Optogenetic activators of apoptosis, necroptosis, and pyroptosis

doi:10.1083/jcb.202109038

.2022年6月6日；221（6）：e202109038。

doi:10.1083/jcb.202109038。 Epub 2022年4月14日。

凋亡、坏死和热解的光生激活剂

凯特琳娜·什卡琳娜¹, 伊娃·哈塞尔·德·卡瓦略², 何塞·卡洛斯·桑托斯¹, 萨拉·拉莫斯¹, 玛丽亚·莱普汀², 彼得·布罗兹¹

附属公司

PMID： 35420640
预防性维修识别码： PMC9014795
DOI（操作界面）： 10.1083/jcb.202109038

凋亡、坏死和热解的光生激活剂

凯特琳娜·什卡琳娜等。 J细胞生物学. 2022.

.2022年6月6日；221（6）：e202109038。

doi:10.1083/jcb.202109038。 Epub 2022年4月14日。

作者

卡特琳娜·什卡里娜¹, 伊娃·哈塞尔·德·卡瓦略², 何塞·卡洛斯·桑托斯¹, 萨拉·拉莫斯¹, 玛丽亚·莱普丁², 彼得·布罗兹¹

附属公司

¹瑞士埃帕林奇洛桑大学生物化学系。
²德国海德堡欧洲分子生物学实验室主任研究。

PMID： 35420640
预防性维修识别码：第9014795页
DOI（操作界面）： 10.1083/jcb.202109038

摘要

对单个或多个细胞群中的细胞死亡进行有针对性和特异性的诱导，有可能对组织或生物体对不同形式死亡的反应产生新的见解。在这里，我们报道了光基因控制的细胞死亡效应器（optogenetic controlled cell death effectors，optoCDEs）的开发，这是一类新型的光基因工具，能够利用拟南芥光敏蛋白Cryptochrome-2光介导诱导三种类型的程序性细胞死亡（PCD），即凋亡、焦凋亡和坏死。OptoCDE能够在人、小鼠和斑马鱼细胞中快速、高度特异地诱导PCD，并适用于广泛的应用，例如亚致死性细胞死亡诱导或体内外精确消除单个细胞或细胞群。作为概念的证明，我们利用光CDE来评估邻近细胞对凋亡或坏死PCD的反应差异，揭示了新的新作用，即新戈辛-1-磷酸信号在上皮细胞调节凋亡细胞的传出细胞。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**光遗传学激活的人类炎症半胱天冬酶的开发和验证。（A）**炎症途径，Cry2介导的炎症半胱天冬酶聚集。**（B和C）**人类炎症半胱天冬酶和光-hCaspase结构体的结构域。**（D）**CellTox-阳性（渗透性）人GSDMD转基因（hGSDMD）的定量^{热重（tg）})HEK293T细胞表达光-hCaspase，未经处理或每隔30秒用蓝光照射一次。此处和之后，只有表达可检测水平的细胞（mCherry⁺)对t=0时的光CDE进行量化，除非另有说明，否则在5 mW/cm时为488 nm光²用于所有分析。**（E）**hGSDMD的时间推移图像^{热重（tg）}Cry2olig或opt-hCaspase-1、-4或-5蓝光激活后的HEK293T细胞，显示PS暴露（Annexin V）和膜通透性（CellTox-Green）。比例尺，20µm。**（F）**hGSDMD中DRAQ7随时间的摄取（以1分钟间隔量化）^{热重（tg）}表达指示结构的HEK293T细胞。**（G和H）**CellTox百分比⁺hGSDMD公司^{热重（tg）}光照前后HEK23T细胞表达WT或突变型光-hCaspase；或在模拟（NT）或Z-VAD-fmk处理后。**（一）**CellTox的百分比⁺光照后1h细胞系中表达指示结构的细胞。所有数据均显示为平均值±SD（D和G–I）或平均值±SEM（F），代表三个独立实验（E）或三个独立试验（D、F、G、H和I）的集合，每个实验有三个技术副本(n个=总共9）。每个点代表一个独立的模拟视野。****，P<0.0001；**，P<0.01（双尾t吨测试）。PAMPs，病原相关分子模式；脂多糖；DAMP，危险相关分子模式；CARD，半胱氨酸蛋白酶招募域；p20，催化性p20结构域；p10，催化p10结构域。

