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。2022年9月12日13:989183。
doi:10.3389/fmicb.2022.989183。 eCollection 2022年。

蛋白组学研究表明，Toll样受体2信号通路激活对乙型脑炎病毒感染小鼠小胶质细胞高效炎症反应的影响

赵冠宇 1, 闫高 2, 张嘉琪 2, 何章 2 三, 谢长战 2, 富隆南 2, 盛峰（Sheng Feng） 2, 卓哈 2 三, 李成辉 2, 朱香玉 2, 李卓新 2, 张萍（Ping Zhang） 2, 张颖（音） 1, 吕慧君 2 三, 宁义金 1 2 三
附属公司

蛋白组学研究表明，Toll样受体2信号通路激活对乙型脑炎病毒感染小鼠小胶质细胞高效炎症反应的影响

赵冠宇等人。 前部微生物。 。

摘要

每年有数千人死于由日本脑炎病毒（JEV）引起的日本脑炎（JE），可能是由于破坏疾病进程的炎症反应加剧所致。小胶质细胞是位于中枢神经系统实质内的单核吞噬细胞；这些在对抗JEV感染的先天免疫反应中起着关键作用。然而，在BV2细胞JEV感染的早期阶段，TLR2在炎症反应中的参与仍然存在。在这里，我们评估了蛋白谱并确定了TLR2在JEV感染的BV2细胞炎症反应中的作用。采用定量蛋白质组学的高深度串联质谱标记评估JEV感染的BV2细胞，并比较感染后6、12和24小时（hpi）的免疫反应谱。总共，在6hpi检测到212个上调蛋白，在12h检测到754个，在24h检测到191个。根据GO和KEGG富集分析，上调蛋白显示出与免疫反应相关的蛋白富集。平行反应监测测试、蛋白质印迹和qPCR结果显示衔接蛋白MyD88未被激活。MyD88下游关键蛋白IRAK1、IRAK4和TRAF6的表达水平没有增加；然而，PI3K-AKT的表达水平确实增加了。通过抑制关键蛋白（TLR2、PI3K和AKT），我们证实JEV激活了TLR2，从而导致强烈的炎症反应。因此，TLR2-PI3K-AKT信号轴被证明在JEV感染诱导的小胶质细胞炎症反应的早期阶段发挥关键作用。

关键词：日本脑炎病毒；炎症反应；小胶质细胞；蛋白质组学；类收费受体2（TLR2）。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，这项研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

数字

图1
图1
（A）箱线图显示了各重复组蛋白质定量结果的相对标准偏差（RSD），总体RSD值较低表示定量再现性较高。（B）212个DEPs在6 hpi时上调。（C）754个DEPs在12 hpi时上调。（D）191个上调了24 hpi的DEP。
图2
图2
JEV感染后BV2细胞中DEPs的功能富集。（A–C）基于GO富集的聚类分析热图。（A）显示多种免疫反应激活的生物过程，表明JEV感染后细胞免疫反应激活。（B）分子功能显示与蛋白结合相关的激活，表明免疫反应的级联效应也被激活。（C）细胞成分富含少量上调蛋白和大量表达减少的蛋白，因此表明JEV感染抑制了细胞内成分的表达。（D）KEGG富集的聚类分析热图。感染性疾病通路被激活，而与自身免疫性疾病相关通路相关的蛋白表达降低。细胞粘附分子以及抗原处理和呈递途径在12 h时高度富集。所有富集的蛋白质都有显著差异，红色到蓝色的梯度表明蛋白质富集程度从高到低。
图3
图3
JEV感染BV2细胞后免疫相关蛋白的调节（A）6马力，（B）12 hpi，以及（C）24马力。炎症相关蛋白Fas、TNF、Fosl1、Hmgb1、Riok3的表达以及凋亡相关蛋白Fadd、Fas、TNF和干扰素相关蛋白Irf9、Isg20、Ifi35的表达均发生显著变化。这表明JEV感染可引起广泛的免疫反应，炎症反应是关键的免疫反应之一。所有样本均通过三个平行组进行测试*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）< 0.001.
图4
图4
根据蛋白质组学数据，大多数免疫相关蛋白在感染后12小时被激活。（A）通过相对信使核糖核酸水平检测TLR激活。TLR2在所有TLR中均呈高亮表达；选择TLR2进行后续调查。（B）为了研究TLR2发挥功能的途径，对TLR2下游的关键蛋白进行qPCR；TRIF、TIRAP和TRAM没有上调。（C）western blotting证实TLR2下游有两条通路。PI3K-AKT和NF-κB通路蛋白的表达水平显著上调；然而，通常被认为是TLR2连接蛋白的MyD88通路没有被激活。（D）JEV感染促进炎症因子（TNF-α、CCL3、IL-1β和iNOS）的上调，从而表明炎症反应。所有样本分三个平行组进行测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，以及****P（P）< 0.0001.
图5
图5
TLR2通过PI3K和AKT调节炎症因子的表达是通过抑制途径中的关键蛋白来确定的。（A）我们对TLR2进行抑制，并检测下游关键蛋白（p-PI3K、p-AKT和NF-κB）。p-PI3K和p-AKT的表达随着TLR2的表达而降低，而NF-κB和p-NF-κ的B没有随着TLR2表达而改变；这些结果表明，PI3K和AKT是TLR2的下游，受TLR2的调节，而不是NF-κB途径。（B）抑制TLR2后，关键炎症因子（TNF-α、CCL3、IL-1β和iNOS）的表达显著降低，表明TLR2是炎症调节的关键蛋白。（C）TLR2下游的关键蛋白PI3K被抑制，TLR2的表达保持不变，而AKT的表达降低，表明PI3K作用于TLR2下游。（D）PI3K抑制后，关键炎性因子的表达均降低。（E）AKT被抑制，但这并没有引起TLR2表达的变化，因此表明AKT是TLR2的下游蛋白。（F）AKT抑制后TNF-α、CCL3、IL-1β和iNOS的表达水平均降低。这些结果表明，炎症因子的表达受TLR2-PI3K-AKT信号轴的调节。ns：未受到重大监管*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，以及****P（P）< 0.0001.
图6
图6
JEV感染通过TLR2-PI3K-AKT信号轴增加炎症反应关键因子的表达。TLR2下游的MyD88信号通路未被激活，NF-κB信号通路不受TLR2调节。
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