EZH2 T367 phosphorylation activates p38 signaling through lysine methylation to promote breast cancer progression

doi:10.1016/j.isci.2022.104827

.2022年8月2日；25(8):104827.

doi:10.1016/j.sci.2022.104827。 eCollection 2022年8月19日。

EZH2 T367磷酸化通过赖氨酸甲基化激活p38信号传导促进乳腺癌进展

附属公司

¹密歇根大学医学院病理学系，美国密歇根州安阿伯48109。
²美国密歇根州安阿伯市密歇根大学罗杰尔癌症中心。
^三卡拉布里亚大学药学、健康和营养科学系，87036 Rende（CS），意大利。
⁴美国密歇根州安阿伯市密歇根医学院内科。
⁵美国密歇根州安阿伯市密歇根大学生物化学系。
⁶密歇根大学公共卫生学院生物统计学系，美国密歇根州安娜堡。
⁷美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院生物工程系计算与系统生物学系UPMC希尔曼癌症中心，邮编15232。
⁸美国密歇根大学电气工程与计算机科学系和生物医学工程系。

PMID： 35992062
预防性维修识别码： PMC9389258型
内政部： 2016年10月10日/j.isci.2022.104827

EZH2 T367磷酸化通过赖氨酸甲基化激活p38信号传导促进乳腺癌进展

玛丽亚·冈萨雷斯等。 i科学. 2022.

.2022年8月2日；25(8):104827.

doi:10.1016/j.isci.2022.104827。 eCollection 2022年8月19日。

附属公司

¹密歇根大学医学院病理学系，美国密歇根州安阿伯48109。
²美国密歇根州安阿伯市密歇根大学罗杰尔癌症中心。
^三卡拉布里亚大学药学、健康和营养科学系，87036 Rende（CS），意大利。
⁴美国密歇根州安阿伯市密歇根医学院内科。
⁵美国密歇根州安阿伯市密歇根大学生物化学系。
⁶密歇根大学公共卫生学院生物统计学系，美国密歇根州安娜堡。
⁷美国宾夕法尼亚州匹兹堡大学医学院生物工程系计算与系统生物学系UPMC希尔曼癌症中心，邮编15232。
⁸美国密歇根大学电气工程与计算机科学系和生物医学工程系。

PMID： 35992062
预防性维修识别码： PMC9389258型
内政部： 2016年10月10日/j.isc.2022.104827

摘要

三阴性乳腺癌（TNBCs）常分化程度低，转移倾向高。zeste同源物2（EZH2）的增强子是多梳抑制复合物2的赖氨酸甲基转移酶，它通过H3K27me3介导正常细胞和癌症中的转录抑制。然而，EZH2的H3K27me3-独立非正则函数尚未完全理解。我们报道了p38α在T367处的EZH2磷酸化以H3K27me3非依赖性方式诱导TNBC转移。在这里，我们表明，细胞溶质EZH2在赖氨酸139和165处甲基化p38α，导致p38α稳定性增强，p38甲基化和激活需要T367磷酸化EZH2。EZH2甲基转移酶和p38激酶活性的双重抑制下调pEZH2-T367、H3K27me3和p-p38通路体内减少TNBC生长和转移。这些数据揭示了EZH2规范和非规范机制之间的合作，并表明抑制这些途径可能是一种潜在的治疗策略。

关键词：癌症；表观遗传学；分子生物学。

PubMed免责声明

利益冲突声明

E.Y和Y-。C.C.就微流体技术提出了专利申请（申请号：62/449867和PCT/US2018/014353）。其他作者声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
与来自同一患者的匹配原发肿瘤相比，pEZH2-T367和p-p38在人类乳腺癌转移中显著上调（A）匹配原发性人类乳腺癌和转移瘤（n=16例患者）的代表性图像，用pEZH2-T367和p-p28（600x）进行免疫染色。与原发肿瘤相比，pEZH2-T367在转移细胞的细胞质中上调。棒材50μm。（B） pEZH2-T367蛋白表达在16例原发性乳腺癌及匹配转移中的分布；pEZH2-T367高低的原发性和转移性乳腺癌的数量。（C）乳腺原发癌和转移癌中pEZH2-T367和p-p38表达的相关性；56.75%的转移瘤同时表达pEZH2-T367和p-p38。

图2
EZH2甲基化p38α，而T367处的EZH2-磷酸化对TNBC（A）协同免疫沉淀（Co-IP）中p38α甲基化和磷酸化以及一组乳腺癌细胞中甲基化p28α的免疫印迹至关重要。EZH2 shRNA敲除降低甲基化p38α。（B）在指定条件下，对MDA-MB-231细胞的全细胞裂解物进行赖氨酸N-甲基转移酶（KMTase）活性测定。使用0.1 mg/mL人重组p38α评估KMTase活性，并通过生物发光检测S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）的产生。shEZH2和EPZ显著降低了甲基化p38α，而对照组（1–3车道）被WT-EZH2挽救（4车道）。与WT-EZH2相比，EPZ降低了甲基化p38α（车道4-5）。条形图表示平均值±SEM，*p≤0.05。（C） T4和Vari068患者来源TNBC细胞的全细胞裂解物中KMTase活性测定，对照组和EPZ治疗组，如（B）所示。条形图显示平均值±SEM，*p≤0.05。（D）用干扰shRNA（对照）或3′UTR EZH2-靶向shRNA（shEZH2）转导的MDA-MB-231细胞中甲基化p38α的IP和免疫印迹，用Myc-tagged WT-EZH2、T367A-EZH2或载体（pBabe）解救。（E）（D）中细胞的免疫印迹。