**图S1。**
**人类细胞中视基因炎症半胱天冬酶的激活。（A）**Western blot分析研究中使用的细胞系中炎症（hCaspase-1、hCaspase-4和hCaspase-5）和凋亡（hCaspase-8和hCaspase-9）caspase和hGSDMD的表达。**（B）**为了确定光毒性阈值，表达mCherry-Cry2olig的HEK293T细胞每隔15 s用不同功率密度的蓝光照射1 h，并在照射前后量化形态改变的细胞百分比。**（C）**蓝光（5 mW/cm）照射1小时前后A细胞的代表性图像²)。插图显示了转染（mCherry⁺)和未转染的（mCherry^负极)单元格。**（C）**光照前后HEK293T细胞表达不同版本的光-hCaspase-1、-4和-5的代表性图像（488 nm，5 mW/cm²).（D）表达CARD-缺陷型光-hCaspase-1并经历光诱导细胞凋亡的细胞中mCherry、Annexin-V和CellTox信号的正常荧光强度。平均值±SEM，n个=5个单元格。**（E）**光照前后表达光-hCaspase-1、-4或-5（红色）的野生型（即天然缺乏GSDMD）HEK293T细胞的代表性图像（488 nm，5 mW/cm²).（F）野生型或hGSDMD中照射前后凋亡、焦中毒或活细胞的定量^{热重（tg）}表达光-hCaspase-1、-4或-5的HEK293T细胞。图像显示了三类细胞（活细胞、凋亡细胞和焦中毒细胞）的形态特征和CellTox染色。**（G）**光照前后野生型HEK293T细胞表达光-hCaspase-1/-4/-5和基因编码caspase-3/7活性报告物VC3AI（绿色）的代表性图像（488 nm，5 mW/cm²).（H）光照1小时前后表达光-hCaspase-1/-4/-5的不同人类上皮细胞系的代表性图像（488 nm，5 mW/cm²)。比例尺，20µm。所有数据都代表了至少两个（A）或三个（C–H）独立实验，每个实验都有三份技术复制品(n个=6和n个= 9).

**图2。**
**人类巨噬细胞样细胞系中的光诱导凋亡。（A和B）**CellTox的代表性图像和量化⁺蓝光照射1小时前后，PMA分化的U937细胞表达所示结构。比例尺，20µm。**（C和E）**表达所示结构的WT U937或U937细胞的LDH和IL-1β释放，用尼葛霉素（C）处理，用LPS（E）转染，或用蓝光照射。NT，未经处理。**（D和F）**组合细胞裂解物和C或E上清液的免疫印迹。Anti-mCherry用于全长和加工的光-hCaspase-1/-4/-5和Cry2olig。A和C–F代表至少三个独立实验，每个实验有三个技术复制品（至少n个=9），B来自三个实验，每个实验有四个技术副本(n个= 12). 平均值±SD，****，P<0.0001（单向方差分析）。此图的源数据可用：SourceData F2。

**图S2。**
**光诱导人和小鼠巨噬细胞样细胞的凋亡，以及亚致死性的凋亡诱导。（A）**代表性图像显示了强力霉素（dox）处理后用光-hCaspase-1稳定转导的U937细胞中异质mCherry表达水平。比例尺，50µm。**（B）**表达指定结构的分化dox处理的U937细胞系中mCherry阳性细胞的百分比。数据来自两个独立实验，每个实验四个视野，平均值±SD。**（C）**小鼠opto-mCaspase-1和opto-mCaspase-11结构的示意图。这两种结构均含有CARD缺陷小鼠caspase-1或11蛋白，通过GGGS连接子与mCherry-tagged Cry2olig N末端融合。**（D）**野生型或GSDMD转基因HEK293T细胞在照射前或照射后30分钟表达光-mCaspase-1或光-mCaspase-11的代表性图像（488 nm，5 mW/cm²每15秒）。在CellTox（绿色）和Annexin-V（蓝色）存在的情况下对细胞进行成像，以可视化膜渗透和PS暴露。比例尺，10µm。**（E）**CellTox-阳性hGSDMD百分比^{热重（tg）}光照前后HEK293T细胞表达野生型或催化缺陷型光-mCaspase-1或光-mCaspase-11（488 nm，5 mW/cm²每15秒）。平均值±标准偏差，来自三个独立实验。****，P＜0.0001；***，P<0.001（双尾t吨测试）。**（F和G）**光照前后表达Cry2olig、opto-mCaspase-1或opto-mCaspase-11的RAW 264.7细胞和原代小鼠骨髓源巨噬细胞（BMDMs）的代表性图像（488 nm，5 mW/cm²)在CellTox和Annexin V存在下，比例尺为20µm（F）和10µm。**（H）**不受第一次照明脉冲影响的细胞的代表性图像（可行，DRAQ7^负极)或经历完全性烧灼性下垂（烧灼，DRAQ7^高的)。与图3 E相关。标尺，20µm。**（一）**用低强度488 nm光（3×0.2 mW/cm）瞬时照射表达光-hCaspase-1的HaCaT细胞²)t=3min时，DRAQ7内流（绿松石色）标记细胞的初始亚致死膜通透性，然后修复。箭头表示划分父单元格及其子单元格。比例尺，20µm。**（D–G）**数据是三个独立实验的代表或组合，每个实验都有三份技术副本(n个= 9). H和I是六个独立实验的代表(n个= 6).

