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.2022年4月12日；20(1):52.
doi:10.1186/s12964-022-00852-0。

受体活性修饰蛋白1通过Gαi3-PKA-CREB-YAP轴调节小鼠皮肤成纤维细胞增殖

尹思源（Siyuan Yin） 1 2 三, 如松 1 2, 嘉苏马 1 2, 刘春燕 2 三, 吴振杰 1 2, 曹国琦 1 2, 刘健 2 三, 张广（音） 1 2, 张华宇 1 2, 孙睿（Rui Sun） 1 2, 陈傲宇 2 三, 王一冰 4 5 6
附属公司

受体活性修饰蛋白1通过Gαi3-PKA-CREB-YAP轴调节小鼠皮肤成纤维细胞增殖

思源音等。 细胞通讯信号. .

摘要

背景：皮肤神经支配对正常伤口愈合至关重要。然而，神经受体与伤口愈合之间的关系及其内在机制尚待进一步确定。在本研究中，我们研究了降钙素基因相关肽（CGRP）受体成分受体活性修饰蛋白1（RAMP1）在小鼠皮肤成纤维细胞（MSF）增殖中的作用。

方法：在体内，用小鼠皮肤伤口组织的Western blotting和免疫组织化学（IHC）染色检测RAMP1表达的变化。体外，通过Tet-On-Flag-RAMP1慢病毒感染和多西环素（DOX）诱导，RAMP1在MSF细胞系中过度表达。使用IncuCyte S3活细胞分析系统评估和比较不同治疗组之间的增殖率差异。进行总蛋白和亚细胞提取Western blot分析、定量实时聚合酶链反应（qPCR）分析和免疫荧光（IF）染色分析，以检测信号分子的表达和/或分布。采用CUT&RUN分析和双核糖核酸酶报告子分析测定蛋白质-DNA相互作用。

结果：小鼠皮肤创伤愈合过程中RAMP1表达水平发生改变。RAMP1过度表达促进MSF增殖。从机制上讲，在RAMP1过度表达的MSF中，总Yes相关蛋白（YAP）和核YAP蛋白表达增加。RAMP1过表达增加了抑制性鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G蛋白）α亚单位3（Gαi3）的表达和激活下游蛋白激酶A（PKA），两者都提高了环磷酸腺苷（cAMP）反应元件结合蛋白（CREB）的表达并激活了它，促进了YAP的转录，提高总YAP水平，促进MSF增殖。

结论：基于这些数据，我们首次报道，创伤愈合过程中RAMP1总水平的变化和RAMP1的过度表达可以通过Gαi3-PKA-CREB-YAP轴促进MSF增殖，这是理解RAMP1功能的关键发现，提示该通路是治疗皮肤创伤的一个有吸引力且准确的神经靶点。视频摘要。

