Inhibition of the Niemann-Pick C1 protein is a conserved feature of multiple strains of pathogenic mycobacteria

doi:10.1038/s41467-022-32553-0

.2022年9月9日；13(1):5320.

doi:10.1038/s41467-022-32553-0。

抑制Niemann-Pick C1蛋白是多株致病分枝杆菌的保守特征

余哲翁^#¹, 黎明牧羊人^#¹, 刘毅（音）², 尼蒂亚·克里希南^三, 布莱恩·罗伯逊^三, 尼克·普拉特¹, 杰拉尔德·拉鲁伊·莫姆斯², 弗朗西斯·普拉特⁴

附属公司

¹牛津大学药理学系，牛津曼斯菲尔德路，牛津，OX1 3QT，英国。
²英国伦敦帝国理工学院自然科学系生命科学系MRC分子细菌学和感染中心。
^三MRC分子细菌学和感染中心，传染病系，伦敦帝国理工学院，弗劳尔斯大厦，伦敦，SW7 2AZ，英国。
⁴牛津大学药理学系，牛津曼斯菲尔德路，牛津，OX1 3QT，英国。frances.platt@pharm.ox.ac.uk。

^#贡献均等。

PMID： 36085278
预防性维修识别码： PMC9463166型
内政部： 10.1038/s41467-022-32553-0

抑制Niemann-Pick C1蛋白是多株致病分枝杆菌的保守特征

余哲翁等。国家公社. 2022.

.2022年9月9日；13(1):5320.

doi:10.1038/s41467-022-32553-0。

作者

余哲翁^#¹, 黎明牧羊人^#¹, 刘毅（音）², 尼蒂亚·克里希南^三, 布莱恩·罗伯逊^三, 尼克·普拉特¹, 杰拉尔德·拉鲁伊·莫姆斯², 弗朗西斯·普拉特⁴

附属公司

¹牛津大学药理学系，牛津曼斯菲尔德路，牛津，OX1 3QT，英国。
²英国伦敦帝国理工学院自然科学系生命科学系MRC分子细菌学和感染中心。
^三MRC分子细菌学和感染中心，传染病系，伦敦帝国理工学院，弗劳尔斯大厦，伦敦，SW7 2AZ，英国。
⁴牛津大学药理学系，牛津曼斯菲尔德路，牛津，OX1 3QT，英国。frances.platt@pharm.ox.ac.uk。

^#贡献均等。

PMID： 36085278
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内政部： 10.1038/s41467-022-32553-0

摘要

结核分枝杆菌（Mtb）在宿主巨噬细胞（MΦ）内存活和复制，并破坏多种抗菌防御机制。此前，我们报道了病原分枝杆菌分泌的脂质抑制NPC1，即溶酶体储存障碍C型尼曼-匹克病（NPC）中缺乏的溶酶体膜蛋白。抑制NPC1导致溶酶体钙水平下降，阻止吞噬体-溶酶体融合，导致分枝杆菌存活。我们推测，抑制NPC1的特异性细胞壁脂质的产生可能是致病性进化的关键步骤。因此，我们研究了来自多个结核分枝杆菌谱系的临床结核分枝杆菌菌株、结核分枝杆菌复合物（MTBC）成员和非结核分枝杆菌（NTM）的脂质提取物是否抑制NPC途径。我们报告，来自结核分枝杆菌1、2、3和4系、牛分枝杆菌和非结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和禽分枝杆菌的所有临床分离物中都存在NPC途径的抑制。然而，被认为类似于MTBC共同祖先的卡内蒂分枝杆菌的脂质提取物并没有抑制NPC1途径。我们的结论是，NPC1抑制性分枝杆菌细胞壁脂质的进化在早期和分化后从卡内蒂分枝杆菌相关分枝杆菌进化而来，这种活性对疾病的促进起着重要作用。

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F.M.P.是IntraBio的顾问和联合创始人。其他作者声明没有相互竞争的利益。