**图3。**
**滴定光照剂量可激活亚致死性光-hCaspase-1。（A和B）**光-hCaspase-1中DRAQ7-阳性细胞核的百分比^{热重（tg）}每15分钟用（A）不同强度的蓝光照射一次HaCaT细胞，或（B）在t=3分钟时用不断增加的光脉冲（0.2 mW/cm）瞬时照射²/脉冲）。平均值±SEM，代表三个独立实验，每个实验使用三份技术副本(n个＝9）。**（C和D）**PMA-differentiated opto-hCaspase-1释放LDH^{热重（tg）}U937电池用不同强度的光（0.1–4 mW/cm）连续照射（C）²)或（D）具有规定的光强度（0.9 mW/cm²)。三个独立实验的代表，每个实验都有三份（C）或四份（D）技术副本(n个= 9,n个=12），平均值±SD。**（E–J）**光-hCaspase-1^{热重（tg）}HaCaT细胞接受第一轮低强度（3×0.2 mW/cm²)蓝光照明，然后让其恢复60分钟，然后进行第二轮照明（可变数量×0.2 mW/cm²).（E）第一轮照明之前、之后（t=60分钟）和第二轮照明之后（t=120分钟）的典型共焦图像。插图显示细胞在第一次脉冲后经历亚致死性膜渗透和逆转，在第二次脉冲后完全热解。比例尺：50µm；插入比例尺，10µm。**（F）**从插入E。**（G）**根据光照前后的表型对细胞进行量化。细胞分类为：“存活”=无DRAQ7内流，形态正常；“亚致死”=DRAQ7内流较低，早期出现焦中毒特征（核圆形，膜泡状），但在15-30分钟内恢复正常形态；“热解”–高DRAQ7，热解形态。**（H）**存活细胞、亚致死细胞和热解细胞的百分比取决于初始光脉冲数（照射后t=30分钟）。**（一）**脉冲光照前后光-hCaspase-1表达高（白色*）和低（黄色*）的细胞图像。比例尺，20µm。**（J）**短暂低强度蓝光刺激后，高或低optoCaspase-1表达的细胞显示每个表型的百分比。**（E–J）**数据是六个独立实验的代表或六个独立试验的汇总(n个=总共340个单元格）。

**图4。**
**2D和3D细胞培养中的光遗传学单细胞消融。（A）**光-hCaspase-1融合单层单细胞消融的时间序列图像^{热重（tg）}HaCaT细胞。左，整个视野。右图，三个选择性消融细胞的插图；照明时间为5、20和35分钟。蓝色方块表示受蓝光刺激的感兴趣区域（ROI）。DRAQ7=膜渗透。比例尺，50µm；插入标尺，20µm。**（B和C）**归一化DRAQ7强度（B）和单元面积损失（C）。蓝线表示每个细胞的ROI刺激时间。**（D）**3D Caco-2球体中空间分辨细胞消融实验装置的示意图。**（E和F）**显示Caco-2球体中单个细胞（E）或大组细胞（F）选择性消融的时间图像。用蓝光（3.4 mW/cm）刺激ROI（蓝色方块）²)t=5 min，通过DRAQ7内流测量细胞凋亡。数据代表了n个=5（A和B）、7（D）和4（E）个独立实验。比例尺，50µm；插入标尺（E），20µm。

