Establishment of mouse model of inherited PIGO deficiency and therapeutic potential of AAV-based gene therapy

doi:10.1038/s41467-022-30847-x

.2022年6月3日；13(1):3107.

doi:10.1038/s41467-022-30847-x。

遗传性PIGO缺乏小鼠模型的建立及基于AAV的基因治疗潜力

附属公司

¹日本大阪大阪大学微生物疾病研究所，Yabumoto难治性疾病研究部。
²日本大阪大阪大学医学研究生院儿科。
^三大阪大学前沿生物科学研究生院，日本大阪。
⁴日本大阪，大阪大学工程科学研究生院。
⁵大阪大学高级共创研究所，日本大阪。
⁶日本大阪国家信息与通信技术研究所（NICT）和大阪大学信息与神经网络中心。
⁷日本大阪大阪大学量子信息和量子生物学中心。
⁸日本大阪大阪大学微生物疾病研究所实验基因组研究部。
⁹日本京都大学灵长类研究所神经科学系系统神经科学科。
¹⁰日本神户阿苏比奥制药有限公司。
¹¹免疫糖生物学，WPI免疫学前沿研究中心，大阪大学，日本大阪。
¹²日本大阪大阪大学微生物疾病研究所，Yabumoto难治性疾病研究部。yoshiko@biken.osaka-u.ac.jp。

PMID： 35661110
预防性维修识别码： PMC9166810型
内政部： 10.1038/s41467-022-30847-x

遗传性PIGO缺乏小鼠模型的建立及基于AAV的基因治疗潜力

久山良子等。国家公社. 2022.

.2022年6月3日；13(1):3107.

doi:10.1038/s41467-022-30847-x。

附属公司

¹日本大阪大阪大学微生物疾病研究所，Yabumoto难治性疾病研究部。
²日本大阪大阪大学医学研究生院儿科。
^三大阪大学前沿生物科学研究生院，日本大阪。
⁴大阪大学工程科学研究生院，大阪，日本。
⁵大阪大学高级共创研究所，日本大阪。
⁶日本大阪国家信息与通信技术研究所（NICT）和大阪大学信息与神经网络中心。
⁷日本大阪大阪大学量子信息和量子生物学中心。
⁸日本大阪大阪大学微生物疾病研究所实验基因组研究部。
⁹日本京都大学灵长类研究所神经科学系系统神经科学科。
¹⁰日本神户阿苏比奥制药有限公司。
¹¹免疫糖生物学，WPI免疫学前沿研究中心，大阪大学，日本大阪。
¹²日本大阪大阪大学微生物疾病研究所，Yabumoto难治性疾病研究部。yoshiko@biken.osaka-u.ac.jp。

PMID： 35661110
预防性维修识别码： PMC9166810型
内政部： 10.1038/s41467-022-30847-x

摘要

遗传性糖基磷脂酰肌醇（GPI）缺乏症（IGD）是由GPI生物合成基因突变引起的。其全身症状，尤其是神经症状的机制尚未阐明，基础治疗尚未建立。在这里，我们报道了由PIGO突变引起的IGD小鼠模型的建立以及有效基因治疗的发展。由于IGD的临床表现是全身性的，并且是终身持续的，我们用腺相关病毒治疗小鼠，以检测Pigo cDNA的同源非依赖性敲除和胞外表达。神经元表型和生长缺陷的显著改善为IGD的治疗开辟了新途径。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**图1。三个品系的基因分型猪KI和KO小鼠，并通过粒细胞流式细胞术和血清ALP水平确认其表型。**
一,b条的基因分型猪用引物1（P1）和引物2（P2）进行PCR，然后用SalI进行消化。KI等位基因的PCR产物对SalI敏感，显示1021 bp和761 bp的条带。**c（c）**的基因分型猪用引物3（P3）和引物4（P4）进行PCR，然后用FspI进行消化。用831 bp和665 bp的FspI消化PCR产物检测KI等位基因。一–**c（c）**，代表性结果来自至少三次重复实验。d日的结构猪-KO等位基因，这是由于A系KI过程中同源重组失败而产生的。**e（电子）**的基因分型猪用P1、P2和引物5（P5）对B系KIKO小鼠进行PCR。SalI-酶切PCR产物分别检测到878 bp和761 bp的KO等位基因。这是至少三次重复实验的代表性结果。**（f）**血粒细胞表面Gr-1表达水平的降低猪^b/b和猪^b/−老鼠。显示了各组小鼠的平均值±SEM。n个动物数量***第页 < 0.001. (t吨-测试，双面，对-野生值：KIhomo，6.9×10⁻⁵；野生：KIKO，2.8×10⁻⁶).克在猪^b/b和猪^b/−老鼠。在4个月以上的小鼠血浆中测量ALP活性。显示了各组小鼠的平均值±SE。n个动物数量*第页 < 0.05; ***第页 < 0.001. (t吨-测试，双面，对-野生值：KIhomo，0.035；野生：KIKO，1.1×10⁻⁸)源数据作为源数据文件提供。