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图1。能够显著增加RAW 264.7的LysoTracker™染色的分枝杆菌脂类 MΦ广泛分布于结核分枝杆菌临床菌株、结核分枝杆菌复合体（MTBC）成员和非结核分枝杆菌。
一RAW 264.7的LysoTracker™染色强度 MΦ处理100 μg/ml代表结核分枝杆菌谱系的临床结核分枝杆菌菌株、1、2和4、结核分枝杆菌复合物物种和非结核分枝杆菌的脂质提取物48 h.数据为平均值 ± 扫描电镜，N个 = 每个样品至少重复2次。统计分析，单因素方差分析****第页 <0.0001, 指示的其他显著性值。数据是三个独立实验的代表。b条RAW 264.7的平均LysoTracker™染色强度用来自结核分枝杆菌谱系1、2和4的脂质处理MΦ。数据均为平均值 ± 扫描电镜，N个 = 每个谱系测试5-7个菌株。统计分析，单因素方差分析****第页 < 0.0001，其他第页值。数据是三个独立实验的代表。**c（c）**RAW 264.7的LysoTracker™染色 MΦ处理200 来自1、2、3和4系临床结核分枝杆菌菌株的μg/ml脂质提取物*卡内蒂M*.数据为平均值 ± 扫描电镜，N个 = 每个样品至少重复3次。统计分析，单因素方差分析****第页 < 0.0001，其他第页值。数据是两个独立实验的代表。源数据作为源数据文件提供。

**图2。RAW 264.7溶酶体室的扩张 MΦ对分枝杆菌脂类（100 48μg/ml h）用LysoTracker™-红色染色进行可视化。**
一RAW 264.7的典型共焦显微镜图像 MΦ未经处理、DMSO或U18666A处理或与结核分枝杆菌临床菌株281、333、639或H37Rv的脂质提取物孵育，或*卡内蒂M*LysoTracker™-红色染色。每对的右图像是左图像中所示区域的放大倍数较高的图像。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。比例尺代表10 μm。所有图像的曝光时间是相等的，除了DMSO被指示为更长的曝光。b条量化载体或U18666A（左直方图）或DMSO和Mtb脂质或*卡内蒂M*脂质处理细胞（右直方图）。数据是手段 ± 扫描电镜，N个 = 每个样本重复4次，每个随机域至少包含50个细胞。统计分析，未配对t吨使用韦尔奇修正对DMSO和U18666A进行双尾测试；采用Dunnett检验的单因素方差分析，F类 = 1.945（二甲基亚砜或脂质处理）****第页 < 0.0001，其他第页值。数据是两个独立实验的代表。**c（c）**溶酶体直径（μm）的盒须图和溶酶体在载体或U18666A处理的RAW 264.7中的统计分布 MΦ。左直方图，数据为平均值 ± 扫描电镜，N个 = 在四个随机场中至少有100个溶酶体。二甲基亚砜：最小值：0.149 μm，最大值：0.709 μm，中心：0.377 微米；U18666A：最小值：0.216 μm，最大值：1.791 μm，中心：0.793 微米。方框包含90%的所有事件。统计分析，未配对t吨用韦尔奇修正检验，双尾****第页 < 0.0001. 所示统计分布值为中值直径（μm）。d日DMSO或脂质处理的RAW 264.7中溶酶体直径（μm）的盒须图和溶酶体尺寸的统计分布 MΦ。数据是手段 ± 扫描电镜，N个 = 在四个随机场内至少有100个溶酶体。二甲基亚砜：最小值：0.149 μm，最大值：0.709 μm，中心：0.377 微米；281:最小值：0.081 μm，最大值：0.941 μm，中心：0.470 微米；333:最小值：0.204 μm，最大值：0.975 μm，中心：0.456 微米；639：最小值：0.161 μm，最大值：1.124 μm，中心：0.436 微米；H37Rv：最小值：0.180 μm，最大值：1.052 μm，中心：0.456 微米；*卡内蒂M*：最小值：0.149 μm，最大值：1.047 μm，中心：0.383 微米。方框包含90%的所有事件。统计分析，使用Kruskal–Wallis检验的单因素方差分析，Kruskal-Wallis统计：79.61****第页 < 0.0001，其他第页值。所示统计分布值为中值直径（μm）。数据是两个独立实验的代表。源数据作为源数据文件提供。