**图S3。**
**2D和3D中单个细胞凋亡、坏死和焦下垂的光遗传学激活。（A）**用蓝光选择性地刺激细胞的八个未刺激的直接相邻邻域的归一化核DRAQ7强度。与图4 A相关。灰线表示单个细胞痕迹。垂直的蓝线表示三次局部蓝光刺激的时间。**（B）**非流明Caco-2球体中部分细胞消融的典型延时图像。蓝色球体表示在t=5分钟时进行刺激的区域。比例尺为50µm。三个独立实验的代表。**（C）**光照前后HEK293T细胞表达全长或CARD/DED缺陷光-hCaspase-8或光-hCaspase-9的代表性图像（488 nm，5 mW/cm²每15秒）。箭头表示凋亡气泡。标尺，20µm。**（D）**定量表达opto-hCaspase-8或opto-hCaspase-9的C细胞，并显示凋亡性起泡，或起泡和Annexin V染色。每隔3分钟用蓝光刺激细胞，并采集图像3小时。**（E）**用SMAC模拟物AZD5582处理表达opto-hCaspase-8的U937或HaCaT细胞，或表达opto-hCaspase-9的Caco-2细胞，并用蓝光刺激1h，在光照前后量化显示凋亡形态学的细胞百分比。C–E的平均值±标准偏差。数据来自三个独立实验。***，P<0.001（双尾t吨测试）。**（F）**在没有蓝光照射的情况下，表达野生型或RHIM缺陷型光-hRIPK3（C-末端与Cry2olig融合）的HEK293T细胞的代表性图像（左）。表达不同opto-hRIPK3版本的HEK293T细胞中含有mCherry簇的细胞百分比（右）。比例尺，10μm。**（G）**表达野生型C末端opto-hRIPK3的细胞代表性图像，在缺乏蓝光的情况下显示凋亡形态学（左）。转染不同版本的opto-hRIPK3的HEK293T细胞中自发凋亡细胞的百分比（右）。比例尺，10µm。**（H）**在蓝光（5 mW/cm）刺激前后，HEK293T细胞表达不同的opto-hRIPK3版本（与人hMLKL共转染）或opto-hMLKL的代表性图像²)。在Annexin V（蓝色）和CellTox（绿色）存在的情况下对细胞进行成像，以观察早期（溶解前）和晚期（溶解）坏死下垂。比例尺，20µm。**（一）**在没有hMLKL共同表达的情况下，光照前后表达光-hRIPK3版本的Annexin-V阳性HEK293T细胞的百分比。F–I中的数据来自两个（E）或三个（B–H）独立实验，使用三份技术复制品（D、E和I）或四份技术复制品（F–H）进行。n个=6（E），n个=9（D和I），以及n个=12（F–H）。平均值±SD（双尾t吨测试）。比例尺，10微米（A和B）或20微米（C）。

**图5。**
**凋亡启动子半胱天冬酶的光诱导激活。（A和B）**内源性和外源性细胞凋亡诱导以及全长或截短的光-hCaspase-8和光-hCaspase-9的示意图。**（C）**用蓝光照射表达光-hCaspase-8/9版本的HEK293T细胞，并根据形态学（细胞收缩、起泡、核碎裂）测定凋亡细胞随时间的百分比。**（D）**光照后HEK293T细胞表达DED缺陷型光-hCaspase-8和CARD缺陷型光-hCaspase-9的时程图像和Annexin V采集。比例尺，10µm。**（E）**蓝光照射1小时前后，表达光-hCaspase-8/9的HEK293T细胞中caspase-3/7报告子的激活图像。比例尺，10µm。**（F）**D中凋亡细胞随时间的定量（以1分钟为间隔）。**（G–I）**蓝光照射1h后，对表达WT（G和I）或突变（G）opt-hCaspases或用Z-VAD（H）处理的细胞的凋亡诱导进行量化。数据代表（D）或来自（C和E–I）三个独立实验的集合，每个实验都有三份技术副本(n个= 9). 每个数据点对应于独立的技术复制。平均值±SD；P<0.0001（双尾t吨测试）。肿瘤坏死因子受体；线粒体外膜通透性；DED，死亡效应域。