图3
EZH2使p38α蛋白在赖氨酸139和赖氨酸165处甲基化，从而提高了p38α蛋白质的稳定性（A）p38蛋白质的示意图表示，指示其功能域和甲基化位点的位置（红点）。每个结构域的氨基酸位置显示在结构下方。该表总结了通过甲基化蛋白质的LC-MS-MS分析确定的甲基化的独特位点。将重组组蛋白H3和GST-p38α与重组PRC2复合物（EZH2/EED/SUZ12/RbAp48/AEBP2）和S-腺苷蛋氨酸甲基供体在磷酸钠缓冲HMTase缓冲溶液中在37°C下孵育1小时。随后，样品在凝胶上运行，并使用胰蛋白酶或Arg-C在凝胶中消化，并通过LC-MS/MS分析单甲基化、二甲基化和三甲基化。甲基化的存在由β-和γ-离子确认。（B）在指定时间点用100μg/mL环己酰亚胺（CHX）处理MDA-MB-231 shVector和shEZH2的脉冲相分析。用抗EZH2和抗p38α免疫印迹细胞提取物。以α-管蛋白为负荷对照。（C） MDA-MB-231用载体（对照）或GSK-343（1μM）处理48小时，并在指定时间点用100μg/mL的环己酰亚胺（CHX）处理的脉冲追逐分析。用抗EZH2和抗p38α免疫印迹细胞提取物。以α-管蛋白为负荷对照。（D）将HA标记的p38α野生型和p38α突变体K139A、K165A和K139A/K165A转导到MDA-MB-231细胞中，并使用抗p38α和抗泛甲基K抗体进行IP和WB处理。肌动蛋白作为负荷控制。（E）（D）中细胞的CHX脉冲相分析。（F）泛素化分析。用蛋白酶体抑制剂MG-132（50μM）处理受试细胞5小时或溶媒。随后用抗磁性A珠对全细胞提取物进行免疫沉淀，然后使用泛素和p38α抗体进行免疫印迹。（G）用HA标记的p38α野生型和p38α突变体K139A、K165A和K139A/K165A转导MDA-MB-231细胞的侵袭试验。比例尺，10μm。条形图显示平均值±SEM，*p≤0.05。

图4
联合药物阻断EZH2和p38酶活性可降低经GSK-343（3μM，48 h）、SB202190（p38i，20μM，48h）或联合治疗的MDA-MB-231细胞的肿瘤功能（A）免疫印迹。（B）对A中的细胞进行生长分析。（C） EZH2抑制剂和p38抑制剂在与不同剂量的GSK-343和SB202190孵育4d的MDA-MB-231细胞中的协同作用。计算协同评分矩阵（Ianevski等人，2017）。（D和E）伤口愈合试验，以量化细胞迁移（D）和MDA-MB-231细胞的重建Boyden基底膜侵入室试验，如（A）所述。水晶紫染色后的代表性腔室如图所示。B-E的数据来自至少三个独立实验，至少一式三份。B、（D和E）的数据表示为平均值±SEM。*p≤0.05；**p≤0.01p≤0.005p≤0.0001。

图5
EZH2和p38酶活性联合靶向降低原发性乳腺癌生长和转移（A）原位移植MDA-MB-231细胞的NOD/SCID小鼠的原发性肿瘤生长曲线。当原发肿瘤达到100毫米时^三，小鼠腹腔注射EPZ-6438（10 mg/kg/天）、SB202190（p38i，1 mg/kg/日）、联合或对照（4%DMSO-30%PEG 300-5%Tween 80），每周5天，共56天（n=10/组）。通过卡尺测量评估原发性肿瘤生长，显示为平均值±SEM。（B）第56天肿瘤体积的量化显示为平均值±SEM。（C）将MDA-MB-231细胞在裸鼠（n=10/组）中进行心内注射，并按（A）中的方法处理3周。条形图显示心脏接种后第21天各组小鼠的转移数量±SEM。（D）肺转移瘤的典型H&E染色切片。放大600倍。比例尺50μm。（E）来源于（A）的原发性MDA-MB-231异种移植瘤的全细胞裂解物中甲基化p38α的共免疫沉淀和免疫印迹。（F）从（A）中的MDA-MB-231原代原位异种移植物获得的裂解液中指示蛋白质的免疫印迹。对于A-C，*p≤0.05；**p≤0.01p≤0.005；***p≤0.0001。

图6
联合抑制EZH2甲基转移酶和p38激酶活性降低AKT信号体内（A）用EPZ-6438（10 mg/kg/天）、SB202190（p38i，1 mg/kg/日）、联合或对照（4%DMSO-30%PEG 300-5%Tween 80）治疗并在第56天切除的乳腺肿瘤的RNA测序研究。该图显示了EPZ/p38i与对照组的组合显著解除了对通路的管制。（B）按（A）所示处理的原代异种移植物的免疫印迹。组合EPZ/p38i减少第页-AKT与单一抑制剂的比较。（C）用HA标记的WT-p38α、K139A-p38α、K_（165A-p38）α和K_（139A）/K_（65A）-p38α转导的MDA-MB-231细胞中pAKT和总AKT的免疫印迹。与WT-P38α相比，P38α突变体的pAKT水平降低。（D）用Myc-tagged WT-EZH2、T367A-EZH2或载体（pBabe）拯救的MDA-MB-231 EZH2-KD的免疫印迹表明，T367磷酸化是上调pAKT1而不改变总AKT1的必要条件。（E）人类原发性浸润性癌的代表性图像。病例1显示为浸润性高级别导管癌，具有一致的高细胞pEZH2-T367和高pAKT，而病例2显示为中等程度浸润性癌，两种蛋白均低表达。棒材，50μm。（F）示意图说明了我们通过H3K27me3依赖性和独立活动在乳腺癌中EZH2功能的工作模型。P和Me分别代表磷酸化和甲基化。

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