**图2。表型猪KI和KIKO小鼠。**
一三个KI组每周体重的比较(猪A线、B线和C线）。数据以平均值+SD表示。b条三个KIKO组每周体重的比较(猪A线、B线和C线）。数据以平均值+SD表示。**c（c）**Kaplan–Meier生存曲线猪A系（左）、B系（中）和C系（右）的KI和KIKO小鼠。n个动物数量。d日KI组和KIKO组的震颤比较(猪A线、B线和C线）。**e（电子）**典型脑电图记录*皮戈牌手表*纯合子KI小鼠。显示中背景活动的图像猪KI小鼠及其野生型对照组（每只，n个 = 3). 横杆，发作间期癫痫样放电猪^账户和猪^b/b老鼠。单次注射低剂量PTZ（20 mg/kg）（每次，n个 = 3).（f）体内T₂加权脑MRI猪^b/−小鼠与其杂合子KO同窝伙伴（雄性、，猪^b/−,n个 = 2;猪^+/−,n个 = 2). 垂体（红色箭头）在猪^b条/-小鼠（放大图像如补充图6d所示）。源数据作为源数据文件提供。

**图3。体外HITI-TE方法的效果。**
一HITI-TE示意图。（顶部）供体载体pAAV-mPigoHITIgRNA，包含U6启动子驱动的gRNA（浅蓝色框）和猪cDNA（浅米色方框，5′和3′UTR；绿色方框，编码区）夹在倒gRNA靶序列（蓝色五边形）中间；粗箭头，矢量臂。（中）突变体的一部分猪基因。白盒和灰盒，5′UTR和外显子编码区；细线、上游调控区和内含子；红色X，突变；蓝色五边形，gRNA靶序列；红色直箭头，Cas9解理位点。（下图）靶向突变体猪基因。Cas9在突变基因的靶位点和供体载体的反向靶位点诱导双链断裂。维修后，功能猪以Cas9/gRNA抗性的方式将cDNA插入靶位点。b条pAAV-mPigoHIgRNA供体转染GPI-锚定蛋白表达的恢复*PIGO公司-*KO HEK293细胞。两天后，通过流式细胞术分析CD59的表达。来自三个独立实验的代表性数据。**c（c）**左面板，感染AAV-PHP.eB-mPigoHITIgRNA后GPI-锚定蛋白表达的恢复*PIGO公司-*KO HEK293细胞。两天后，用流式细胞仪分析CD59的表达。右侧面板，EGFP表达显示转导效率。来自两个独立实验的代表性数据。d日FACS分析CD24的恢复表达，GPI-AP猪-通过基因编辑敲除Neuro2a。猪-通过脂质体转染pAAV-nEFCas9（pAAVCas9）和pAAV-mPigoHITIgRNA转染敲除的Neuro2a。两天后，用FACS分析细胞。**e（电子）**通过基因组PCR验证Neuro2a细胞中正确的基因组编辑(d日). PCR方案如补充图12a所示。星号表示非特定带。该结果是至少三次重复实验的代表性数据。**（f）**5′结（*in）的序列分析一)和3′接头（**英寸一)在转染的Neuro2a细胞中整合位点。