**图6。**
**坏死效应器坏死下垂的视基因激活。（A和B）**坏死路径和opto-hRIPK3及opto-hMLKL结构的图示。**（C）**蓝光照射后0至30分钟，表达不同opto-hRIPK3版本或opto-hMLKL的HEK293T细胞根据Annexin V的采集定量坏死。**（D和E）**HEK293T细胞在光-RIPK3（N-末端，RHIM缺陷）或光-hMLKL激活时经历光诱导坏死的时间推移图像。比例尺，10µm。**（F）**通过opto-hRIPK3和opto-hMLKL激活诱导坏死的动力学。比例尺，10μm。**（G–I）**蓝光照射1小时后，定量表达WT、催化缺陷或寡聚化缺陷的光-hRIPK3/opto-hMLKL或用1µM GSK'872（RIPK3抑制剂）或5µM坏死磺胺（MLKL抑制剂）处理的细胞的坏死凋亡。**（J）**激活opto-hMLKL后，非刺激、早期（溶解前）和晚期（渗透后）坏死坏死Caco-2和HT-29细胞的共焦图像。**（K）**蓝光照射后光-hMLKL表达HT-29细胞中Annexin V或CellTox染色的定量。比例尺，20µm。数据具有代表性（D、E和J）或从（C、F–I和K）三个独立实验中汇集而来，每个实验都有三份技术副本(n个=9），平均值±标准偏差****，P<0.0001（双尾t吨测试）。TRAIL、TNF-相关凋亡诱导配体；FADD，Fas关联死亡域；KD，激酶结构域；PKD，假激酶结构域；NBB、N-末端束和支架。

**图S4。**
**斑马鱼半胱天冬酶的光遗传学激活和上皮细胞凋亡和坏死细胞死亡的差异反应。（A）**斑马鱼炎症（caspa和caspb）或凋亡（caspase-8）caspases的结构域组织。**（B）**hGSDMD的代表性图像^{热重（tg）}蓝光照射30分钟（5 mW/cm）前后HEK293T细胞表达opt-zfCaspa、opt-zf Caspb或opt-zf-Caspase-8²)。CellTox染色（绿色）表明膜渗透。**（C和D）**焦中毒性（C）或凋亡性（D）opto-zfCaspa或opto-zfCaspb-expressing（C）or opto zfCaspase-8-expressing（D）hGSDMD的百分比^{热重（tg）}蓝光照射前后HEK293T细胞（5 mW/cm²)。数据来自三个独立实验，平均值±标准偏差。**（E）**激活opto-zfCaspb后角质形成细胞的典型延时图像。**（F）**Caco-2细胞与野生型细胞共培养过程中发生光诱导的凋亡、凋亡和坏死的典型延时图像（显示DIC和mCherry通道）（与图8、A和B相关）。**（G）**典型的延时图像显示，从单层WT细胞中挤出的焦中毒（opto-hCaspase-1）和坏死（opto-hMLKL）细胞中的CellMask（紫色）、Annexin-V（蓝色）和CellTox（绿色）染色。左侧，中间平面（基底表面上方5µm）的细胞图像，右侧，顶端平面（基底表面上方15µm，显示挤出的细胞）。对于光-hMLKL细胞，进行120分钟的成像，以显示溶血坏死期的CellTox内流。**（H）**共培养中凋亡细胞（由光-hCaspase-8激活诱导）的时间推移图像。每3分钟进行一次成像，共12小时。箭头表示邻近区域持续存在凋亡小体。**（I和J）**诱导凋亡后12小时内挤压凋亡细胞的百分比。**（一）**如果超过50%的细胞体或凋亡片段从单层中排出，则细胞被归类为“挤压”。**（J）**全挤压和部分挤压的定义如图8所示。数据来自两个（I和J）独立实验(n个如所指示的）。所有图像均代表至少三个独立实验(n个= 3). 比例尺，20µm。