关键词：CREB；成纤维细胞增殖；PKA；RAMP1；转录因子；伤口愈合；啊。

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利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
RAMP1过度表达促进细胞增殖。A类皮肤伤口组织蛋白中RAMP1的Western blot分析。总蛋白染色作为内源性对照。B类蛋白质条带强度的量化A类使用车道归一化因子（LNF）对数据进行归一化。C皮肤伤口组织切片RAMP1的H&E染色和IHC染色（10×）。比例尺=100μm。D类通过IHC染色定量分析RAMP1的表达C.E类H&E染色法测量皮肤厚度C进行以下实验时，用DOX（5μg/ml）处理RAMP1 OE和VEC 48小时。F类Flag（绿色）、Actin（红色）和DAPI（蓝色）的共焦免疫荧光。比例尺=10μm。G公司Flag-RAMP1、RAMP1和PCNA的Western blot分析。总蛋白染色作为内源性对照。H（H）蛋白质带强度的量化G公司用LNF对数据进行归一化。我RAMP1 mRNA水平的qPCR分析。将数据归一化为β-肌动蛋白mRNA的数量。J型通过汇流测量测量的细胞增殖能力（72小时）归一化为使用IncCyte（Essen BioScience）计算的0小时。K（K）PCNA（绿色）、肌动蛋白（红色）和DAPI（蓝色）的共焦免疫荧光。比例尺=20μm。我点图显示了每个视野中PCNA阳性细胞频率的量化。实验一式三份进行。数据以平均值±SD表示，并使用未配对方法评估显著差异t试验. *对 < 0.05, **对 < 0.01和***对 < 0.005
图2
图2
RAMP1过表达增加Gαi3、PKA、CREB和YAP的表达。进行以下实验时，用DOX（5μg/ml）处理RAMP1 OE和VEC 48小时。A类Gαi3、PKA、CREB、pCREB（S133）、YAP和pYAP（S127）的Western blot分析。总蛋白染色作为内源性对照。B类蛋白质带强度的量化A类将数据归一化为LNF。CYAP mRNA水平的qPCR分析。将数据归一化为β-肌动蛋白mRNA的数量。D类CREB和YAP细胞质和核组分的Western blot分析。总蛋白染色作为内源性对照。E类蛋白质带强度的量化D类将数据归一化为LNF。C-CREB指细胞质CREB，N-CREB表示核CREB、C-YAP指细胞质YAP，N-YAP指核YAP。F类CREB（红色）、肌动蛋白（绿色）和DAPI（蓝色）的共聚焦免疫荧光。比例尺=20μm。G公司YAP（红色）、Actin（绿色）和DAPI（蓝色）的共焦免疫荧光。比例尺=20μm。实验一式三份进行。数据以平均值±SD表示，并使用未配对方法评估显著差异t试验. *对 < 0.05, **对 < 0.01和***对 < 0.005
图3
图3
RAMP1过度表达通过增加YAP蛋白水平促进增殖。OE+VP组中，RAMP1 OE细胞首先用维特泊芬（VP，0.01μM）单独处理12 h，然后用VP（0.01μM和DOX（5μg/ml）处理48 h。在OE组和VEC组中，RAMP1 OE和VEC首先用DMSO（0.01μM）单独处理12 h，然后用DMSO（0.01μM）和DOX（5μg/ml）处理48 h。A类通过汇流测量测量的细胞增殖能力归一化为0小时，并使用IncuCyte（Essen BioScience）进行计算。B类PCNA和YAP的Western blot分析。总蛋白染色作为内源性对照。C蛋白质带强度的量化B类将数据归一化为LNF。D类YAP mRNA水平的qPCR分析。将数据归一化为β-肌动蛋白mRNA的数量。E类PCNA（红色）、Actin（绿色）和DAPI（蓝色）的共焦免疫荧光。比例尺=20μm。F类点图显示了每个视野中PCNA阳性细胞频率的量化。G公司YAP细胞质和核组分的Western blot分析。总蛋白染色作为内源性对照。H（H）蛋白质带强度的量化G公司将数据归一化为LNF。C-YAP表示细胞质YAP，N-YAP表示核YAP。我YAP（红色）、Actin（绿色）和DAPI（蓝色）的共焦免疫荧光。比例尺=20μm。所有实验一式三份进行。数据以平均值±标准差表示，使用未配对的方法评估显著差异t试验. *对 < 0.05, **对 < 0.01和***对 < 0.005
图4
图4
RAMP1过度表达后对Gαi3的干扰会降低PKA、CREB和YAP的表达和MSF的增殖。用50 nM特异性靶向Gαi3（siGαi3-1和siGαai3-2）或阴性对照序列（siNC）的小干扰RNA（siRNAs）反向转染RAMP1 OE细胞48 h，然后用DOX（5μG/ml）处理48 h。A类Gαi3。总蛋白染色作为内源性对照。B类蛋白质带强度的量化A类将数据归一化为LNF。CGαi3 mRNA水平的qPCR分析。将数据归一化为β-肌动蛋白mRNA的数量。D类通过汇流测量测量的细胞增殖能力标准化为使用IncuCyte（Essen BioScience）计算的0小时。E类YAP mRNA水平的qPCR分析。将数据归一化为β-肌动蛋白mRNA的数量。F类PCNA、PKA、CREB、pCREB（S133）、YAP和pYAP（S127）的Western blot分析。总蛋白染色作为内源性对照。G公司蛋白质带强度的量化F类将数据归一化为LNF。H（H）PCNA（红色）、Actin（绿色）和DAPI（蓝色）的共焦免疫荧光。比例尺=20μm。我点图显示了每个视野中PCNA阳性细胞频率的量化。J型CREB和YAP细胞质和核组分的Western blot分析。总蛋白染色作为内源性对照。K（K）蛋白质带强度的量化J型将数据归一化为LNF。C-CREB指细胞质CREB，N-CREB表示核CREB、C-YAP指细胞质YAP，N-YAP指核YAP。我CREB（红色）、Actin（绿色）和DAPI（蓝色）的共焦免疫荧光。比例尺=20μm。M（M）YAP（红色）、Actin（绿色）和DAPI（蓝色）的共焦免疫荧光。比例尺=20μm。实验一式三份进行。数据以平均值±SD表示，并使用未配对方法评估显著差异t试验. *对 < 0.05, **对 < 0.01, ***对 < 0.005和ns，不显著
