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.2022年6月24日2022:4201287。
doi:10.1155/2022/4201287。 eCollection 2022年。

PLK3通过阻断ATM/P53介导的DNA损伤反应抑制肾缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞凋亡

邓伟明 1 2, 魏香玲 1, 谢振伟 1, Rui Zhang（张瑞） 1, 詹文东 1, 张金华（Jinhua Zhang） 1, 游洛 1, 青帝城 1, 王若乔 1, Heng Li（李恒） 1, 宁娜 1
附属公司

PLK3通过阻断ATM/P53介导的DNA损伤反应抑制肾缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞凋亡

邓伟明等。 氧化介质细胞Longev. .

摘要

目标：肾缺血再灌注（I/R）损伤是移植肾急性肾损伤（AKI）的主要原因。本研究旨在探讨PLK3（polo-like kinase 3）在肾I/R损伤中的作用，重点研究其与氧化应激诱导的DNA损伤和肾小管上皮细胞（TEC）凋亡的关系。

方法：使用GEO2R分析来自开发数据集GSE52004和验证数据集GSE121191的TRAP-seq数据。PLK3过表达质粒和靶向沉默siRNA用于缺氧/复氧（H/R）损伤模型，并对暴露于I/R损伤的C57BL/6J小鼠给予rAAV-9-PLK3-KD。使用ATM特异性抑制剂KU-60019阻断DNA损伤反应（DDR）。Western blotting检测DDR和凋亡相关蛋白的表达。细胞活力用CCK-8试剂检测，凋亡用流式细胞仪和TUNEL法检测。此外，荧光探针H2用DCFH-DA和DHE测定体外ROS生成。测定MDA水平和SOD活性以评估体内氧化应激。KIM-1染色、Scr和BUN用于评估肾损伤。

结果：在H/R损伤和I/R损伤模型中，PLK3的mRNA和蛋白水平显著升高。GO术语表明，PLK3主要参与肾I/R损伤后的氧化应激和DNA损伤。PLK3的过度表达降低了细胞活力，增加了细胞凋亡。相反，靶向沉默PLK3表达通过降低P53磷酸化降低Bax/Bcl-2比率，从而减少TEC凋亡。此外，KU-60019降低了PLK3激活和DDR诱导的凋亡，而PLK3的过度表达逆转了KU-60029对TEC凋亡的缓解作用。同样，rAAV-9-PLK3 KD小鼠在I/R损伤后表现出较低的TEC凋亡率和较轻的肾损伤。

结论：我们首次证明PLK3参与肾I/R损伤中氧化应激诱导的DNA损伤和TEC凋亡。通过阻断ATM/P53介导的DDR，抑制PLK3可减轻I/R损伤后TEC的凋亡。因此，PLK3可能成为缺血性AKI的潜在治疗靶点。