**图7。**
**斑马鱼PCD的时空控制。（A）**热休克诱导mCherry-Cry2olig与zfCaspa、zfCaspb或zfCaspase-8融合表达的结构设计。**（B）**PCD光遗传学诱导的表达、激活和成像的实验装置。灰色阴影区域是获取C的时间范围。**（C）**2,5-dpf Tg（Opto-zfCaspa）×asc:asc-gfp幼虫在0、6和12 hphs（热休克后小时）时的时程成像。比例尺，500µm。**（D）**斑马鱼幼虫的示意图，显示角质形成细胞、基底细胞和肌肉细胞的位置。**（东-西）**与Tg（Krt4:AKT-PH-GFP）交叉的Tg（Opto-zf-Caspa）或Tg（Opo-Caspase-8）线中的Caspa或Caspase-8的光诱导激活的时间进程。垂死的细胞用虚线勾勒出来。比例尺，20µm。**（E）**激活opto-zfCaspa后角质细胞凋亡和肌肉细胞死亡。**（F）**opt-zfCaspase-8激活后，角质细胞、基底细胞和肌肉细胞死亡。**（G）**激活opt-zfCaspa后角质形成细胞挤出。**（H）**单细胞中光-zfCaspa（红色）的双光子激活。数据代表了n个=3个独立重复。

**图8。**
**相邻细胞对PCD的反应。（A）**共培养系统由表达mCherry-tagged opticCDE的Caco-2细胞和50×过量的WT-Caco-2邻居组成。**（B–H）**用488 nm光（8.7 mW/cm）刺激WT细胞周围的一个或多个光CDE表达细胞簇²)总时间每180s持续90min。**（B）**显示细胞边界（CellMask）和膜渗透性（CellTox）的时序图。**（C）**3D重建显示1小时时挤压出的热解和坏死细胞（顶部和中间面板）或细胞外凋亡小体（底部面板）。Annexin V标记坏死细胞膜。**（D）**材料和方法一节中描述的染色细胞命运的量化。显示了每个条件下量化的细胞总数。**（E）**随着时间的推移，细胞会发生脱落、坏死和凋亡。n个=56、32和27个单元格。**，P<0.01；****，P<0.0001（Mantel-Cox试验）。**（F和G）**随着时间的推移，热解和坏死细胞面积减少（标准化为t=0）。平均值n个=20和18个单元格。*，P<0.05；**，P<0.01（双尾t吨测试）。**（H）**在获得CellTox信号之前或之后，完全挤出的热解细胞和坏死细胞的百分比。**（一）**光照前后（488 nm）斑马鱼角质形成细胞表达的光zfCaspa图像。**（J）**光zfCaspa诱导斑马鱼幼体细胞凋亡和光zfCaspase-8诱导细胞凋亡过程中挤压细胞与保留细胞的定量。**（K）**斑马鱼幼体中嗜热细胞和凋亡细胞挤压的分析。n个＝每种类型的细胞死亡的21个事件；***，P<0.0001（Mantel-Cox试验）。平均值±SD（F和G）或平均值±SEM（E和K）。数据具有代表性（B、C和I）或从三个独立实验的（D–H和J–K）中汇集而来，每个实验都有三份技术副本(n个= 9). 比例尺，20µm。

**图S5。**
**消除因细胞凋亡、凋亡或坏死而死亡的上皮细胞。（A）**光-hCaspase-8转基因Caco-2细胞在没有相邻细胞的情况下发生凋亡的典型延时图像。Annexin V染色（蓝色）标志着后期PS暴露。箭头表示典型的凋亡特征：初始细胞收缩（15分钟）、细胞收缩和分离（30分钟）、四舍五入和PS暴露（60分钟）。**（B）**分离Caco-2细胞中无凋亡小体形成与MDCK细胞中凋亡小体的形成。**（C）**光-hCaspase-8转基因Caco-2细胞单独培养（单培养）或与WT Caco-2共同培养并用蓝光刺激1小时后，细胞凋亡碎片百分比。**（D）**膜联蛋白-V（10µg/ml）处理的共培养物中挤出的、部分挤出的凋亡细胞的百分比。**（E）**野生型Caco-2中自发凋亡和凋亡尸体胞吐的典型延时图像。比例尺，20µm。**（F）**非刺激Caco-2细胞中生命活性GFP分布的代表性图像。基底面（0µm）显示随机定向的跛足，内侧面（+5µm，显示细胞连接处的皮质肌动蛋白富集）。**（G）**凋亡细胞挤压期间邻近细胞肌动蛋白重排的典型延时图像。比例尺，20µm。刺激细胞并获取图像，如图8 A–C所示。**（H）**从B.箭头重建的延时序列侧视图（xz）表明，尸体吞没失败时吞噬杯形成不完全。**（一）**一段时间内挤压单元的百分比。如前所述，在用所示抑制剂处理的共培养物中，光照会诱导细胞死亡。挤出的时间由CellMask信号确定，通过成像平面中的完全间隙闭合来确定。数据来自三个（C）或两个（D）独立实验（如图所示的细胞死亡事件总数）。I中的数据来自两个独立实验（细胞死亡事件总数如图9所示。平均值±SEM.*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.0001。比例尺，20µm。