**图3。RAW 264.7溶酶体室的扩张 MΦ对分枝杆菌脂类（100 48μg/ml h）用抗LAMP-1染色观察。**
一RAW 264.7的共焦显微镜图像 MΦ用载体或U18666A处理，并用抗LAMP-1抗体染色（绿色）。b条RAW 264.7的图像用DMSO或Mtb脂质处理的MΦ或*卡内蒂M*脂质。每对的右图像是左图像中所示区域的放大倍数较高的图像。细胞核用DAPI染色（蓝色）。比例尺代表10 微米。**c（c）**车辆或U18666A处理的RAW 264.7中LAMP-1阳性小室直径（μm）的盒须图和LAMP-1阴性小室直径的统计分布 MΦ。左直方图，数据为平均值 ± 扫描电镜，N个 = 在四个随机场中至少有100个溶酶体。二甲基亚砜：最小值：0.051 μm，最大值：1.190 μm，中心：0.446 微米；U18666A：最小值：0.216 μm，最大值：4.894 μm，中心：0.964 微米。方框包含90%的所有事件。统计分析，Mann-Whitney检验，双尾****第页 < 0.0001. 指示的统计分布，数值为中值直径（μm）。d日DMSO或脂质处理的RAW 264.7中LAMP-1阳性小室直径（μm）的盒须图和LAMP-1阴性小室直径的统计分布 MΦ。数据是手段 ± 扫描电镜，N个 = 在四个随机场中至少有100个溶酶体。二甲基亚砜：最小值：0.051 μm，最大值：1.190 μm，中心：0.446 微米；281：最小值：0.255 μm，最大值：2.243 μm，中心：0.582 微米；333:最小值：0.204 μm，最大值：2.000 μm，中心：0.560 微米；639：最小值：0.253 μm，最大值：2.247 μm，中心：0.582 微米；H37Rv：最小值：0.180 μm，最大值：2.166 μm，中心：0.600 微米；*卡内蒂M*：最小值：0.161 μm，最大值：1.232 μm，中心：0.497 微米。方框包含90%的所有事件。统计分析，使用Kruskal–Wallis检验的单因素方差分析，Kruskal-Wallis统计：87.02****第页 < 0.0001. MΦ统计分布，所示值为中值直径（μM）。数据是两个独立实验的代表。**e（电子）**RAW 264.7中LAMP-1相对转录表达的Q-PCR MΦ，归一化为β-肌动蛋白。数据均为平均值 ± 扫描电镜，N个 = 每个样品重复5次。统计分析，t吨用韦尔奇修正检验，双尾；和Mann-Whitney检验，双尾。显著性值如所示。**（f）**未经治疗、载体、U18666A和H37Rv脂质治疗的RAW 264.7中LAMP-1和β-actin蛋白表达的左侧Western blot MΦ。克与β-actin相关的LAMP-1蛋白表达的定量数据是平均值 ± 扫描电镜，N个 = 每个样品重复2次。统计分析，t吨Welch校正检验无统计学显著差异，双尾。所示数据代表了两个独立的实验。源数据作为源数据文件提供。

**图4。暴露于菌株H37Rv的脂质提取物显著增加了RAW 264.7中NPC1的表达 MΦ。**
一RAW 264.7蛋白裂解物的Western blot MΦ与载体或分枝杆菌脂类提取物孵育48 h.上带，杂交检测Npc1和下带，杂交再检测β-肌动蛋白。b条相对于载体治疗，归一化为β-肌动蛋白的Npc1蛋白带的定量。数据均为平均值 ± 扫描电镜，N个 = 2或3。统计分析，t吨用韦尔奇修正检验，双尾。第页值，否则不重要。印迹是三个独立实验的代表。源数据作为源数据文件提供。

**图5。在RAW 264.7中，结核分枝杆菌脂类诱导胆固醇部分重新分布到细胞内斑点 MΦ。**
一车辆（DMSO）或U18666A处理后RAW 264.7的共焦显微镜图像 MΦ用锉刀染色。对于每一对，右图像是左图像中轮廓区域的更高放大倍数。比例尺代表5 微米。b条载体或U18666A处理的细胞内有filipin阳性斑点的频率的定量。数据均为平均值 ± 扫描电镜，N个 = 3，每个代表随机选择字段中至少100个单元格。统计分析，未配对t吨用韦尔奇修正检验，双尾****第页 < 0.0001.c（c）RAW 264.7的共焦显微镜图像用载体（DMSO）、结核分枝杆菌菌株或*卡内蒂M*油脂被菲利宾染色。对于每一对，右图像是左图像中轮廓区域的更高放大倍数。比例尺代表5 微米。d日二甲基亚砜、结核分枝杆菌脂质或*卡内蒂M*脂质处理的细胞具有filipin阳性的胞内斑点。数据均为平均值 ± 扫描电镜，N个 = 3，每个表示随机选择的字段中的至少100个单元。统计分析，未配对t吨双尾Welch校正测试。第页如指示的值。**e（电子）**RAW 264.7胆固醇含量的安倍红定量 MΦ用载体（DMSO）或U18666A处理。数据均为平均值 ± 扫描电镜，N个 = 每个样品重复3次。统计分析，未配对t吨用韦尔奇修正检验，双尾。所示的显著性值。**（f）**RAW 264.7胆固醇含量的安倍红定量 MΦ用载体（DMSO）或分枝杆菌脂类处理。数据均为平均值 ± 扫描电镜，N个 = 5.统计分析，未配对t吨用韦尔奇修正检验，双尾。无统计学显著差异。数据是三个独立实验的代表。源数据作为源数据文件提供。