图5
图5
PKA抑制剂H-89降低CREB和YAP水平并抑制MSF增殖。在OE+H-89组中，RAMP1 OE细胞首先用H-89（1μM）单独处理24 H，然后用H-89和DOX（5μg/ml）处理48 H。在OE组和VEC组中，RAMP1 OE和VEC首先用DMSO（1μM）单独处理24小时，然后用DMSO1μM和DOX（5μg/ml）处理48小时。A类PCNA、PKA、CREB、pCREB（S133）、YAP和pYAP（S127）的Western blot分析。总蛋白染色作为内源性对照。B类蛋白质带强度的量化A类将数据归一化为LNF。CYAP mRNA水平的qPCR分析。将数据归一化为β-肌动蛋白mRNA的数量。D类通过汇流测量测量的细胞增殖能力归一化为0小时，并使用IncuCyte（Essen BioScience）进行计算。E类YAP和CREB细胞质和核组分的Western blot分析。总蛋白染色作为内源性对照。F类蛋白质带强度的量化E类将数据归一化为LNF。C-CREB指细胞质CREB，N-CREB表示核CREB、C-YAP指细胞质YAP，N-YAP指核YAP。G公司CREB（红色）、Actin（绿色）和DAPI（蓝色）的共焦免疫荧光。比例尺=20μm。H（H）YAP（红色）、Actin（绿色）和DAPI（蓝色）的共焦免疫荧光。比例尺=20μm。实验一式三份进行。数据以平均值±SD表示，并使用未配对方法评估显著差异t试验. *对 < 0.05, **对 < 0.01和***对 < 0.005
图6
图6
PKA激动剂BUC增加CREB和YAP的表达和MSF的增殖。在OE+BUC组中，RAMP1 OE细胞首先用DOX（5μg/ml）处理48 h，然后用BUC（0.01μM）和DOX（5ug/ml）处理24 h。在OE组和VEC组中，RAMP1 OE和VEC首先用DOX（5μg/ml）处理48 h，然后用DMSO（0.01μM）和DOX（5ug/ml）处理24 h。A类PCNA、PKA、CREB、pCREB（S133）、YAP和pYAP（S127）的Western blot分析。总蛋白染色作为内源性对照。B类蛋白质带强度的量化A类将数据归一化为LNF。CYAP mRNA水平的qPCR分析。将数据归一化为β-肌动蛋白mRNA的数量。D类通过汇流测量测量的细胞增殖能力归一化为0小时，并使用IncuCyte（Essen BioScience）进行计算。E类YAP和CREB细胞质和核组分的Western blot分析。总蛋白染色作为内源性对照。F类蛋白质带强度的量化E类将数据归一化为LNF。C-CREB表示细胞质CREB，N-CREB表示细胞核CREB，C-YAP表示细胞质YAP，N-YAP表示细胞核YAP。G公司CREB（红色）、Actin（绿色）和DAPI（蓝色）的共焦免疫荧光。比例尺=20μm。H（H）YAP（红色）、Actin（绿色）和DAPI（蓝色）的共焦免疫荧光。比例尺=20μm。实验一式三份进行。数据以平均值±SD表示，并使用未配对方法评估显著差异t试验*对 < 0.05, **对 < 0.01和***对 < 0.005
图7
图7
RAMP1-Gαi3-PKA轴调节CREB介导的YAP。在OE+KG-501组中，RAMP1 OE细胞首先用KG-501（10μM）处理12 h，然后用KG-401（10μM）和DOX（5μg/ml）处理48 h。在OE组和VEC组中，RAMP1 OE和VEC首先用DMSO（10μM）处理12 h，然后用DMSO10μM和DOX（5μg/ml）处理48 h。A类PCNA（红色）、Actin（绿色）和DAPI（蓝色）的共焦免疫荧光。比例尺=20μm。B类点图显示了每个视野中PCNA阳性细胞频率的量化。CPCNA、CREB、pCREB（S133）、YAP和pYAP（S127）的Western blot分析。总蛋白染色作为内源性对照。D类蛋白质带强度的量化C将数据归一化为LNF。E类通过汇流测量测量的细胞增殖能力归一化为0小时，并使用IncuCyte（Essen BioScience）进行计算。F类YAP mRNA水平的qPCR分析。将数据归一化为β-肌动蛋白mRNA的数量。G公司YAP和CREB细胞质和核组分的Western blot分析。总蛋白染色作为内源性对照。H（H）蛋白质带强度的量化G公司将数据归一化为LNF。C-CREB指细胞质CREB，N-CREB表示核CREB、C-YAP指细胞质YAP，N-YAP指核YAP。我CREB（红色）、Actin（绿色）和DAPI（蓝色）的共焦免疫荧光。比例尺=20μm。J型YAP（红色）、Actin（绿色）和DAPI（蓝色）的共焦免疫荧光。比例尺=20μm。K（K）DNA琼脂糖凝胶电泳雅普启动子DNA定量使用CUT&RUN分析和不同引物的qPCR。我CBS野生型（WT）双荧光素酶报告分析雅普启动子和突变（Mut）YAP启动子。实验一式三份进行。数据以平均值±标准差表示，并使用未配对的方法评估显著差异t检验. *对 < 0.05, **对 < 0.01, ***对 < 0.005和ns，不显著
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