最重要的转录本。c（c），基因组浏览器轨迹显示H3K27me3和IgG RT&Tag信号在CR43334号和CR42862号。显示了五个副本的组合读取。天，条形图显示蛋白质编码或非编码的富含H3K27me3转录物的数量。e（电子），方框图显示H3K27me3富集或非富集转录物的RNA-seq表达水平（CPM）*对 = 4.32 × 10−10，韦尔奇两个样品t吨-测试（双面），n个 = 1343用于H3K27me3-富集，n个 = 14403（非浓缩），n个 = 2个独立的RNA-seq实验。对于箱线图，四分位范围（IQR）显示在方框的范围内，中心线表示中值，胡须显示的数据在IQR的1.5倍以内，并且忽略了异常值。（f），剖面图显示H3K27me3（左）、H3K36me3（中）和H3K4me3（右）CUT&Tag信号围绕被归类为H3K17me3 RT&Tag富集或非富集基因的基因体或TSS。显示了H3K27me3的两个副本以及H3K36me3和H3K4me3的一个副本的合并读取。误差带表示标准误差。克，显示HOX簇基因的IgG和H3K27me3 RT和Tag信号（CPM）的图*FDR＜0.05，n个 = 5个独立的RT&Tag实验。小时、剖面图和热图，显示H3K27me3（左）、H3K36me3（中）和H3K4me3（右）在基因体上的信号或H3K17me3 RT&Tag富集转录物的TSS，这些转录物在其基因体上具有高或低水平的H3K26me3 CUT&Tag信号。热图按CUT&Tag信号递减的顺序绘制。误差带表示标准误差。源数据
图4
图4。RT&Tag捕获为m6A修饰而富集的转录本。
一图中显示了RT&Tag用于捕获m6A转录后修饰富集的转录本。b条，火山图显示m6A在IgG RT&Tag上差异富集的基因（FC>1.5，FDR<0.05，n个 = 3). 富含m6A的基因以红色突出显示，未富集的基因以黑色突出显示，缺失的m6A以蓝色突出显示。标记先前显示m6A富集或缺失的基因。c（c），基因组浏览器轨迹显示m6A和IgG RT&Tag在阿奎兹和Syx1A公司。显示了三个副本的组合读取。天，点图显示与m6A富集和m6A缺失转录物相关的前五个GO生物过程（顶部）和分子功能（底部）术语。点大小对应于基因比率（与GO项相关的基因数量/m6A富集或m6A缺失基因总数），颜色代表统计显著性（超几何检验，Benjamini–Hochberg对值调整）。e（电子），剖面图显示m6A富集、非富集或缺失基因TSS处的METTL3 CUT&Tag信号。显示了三个CUT&Tag副本的组合读取。误差带表示标准误差。（f），热图显示用对照或梅特尔3RNA干扰(n个 = 2). 热图颜色表示z（z）跨行缩放分数。源数据
图5
图5。m6A转录物的启动子暂停了RNAPolII。
一，剖面图和热图显示了前25%表达基因TSS的METTL3（左）和总RNAPolII（右）CUT&Tag信号。使用两个CUT&Tag副本的组合读取。热图按METTL3信号递减的顺序绘制。b条，方框图显示m6A缺失、富集或非富集基因的RNA-seq表达水平（CPM）2比例尺*对 = 0.001265（m6A富集与耗尽）*对 = 2.979 × 10−8（m6A富集与未富集）和*对 = 0.0008931（m6A耗尽与非富集），韦尔奇两个样品t吨-测试（双面），n个 = 281用于富集m6A，n个 = 106表示m6A耗尽n个 = 12129（非浓缩自）n个 = 2个独立的RNA-seq实验。IQR显示在方框的范围内，中心线代表中间值，胡须显示的数据在IQR的1.5倍以内，忽略了异常值。c（c），剖面图显示了m6A富集、非富集或耗尽基因的基因体或TSS上的H3K36me3（顶部）和H3K4me3（底部）CUT&Tag信号。显示了一个CUT&Tag复制的读数。误差带表示标准误差。天，基因组浏览器跟踪显示IgG、METTL3和RNAPolII CUT&Tag信号通过热休克蛋白70无热休克（HS）或HS 15分钟后的基因。显示了两个副本的组合读取。e（电子），条形图显示IgG和m6A RT&Tag信号热休克蛋白70无HS且HS持续15分钟后，n个 = 2（f），剖面图显示m6A富集、非富集和耗尽转录物TSS处的GAGA因子（GAF）CUT&Tag信号。显示了一个CUT&Tag复制的读数。克，剖面图显示m6A富集、非富集和缺失转录物基因体上的RNAPolII CUT&Tag信号。显示了两个CUT&Tag副本的读数。中的错误带区（f）和克表示标准误差。小时，显示如何计算启动子近端PI的示意图（左）。小提琴图显示m6A富集、非富集和缺失转录物的PI（右）*对 < 2.2 × 10−16（m6A富集与耗尽），对 < 2.2 × 10−16（m6A富集与非富集），对 = 0.0009435（m6A耗尽与非富集），韦尔奇两个样品t吨-测试（双面），n个 = 281用于富集m6A，n个 = 106表示m6A耗尽n个 = 12129（非浓缩），n个 = 2个用于RNAPolII切割和标记。对于在小提琴内绘制的箱线图，IQR显示在方框的范围内，中心线表示中间值，胡须显示的数据在IQR的1.5倍以内，并且忽略了异常值。源数据