**图4。GPI-AP生物合成的改进及其表型猪^b/b和猪^b条/-基因治疗后的小鼠。**
一来自*皮戈牌手表*^b/bAAV治疗后4个月的小鼠与未治疗的小鼠进行比较。n个动物数量；ns不显著。数据表示为平均值+SEM(t吨-测试，双面）。b条改善高磷血症。(**第页 < 0.01). 数据表示为平均值+SEM(t吨-测试，双面，对-值，5.5×10⁻³).c（c）两个治疗组的生长均得到改善猪^b/b小鼠和猪^b条/-老鼠。对-的值猪^b/b:猪^b/b+男性HITI，第页 < 9–12周时为0.05，第页 < 13–18周时为0.01。对-的值猪^b条/-:猪^b条/-+男性HITI，第页 < 0.05英寸5-16w^, 第页 < 0.01英寸8w和13w，第页 < 7周时为0.001；在女性中，HITI治疗组和未治疗组的基因型在统计学上均不显著。数据以平均值+SD表示。d日HITI-TE治疗与未治疗的视觉比较猪^b/b鼠标。**e（电子）**HITI-TE治疗与未治疗后肢扣带的比较*皮戈牌手表*^b/b老鼠。**（f）**HITI-TE治疗和未治疗患者的震颤严重程度猪^b/b老鼠。得分1-5；得分1，最轻微；得分5分，最严重^.数据以平均值+SD表示。克HITI-TE治疗组和未治疗组悬吊试验的跌倒潜伏期比较猪^b/b老鼠**第页 < 0.01; ***第页 < 0.001 (t吨-测试，双面，对-值，KIhomo：KIhomo+AAV，6.3×10⁻³；KIKO:KIKO+AAV，1.0×10⁻⁴)数据以平均值+SEM表示。源数据以源数据文件的形式提供。

**图5。HITI介导的系统注射基因组编辑猪b/b小鼠。**
一的示意图猪HITI供者编辑KI等位基因b（T130N，c.389 c>A）基因组。在由NHEJ介导的HITI介导的基因组编辑之后猪将包含校正突变的全编码cDNA插入突变外显子1上游的5'UTR。蓝色五边形，Pigo外显子1 gRNA靶序列猪5英尺UTR。蓝色五边形内的红色箭头或黑线，Cas9解理位点。红色和蓝色箭头，PCR引物。b条通过基因组PCR验证大脑中正确的基因组编辑（27周龄小鼠）。星号显示非特异性带。该结果是至少三次重复实验的代表性数据。**c（c）**HITI-TE治疗脑内整合位点5′连接区序列分析猪^b/b老鼠。d日HITI-TE治疗的肝和脑整合位点3′连接的序列分析猪^b/b老鼠。

**图6。HITI-TE治疗的5′RACE分析猪^b/b小鼠和HITI-TE转染的Neuro2a细胞。**
一四个或五个不同来源的示意图猪系统注射用于HITI-TE介导的基因纠正策略的AAV后生成的转录物。AAV-mPigoHITIgRNA包括猪cDNA并可能表达野生型猪mRNA通过ITR的启动子活性。供体通过HITI靶向整合导致野生型表达猪信使核糖核酸。供体的非靶向整合捕获整合位点的转录本并作为融合基因表达。或者，在非靶基因和猪cDNA也产生融合基因。捕获的外显子包括源于AAV的猪，外源性猪并通过5′RACE和测序确定未知脱靶基因。蓝色半箭头，5′RACE的PCR引物。b条各种类型的百分比猪HITI TE处理的脑和肝RNA转录物猪^b/b小鼠（#11013；28周龄，#11762；27周龄）和图3d中HITI转染的Neuro2a细胞。转录物种的起源：蓝色，突变猪等位基因b条；橙色，野生型猪来自胞外AAV供体；红色，野生型猪来自校正的基因组猪位点；灰色，偏离目标猪转录本或转剪接产物。显示了各自转录物种的百分比。序列5′RACE产品的数量(n个)如图所示。源数据作为源数据文件提供。