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所有作者都声明他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
肾TEC中PLK3表达的生物信息学分析。（a） 热图显示上调和下调DEG的表达水平（GSE52004）。（b） WT小鼠TRAP-seq分析中前5个上调的DEGs。（c） 肾I/R损伤24小时后四个不同细胞亚群中PLK3的表达水平。（d） 肾I/R损伤后TRAP-seq验证数据集（GSE121191）中PLK3的表达水平。（e） PLK3在来源于人类蛋白图谱（GSE131685）的正常肾脏TEC的单细胞RNA-seq数据中的表达水平。（f） 气泡图显示IRI与假（TRAP-WT）DEG中PLK3相关生物过程的富集GO项。（g） 气泡图显示IRI与假（TRAP肾病）DEG中PLK3相关生物过程的富集GO项。数据表示为平均值±SD。n个= 3.∗P（P）< 0.05.
图2
图2
在暴露于H/R损伤的TEC和暴露于I/R损伤的肾脏中，PLK3表达上调。（a） 采用实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测不同时间段缺氧和复氧后HK-2细胞中PLK3 mRNA的水平。（b） 采用Western blot检测不同缺氧时间和相同复氧时间后PLK3蛋白水平。（c） 相同缺氧时间和不同复氧时间后PLK3蛋白水平。（d） 在缺血30分钟和不同再灌注时间（6小时、12小时和24小时）后，检测I/R暴露的C57BL/6J小鼠肾脏中PLK3 mRNA的水平。（e） 免疫荧光法观察不同再灌注时间后PLK3蛋白水平（bar=50μM；放大400倍）。（f） 测定不同再灌注时间后PLK3蛋白水平。（g-h）不同再灌注时间后肌酐和BUN水平。数据表示为平均值±SD。n个≥ 3.∗P（P）< 0.05,∗∗P（P）< 0.01,∗∗∗P（P）<0.001，以及∗∗∗∗P（P）< 0.0001. BUN：血尿素氮；H24R3：缺氧24小时，再灌注3小时；Rep24：缺血30分钟，再灌注24小时。
图3
图3
PLK3过度表达促进H/R损伤引起的TEC凋亡。（a和b）用pcDNA3.1-flag-PLK3质粒转染后PLK3 mRNA和蛋白表达的定量分析和代表性Western blot图像。（c） 用CCK-8试剂检测H/R损伤后转染质粒的HK-2细胞的存活率。（d） 流式细胞仪结果的代表图显示了凋亡人群和凋亡率的定量分析。（e） TUNEL染色测量凋亡过程中的DNA片段（bar=50μM；放大倍数，400x）。数据表示为平均值±SD。n个= 3.∗P（P）< 0.05,∗∗P（P）< 0.01,∗∗∗P（P）<0.001，以及∗∗∗∗P（P）< 0.0001.
图4
图4
PLK3表达的靶向沉默减少了H/R诱导的TEC细胞凋亡。（a） 用100 nM PLK3-siRNA或干扰寡核苷酸（si-NC）转染后PLK3 mRNA表达的qRT-PCR分析。（b） PLK3沉默效率的免疫印迹分析。（c） 用CCK-8法测定HK-2细胞的活性。（d） 流式细胞术检测HK-2细胞凋亡。（e） PLK3沉默后显示TUNEL阳性HK-2细胞的代表性图像（bar=50μM；放大400倍）。数据表示为平均值±SD。n个= 3.∗P（P）< 0.05,∗∗P（P）< 0.01,∗∗∗P（P）<0.001，以及∗∗∗∗P（P）< 0.0001.
图5
图5
在TEC的H/R损伤和小鼠肾脏的I/R损伤过程中，可诱导氧化应激和DDR。HK-2细胞常压或缺氧24小时/复氧6小时。C57BL/6J雄性小鼠假手术或双侧肾缺血30分钟，然后再灌注24小时。（a和b）分析肾皮质匀浆中的MDA水平和SOD活性。（c和d）H的流式细胞术分析2进行DCFH-DA染色和DHE染色的细胞荧光分析，以测量H/R治疗后细胞ROS生成水平（bar=50μM；放大400倍）。（e） 免疫荧光染色的代表性图像γTEC中的H2AX（bar=50μM；放大400倍）。（f） 用Western blot检测H/R损伤后DNA损伤相关蛋白的表达。（g） H中PLK3 mRNA水平2哦2-诱导氧化应激模型。（h） h后PLK3蛋白水平2哦2刺激。数据以平均值±标准差表示。n个= 3.∗P（P）< 0.05,∗∗P（P）< 0.01,∗∗∗P（P）<0.001，以及∗∗∗∗P（P）< 0.0001. DHE：二氢乙炔；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶。
图6
图6
抑制PLK3通过ATM/P53信号通路减弱TEC凋亡。（a） 在H/R损伤模型中，在PLK3表达的靶向KD后测量PLK3蛋白水平和凋亡相关蛋白水平。（b） 应用特异性ATM抑制剂KU-60019后，通过Western blot测定p-ATM蛋白水平、PLK3蛋白水平和凋亡相关蛋白水平。数据表示为平均值±SD。n个= 3.∗P（P）< 0.05,∗∗P（P）< 0.01,∗∗∗P（P）<0.001，以及∗∗∗∗P（P）< 0.0001. Nor：氧正常；库：Ku-60019。
图7
图7
PLK3过表达逆转ATM抑制减轻TEC凋亡的作用。（a） 应用KU-60019和PLK3质粒后，通过Western blot检测p-ATM蛋白水平、PLK3蛋白水平和凋亡相关蛋白水平。（b） 流式细胞术检测给予KU-60019和PLK3质粒后HK-2细胞的凋亡情况。（c） TUNEL分析显示凋亡的HK-2细胞数量。数据表示为平均值±SD。n个= 3.∗P（P）< 0.05,∗∗P（P）< 0.01,∗∗∗P（P）<0.001，以及∗∗∗∗P（P）< 0.0001.
图8
图8
rAAV-9介导的PLK3 KD可减弱I/R诱导的小鼠AKI。（a） 动物实验设计示意图。（b和c）血清肌酐和BUN分析。（d） 肾组织切片用H&E染色，并量化肾小管损伤；免疫组织化学检测KIM1的表达（bar=50μM；放大400倍）。数据表示为平均值±SD。n个≥ 3.∗P（P）< 0.05,∗∗P（P）<0.01，以及∗∗∗∗P（P）< 0.0001.
图9
图9
rAAV-9介导的PLK3-KD减轻I/R诱导的小鼠TEC凋亡。（a） 通过免疫荧光分析检测PLK3的表达；对细胞凋亡进行TUNEL分析（巴=50μM；放大400倍）。（b） PLK3和凋亡相关蛋白表达水平的Western blot分析。数据表示为平均值±SD。n个≥ 3.∗P（P）< 0.05,∗∗P（P）< 0.01,∗∗∗P（P）<0.001，以及∗∗∗∗P（P）< 0.0001.
图10
图10
PLK3调节DNA损伤后TEC凋亡以应对氧化应激的拟议机制的示意图。肾脏I/R损伤导致严重的氧化应激，ROS攻击双链DNA，导致DSB，DSB激活ATM/PLK3/P53信号通路以响应DNA损伤，触发依赖P53的下游凋亡级联，从而促进TEC凋亡。
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