扩展数据图1
扩展数据图1。RT&Tag优化。
一)基于以下指标，使用生物素化或非生物素化寡核苷酸（dT）-适配器B融合寡核苷酸进行RT&Tag的性能比较：roX2基于2个重复的MSL2富集（左）和K27me3差异富集转录物数量（右）。这两个实验都是使用逆转录和标记（CoTagRT）方法同时进行的。b条)如果在添加pA-Tn5（preTagRT）之前进行逆转录，或者如果逆转录与标记同时进行（CoTagRT。两项实验均使用未经生物素化的寡核苷酸（dT）-适配器B融合寡核苷酸进行。基于以下指标评估RT&Tag的性能：MSL2的roX2富集度（左上）、K27me3的差异富集转录物数量（右上）和m6A的差异富集抄本数量（右下），使用前TagRT与Co-TagRT，基于2个重复。差异富集被定义为K27me3变化>2倍或m6A变化>1.5倍，<0.05 FDR。c（c）)密度图显示了对齐的MSL2（顶部）和H3K27me3（底部）RT&Tag读数（n=2）在果蝇基因体上的分布，用于生物素化寡聚物（dT）CoTagRT（左）、无核苷酸化寡聚物（dD）CoTag RT（中）和无核苷酸化少聚物（d T）preTagRT的（右）RT和Tag变异。在所有条件下都观察到明显偏向基因的3'端。源数据
扩展数据图2
扩展数据图2。构建RT&Tag库。
显示如何生成RT&Tag库的示意图。在反转录过程中，寡核苷酸（dT）-ME-B融合寡核苷酸与RNA的聚（A）尾结合。锚定寡核苷酸（d T）用于确保聚（A。通过反转录过程，ME-B序列被附加到cDNA中。然后，RNA/cDNA杂交体被ME-A负载的Tn5标记。然后，使用与i5和i7序列互补的引物扩增测序库。使用50个碱基对单端测序对库进行测序，读取源于i5侧。
扩展数据图3
扩展数据图3。H3K27me3和m6A RT&Tag信号。
一)饼图显示了H3K27me3（左，n=5）和m6A（右，n=3）的比例RT&Tag读数与分类为外显子、内含子或基因间的区域对齐。b条)密度图显示对齐的H3K27me3（左，n=5）和m6A（右，n=3）RT&Tag读数在果蝇基因体上的分布。源数据
扩展数据图4
扩展数据图4。RT&Tag捕捉MSL2及其附近转录物之间的相互作用。
一)箱线图显示了从MSL2富集或非富集转录物的基因体到最近的MSL2峰值的基因组距离*p<2.2×10−16，Welch二样本t检验（双侧），MSL2富集转录本n=121，非富集转录本n=13510，MSL2-RT&Tag n=4，MSL2-CUT&Tag n=2。对于箱线图，IQR显示在方框的限制范围内，中心线表示中值，胡须显示的数据在IQR的1.5倍以内，并且忽略了异常值。b条)基因组浏览器轨迹显示IgG和MSL2 RT&Tag信号以及MSL2和H4K16ac CUT&Tag信息在博士学位和多氯联苯基因体。显示了MSL2的2个副本和H4K16ac CUT&Tag的1个副本的合并读取。源数据
扩展数据图5
扩展数据图5。MSL2 RT&Tag与RIP的性能比较–seq。
一)火山图显示MLE RIP–seq转录本在输入上差异富集（折叠变化>2，FDR<0.05，n=3，GSE143455). MLE丰富的成绩单以红色突出显示，非丰富的成册以黑色突出显示，耗尽的成绩单以蓝色突出显示。b条)MSL2 RT&Tag和MLE RIP–seq在控制MSL2/MLE的单元格数、读取数和roX2倍变富集方面的比较表。c（c）)维恩图显示MSL2 RT&Tag和MLE RIP–seq富集的转录本之间的重叠，roX1和roX2均富集。D） 饼图显示MSL2 RT&Tag（左）和MLE RIP–seq（右）独特富集的转录物的染色体分布。源数据
扩展数据图6
扩展数据图6。H3K27me3 RT&Tag性能，核输入数量减少。
