Single-cell characterization of malignant phenotypes and microenvironment alteration in retinoblastoma

doi:10.1038/s41419-022-04904-8

.2022年5月6日；13(5):438.

doi:10.1038/s41419-022-04904-8。

视网膜母细胞瘤恶性表型和微环境改变的单细胞特征

程武¹, 杨佳琦^#¹, 魏晓^#¹, 泽杭江¹, 陈淑霞¹, 郭殿雷¹, 张萍（Ping Zhang）¹, 刘春桥¹, 杨华生², 致谢^三

附属公司

¹中山大学中山眼科中心眼科国家重点实验室，广州，中国。
²中山大学中山眼科中心眼科国家重点实验室，广州，中国。yanghs64@126.com。
^三中山大学中山眼科中心眼科国家重点实验室，广州，中国。zhi.xie@outlook.com。

^#贡献均等。

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视网膜母细胞瘤恶性表型和微环境改变的单细胞特征

程武等。细胞死亡病. 2022.

.2022年5月6日；13(5):438.

doi:10.1038/s41419-022-04904-8。

作者

程武¹, 杨佳琦^#¹, 魏晓^#¹, 泽杭江¹, 陈淑霞¹, 郭殿雷¹, 张萍（Ping Zhang）¹, 刘春桥¹, 杨华生², 致谢^三

附属公司

¹中山大学中山眼科中心眼科国家重点实验室，中国广州。
²中山大学中山眼科中心眼科国家重点实验室，广州，中国。yanghs64@126.com。
^三中山大学中山眼科中心眼科国家重点实验室，广州，中国。zhi.xie@outlook.com。

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摘要

视网膜母细胞瘤（RB）是儿童最常见的原发性眼内恶性肿瘤。众所周知，肿瘤微环境（TME）调节肿瘤的发生和转移。然而，RB的恶性进展是如何由肿瘤细胞和TME的异质性决定的，目前尚不明确。在此，我们对RB患者进行了完整的单细胞转录组和全基因组测序分析，并进行了详细的病理和临床测量。通过单细胞转录组测序，我们从7名RB患者的肿瘤样本中提取了约70000个细胞。我们确定RB中的主要细胞类型是锥状前驱体样（CP样）和MKI67+锥状前体（MKI67+CP）细胞。通过整合拷贝数变异（CNV）分析，我们发现RB样本具有较大的克隆异质性，其中恶性MKI67+CP细胞的拷贝数变化显著较大。富集分析表明，类CP转化为MKI67+CP导致感光细胞功能丧失，细胞增殖能力增强。RB中的TME由肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、星形胶质细胞样细胞和肿瘤相关成纤维细胞（CAF）组成。特别是在侵袭过程中，TAM创造了一个免疫抑制环境，其中TAM的比例降低，M1型巨噬细胞丢失，TAM相关的免疫功能受到抑制。最后，我们确定TAM通过GRN和MIF信号通路调节肿瘤细胞，而TAM在侵袭过程中通过抑制CCL和GALECTIN信号通路进行自我调节。总之，我们的研究创建了一个详细的RB转录组图，其中包含恶性表型的单细胞特征，并为RB的发生和发展提供了新的分子见解。

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利益冲突声明

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**图1。RB中的单细胞表达图。**
A类工作流程概述。B类RB中细胞簇（左）和细胞类型（右）的U-MAP可视化。CRB中细胞类型平均基因表达的PCA。D类RB中已知标记基因的表达热图。E类RB中不同细胞类型的细胞比例；F类每个细胞类型中七个供体RB样本的表示。

**图2。克隆异质性定义了RB恶性细胞。**
A类U-MAP显示约4000个按细胞类型着色的视网膜细胞。B类通过CCA整合后RB和视网膜细胞按细胞类型着色的U-MAP可视化。右侧面板中的红色背景代表正常视网膜细胞类型，黄色代表肿瘤细胞类型。C基于scRNA-seq和WES推断CNV的染色体景观。x轴表示染色体区域，y轴表示样本，颜色表示CNV水平。顶部是正常视网膜的拷贝数（参考），中间是RB样本的拷贝数，底部是从WES推断出的CNV。D类Chr1p、Chr6q和Chr16p上锥状、CP状、MKI67+CP的CNV水平的方框图，每个簇中的所有细胞在同一段上平均。E类Chr1p、Chr6q和Chr16p上RB细胞类型的CNV水平。F类方框图显示了视网膜和RB细胞类型中KIF14、E2F3、MYCN、OTX2、DDX1和DEK的CNV水平。

**图3。RB恶性细胞的细胞多样性。**
A类显著差异表达基因的热图（左）和主要细胞类型的功能富集（右）。B类锥相关簇的细胞周期状态。C锥相关簇的发育假时间，根据细胞类型着色。

**图4。人类RB中微环境的调节。**
A类C15簇细胞（胶质细胞）的u-MAP可视化。B类巨噬细胞和星形胶质细胞之间10个差异表达基因的热图。C根据临床病理信息分类的侵入性（橙色）和非侵入性（绿色）样本之间TAM比例的散点图。D类不同样品中TAM比例的方框图；E类侵袭组和非侵袭组M1和M2型相关基因平均表达水平的方框图（左）；侵袭组和非侵袭组CD86和CD163表达水平的小提琴图（右）。F类免疫组织化学法检测RB FFPE切片中TAM细胞标记物CD68、M1型CD86和M2型CD163的表达。左边是侵入样本，右边是非侵入样本（原始放大倍数，×50）。**G公司**侵入性和非侵入性样本中差异表达基因的火山图。**H（H）**侵袭性和非侵袭性样本TAM的功能差异。

**图5。RB肿瘤中的细胞间和分子相互作用。**
A类热图显示了16种细胞类型中传出信号通路（左）和传入信号通路（右）的相对强度。颜色表示相对信号强度。顶部的彩色条形图通过汇总热图中显示的所有信号通路来显示细胞类型的总信号强度。右侧的灰色条形图通过汇总热图中显示的所有细胞类型，显示了信号通路的总信号强度。B类这个弦图显示了TAM配体和其他细胞类型受体之间的特定连接。颜色代表不同的单元类型，线条的粗细代表连接的强度。C该和弦图显示了TAMs介导的信号通路网络，包括GRN、MIF、SPP1、PSAP、CCL和GALECTIN信号网络。D类小提琴图显示了GRN、MIF、SPP1和PSAP信号通路相关配体和受体在16种细胞类型中的表达。E类小提琴图显示了16种细胞类型中CCL和GALECTIN信号通路相关基因的表达。F类小提琴图显示了侵袭组和非侵袭组CCL和GALECTIN信号通路相关基因的表达。**G公司**CD68（TAM标记基因）、GALECTIN信号相关配体LGALS9和受体PTPRC（CD45）在侵袭性和非侵袭性RB样本的FFPE切片中的表达（原始放大倍数×50）。

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