**图9。**
**坏死细胞挤压和凋亡细胞胞吐需要相邻细胞的差异性细胞骨架重排。（A–D）**时间推移图像和重建侧视图显示了在烧蚀和坏死Caco-2细胞挤压或凋亡Caco-2电池吞噬过程中相邻细胞的肌动蛋白动力学。**（A和B）**白色箭头表示基底（0µm）平面上的跛足，黄色箭头表示内侧（+5µm。光刺激（2 mW/cm²)每90s进行一次z-stack采集。**（C和D）**图像显示凋亡细胞周围的顶端闭合（顶端平面）、泡腾杯状结构形成（中间平面，黄色箭头）和跛行（基面）。顶面是以0.6µm的间隔获取的四个平面的最大强度投影。数据至少代表n个=3个独立实验。**（E）**C的插图显示凋亡尸体碎片化和摄取过程中相邻肌动蛋白聚合。**（F）**量化相邻细胞中形成的肌动蛋白结构，以应对不同类型的细胞死亡。数字表示每种情况下的细胞死亡事件，这些事件来自三个独立的实验。**（G）**跛足和内脏串形成期间肌动蛋白重塑的主要调节器，以及针对它们的抑制剂。**（H–J）**量化用不同细胞骨架抑制剂处理的共培养物中的热解、坏死和凋亡细胞挤出（t=60分钟）和凋亡细胞碎裂，这些共培养物来自六个独立实验（如图所示）。用蓝光8.7 mW/cm光刺激细胞²每180秒激活一次光CDE。比例尺，20µm。

**图10。**
**S1P信号调节凋亡细胞胞吐和坏死细胞挤压。（A）**S1P信号和抑制剂靶点的图示。**（B）**在用SKI-II或JTE-013处理的共培养物中，定量挤压和保留的热解和坏死细胞。**（C）**在存在或不存在抑制剂的情况下，随着时间的推移，热解细胞和坏死细胞的挤出。n个=3个独立实验，细胞死亡事件的数量显示在条形图上方。**（D）**光诱导激活光CDE后，Caco-2细胞释放S1P和LDH。**（E）**光-hCaspase-8表达的Caco-2细胞在SKI-II或JTE-013存在下发生凋亡的时间推移图像。比例尺，20µm。**（F和G）**用SKI-II和JTE013处理的Caco-2共培养物中凋亡细胞滞留与挤出的定量。**（H）**S1PR2在用非靶向（NT）或抗S1PR2 siRNA转染的Caco-2细胞中的表达。**（一）**坏死和凋亡细胞随时间的推移与转染NT或S1PR2 siRNA的旁观者细胞共同培养。**（J）**MCF10A共培养中死亡细胞命运的量化。**（K）**经JTE-013或SKI-II处理的MCF10A共培养细胞随时间的挤压。用蓝光8.7 mW/cm光刺激细胞²每180秒激活一次光CDE。平均值±SEM（C、G、I和K）或平均值±SD（D和H）。*，P<0.05；***，P<0.001；****，P<0.0001（Mantel-Cox试验）。所有数据均代表（E）或来自（B–D和F–K）三个独立实验的集合，每个实验都有三份技术副本(n个= 9).（D）数据点代表技术复制。

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使用光剑杀死细胞。
泰特SWG。泰特SWG。细胞生物学杂志。2022年6月6日；221（6）：e202205018。doi:10.1083/jcb.202205018。Epub 2022年5月16日。细胞生物学杂志。2022 PMID：35575773 免费PMC文章。

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