**图6。结核分枝杆菌脂类影响RAW 264.7中的GM1贩运 MΦ。**
一RAW 264.7的共焦显微镜图像 MΦ用载体（DMSO）、U18666A或分枝杆菌脂类处理，并用霍乱毒素B亚单位（绿色）脉冲相。细胞核用DAPI染色（蓝色）。对于每一对，右图像是左图像中轮廓区域的更高放大倍数。未经处理，车辆和*卡内蒂M*脂质处理的细胞显示出以高尔基体为主的染色模式，如白色箭头所示。U18666A和来自结核分枝杆菌菌株的脂类诱导形成点状模式，与溶酶体分布一致（白色箭头）。比例尺表示10 微米。b条溶酶体霍乱毒素B定位的载体和U18666A处理细胞的百分比。数据均为平均值 ± 扫描电镜，N个 = 3，每个代表随机选择字段中至少100个单元格。统计分析，未配对t吨用韦尔奇修正检验，双尾****第页 < 0.0001.c（c）溶酶体霍乱毒素B定位的载体和分枝杆菌脂质处理细胞的百分比。数据均为平均值 ± 扫描电镜，N个 = 3，每个代表每个样本在随机选择的场中的至少100个细胞。统计分析，未配对t吨用韦尔奇修正检验，双尾****第页 < 0.0001，其他第页值。数据是两个独立实验的代表。源数据作为源数据文件提供。

**图7。结核分枝杆菌脂类，但不是*卡内蒂M*脂质导致RAW 264.7中GSL积聚 MΦ。**
一来自载体（DMSO）和U18666A处理细胞的GSL的代表性HPLC示踪被标注的单个GSL峰覆盖。该表总结了U18666A引起的每个峰的面积百分比和折叠增加。b条二甲基亚砜或U18666A处理细胞中总GSL的定量。数据均为平均值 ± 扫描电镜，N个 = 每个样本重复一次。统计分析，未配对t吨用韦尔奇修正检验，双尾***第页 < 0.0007.c（c）经载体（DMSO）处理的RAW 264.7细胞提取物和结核分枝杆菌菌株的脂质提取物或*卡内蒂M*.d日二甲基亚砜或分枝杆菌脂质处理细胞中单个GSL种类和总GSL的定量。数据均为平均值 ± 扫描电镜，N个 = 每个样品重复4-5次。统计分析，未配对t吨用韦尔奇修正进行测试，双尾****第页 < 0.0001，其他第页如指示的值。源数据作为源数据文件提供。

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1. Russell DG、Cardona PJ、Kim MJ、Allain S、Altare F.泡沫巨噬细胞与人类结核病肉芽肿的进展。自然免疫学。2009;10:943–948. doi:10.1038/ni.1781。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[6] Cambier CJ、Falkow S、Ramakrishnan L.结核分枝杆菌宿主逃避和开发计划。单元格。2014;159:1497–1509. doi:10.1016/j.cell.2014.11.024。-内政部-公共医学

[7] Stewart GR，Robertson BD，Young DB。结核病：一个持续存在的问题。自然修订版微生物。2003;1:97–105. doi:10.1038/nrmicro749。-内政部-公共医学

[8] Stewart GR，Robertson BD，Young DB。结核病：一个持续存在的问题。自然修订版微生物。2003;1:97–105. doi:10.1038/nrmicro749。-内政部-公共医学

[9] Russell DG、Cardona PJ、Kim MJ、Allain S、Altare F.泡沫巨噬细胞与人类结核病肉芽肿的进展。自然免疫学。2009;10:943–948. doi:10.1038/ni.1781。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Russell DG、Cardona PJ、Kim MJ、Allain S、Altare F.泡沫巨噬细胞与人类结核病肉芽肿的进展。自然免疫学。2009;10:943–948. doi:10.1038/ni.1781。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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