一)热图显示了使用100000或25000个细胞核进行的两个实验的平均IgG和H3K27me3 RT&Tag信号。单行代表1342个转录本，在图3b中被鉴定为H3K27me3-富集。热图颜色表示跨行的z值缩放。b条)基因组浏览器追踪显示来自100000、25000或5000个细胞核的IgG和H3K27me3 RT&Tag信号在CR43334号和CR42862号。显示了两个副本的组合读取。c（c）)方框图显示HOX簇基因100000、25000或5000个细胞核的IgG和H3K27me3 RT&Tag信号（百万计数，CPM）*FDR<0.05，n=2个独立的RT&Tag实验。源数据
扩展数据图7
扩展数据图7。RT&Tag捕获多梳域内的转录物。
一)点图显示与H3K27me3富集转录物相关的前10个GO生物过程术语。点大小对应于基因计数，颜色代表统计显著性（超几何检验，benjamini-hochberg p值调整）。b条)剖面图显示了前25%表达基因的基因体上的H3K27me3 CUT&Tag信号（来自2个重复的组合读取）。误差条表示标准误差。c（c）)方框图显示H3K27me3-RT和Tag富集转录物的RNA-seq表达水平（百万计数，CPM），这些转录物在其基因体上具有高（>9个读取计数）或低（<9个读取数）H3K17me3 CUT和Tag信号*p=0.00488，Welch双样本t检验（双面），高H3K27me3时n=1133，低H3K26me3时n=207，RNA-seq时n=2。对于箱线图，IQR显示在方框的限制范围内，中心线表示中值，胡须显示的数据在IQR的1.5倍以内，并且忽略了异常值。源数据
扩展数据图8
扩展数据图8。M6A RT&Tag性能，核输入数量减少。
一)热图显示了使用100000或25000个细胞核进行的两个实验的平均IgG和m6A RT&Tag信号。单行代表图4b中确定为m6A富集的281个转录本。热图颜色表示跨行的z值缩放。b条)基因组浏览器跟踪显示来自100000、25000或5000个细胞核的IgG和m6A RT&Tag信号在阿奎兹和Syx1A公司。显示了两个副本的组合读取。源数据
扩展数据图9
扩展数据图9。甲基化转录物的基因以启动子近端暂停的RNA聚合酶II为特征。
一)条形图显示梅特尔3通过实时PCR在对照RNAi和梅特尔3RNAi S2细胞。数据是相对于对照RNAi绘制的，n=2。b条)剖面图显示m6A缺失基因的基因体上的IgG和METTL3 CUT&Tag信号（3个重复的组合读取）。误差条表示标准误差。c（c）)前25%表达基因启动子处RNAPolII和METTL3 CUT&Tag信号之间的Pearson相关性。使用了2个CUT和Tag复制品的组合读数。天)的顺序热休克蛋白70AaRRACH图案以灰色突出显示。e（电子）)使用差异富集模式设置，发现与m6A缺失转录物相比，m6A富集转录物的启动子中的MEME基序标志富集。（f）)小提琴图显示启动子近端暂停指数（PI）m6A富集的转录物，根据其RNA-seq表达水平分解为四分位。通过将启动子（TSS周围+/-250 bp）RNAPolII CUT&Tag信号除以基因体RNAPolIII CUT&Tag信号计算PI。Welch双样本t检验（双面），n=71代表1标准四分位，n=70代表2第四分位，n=68代表3第三方四分位数，n=72表示4第个四分位，RNAPolII切割和标记n=2。对于在小提琴内绘制的箱线图，IQR显示在方框的范围内，中心线表示中间值，胡须显示的数据在IQR的1.5倍以内，并且忽略了异常值。源数据
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    1. Licatalosi DD，Darnell RB。RNA加工及其调控：对生物网络的全球洞察。Nat.Rev.基因。2010;11:75–87.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Gagliardi M，Matarazo MR.RIP：RNA免疫沉淀。方法分子生物学。2016;1480:73–86.-公共医学
    1. 赵杰，等。RIP-seq法对多梳相关RNA的全基因组鉴定。分子细胞。2010;40:939–953.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Moran VA，Niland CN，Khalil AM。长非编码RNA的共免疫沉淀。方法分子生物学。2012;925:219–228.-公共医学
    1. Fang J等。PIRCh-seq：与不同组蛋白修饰相关的非编码RNA的功能分类。基因组生物学。2019;20:292。-项目管理咨询公司-公共医学

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