**图7。AAV供体体内外单次给药的效果。**
一猪-用pAAVCas9和pAAV供体（pAAV-mPigoHITIgRNA）或仅用pAAV供体转染KO Neuro2a细胞，并通过FACS随时间分析以测量恢复的群体。%CD24阳性细胞的数量如右图所示。b条HITI治疗组（AAVCas9和AAV供体）和AAV供者治疗组的生长比较*皮戈牌手表*^b/−老鼠。数据以平均值+SD表示。**c（c）**来自猪^b/−HITI治疗或AAV供体治疗后4个月的小鼠猪^b/−老鼠。n个动物数量，ns不显著。(*第页 < 0.05）(*t吨-*测试，单侧，对-值，KIKO:KIKO+HITI，0.035；KIKO:KIKO+Pigo，0.035）数据表示为平均值+SEM。d日改善高磷血症。(*第页 < 0.05; **第页 < 0.01）数据表示为平均值+SEM(t吨-测试，双面，对-值，KIKO:KIKO+HITI，5.5×10⁻³；KIKO:KIKO+Pigo，0.029）。**e（电子）**仅对5 mm（左）和11 mm（右）的AAV供者进行处理，提高了悬挂试验的性能猪^b/b小鼠与HITI治疗的小鼠的比较猪^b/b老鼠。数据表示为平均值+SEM(t吨-测试，双面）。**（f）**仅接受AAV治疗的供体出现震颤严重程度评分猪^b/b小鼠和HITI治疗猪^b/b五个月大的老鼠(t吨-测试，单侧，对-值0.034）。数据以平均值+SEM表示。源数据以源数据文件的形式提供。

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1. Kinoshita T.哺乳动物GPI锚定蛋白的生物合成和生物学。打开Biol。2020年；10:190290. doi:10.1098/rsob.190290。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Almeida AM等。PIGM启动子亚型突变导致遗传性糖基磷脂酰肌醇缺乏。《国家医学杂志》，2006年；12:846–851. doi:10.1038/nm1410。-内政部-公共医学
1. Krawitz PM等。外显子组序列数据的身份逐代过滤可识别高磷血症精神发育迟滞综合征中的PIGV突变。自然遗传学。2010;42:827–829. doi:10.1038/ng.653。-内政部-公共医学

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[1] UniProt C.UniProt：蛋白质信息中心。核酸研究2015；43：D204–D212。doi:10.1093/nar/gku989。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[3] Kinoshita T.糖基磷脂酰肌醇的生物合成和缺陷。程序。日本。阿卡德。序列号。B物理。生物科学。2014;90:130–143. doi:10.2183/pjab.90.130。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[4] Kinoshita T.糖基磷脂酰肌醇的生物合成和缺陷。程序。日本。阿卡德。序列号。B物理。生物科学。2014;90:130–143. doi:10.2183/pjab.90.130。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[5] Kinoshita T.哺乳动物GPI锚定蛋白的生物合成和生物学。打开Biol。2020年；10:190290. doi:10.1098/rsob.190290。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[6] Kinoshita T.哺乳动物GPI锚定蛋白的生物合成和生物学。打开Biol。2020年；10:190290. doi:10.1098/rsob.190290。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Almeida AM等。PIGM启动子亚型突变导致遗传性糖基磷脂酰肌醇缺乏。《国家医学杂志》，2006年；12:846–851. doi:10.1038/nm1410。-内政部-公共医学

[8] Almeida AM等。PIGM启动子亚型突变导致遗传性糖基磷脂酰肌醇缺乏。《国家医学杂志》，2006年；12:846–851. doi:10.1038/nm1410。-内政部-公共医学

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