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.2022年2月28日；12(6):2502-2518.
doi:10.7150/thno.63824。 eCollection 2022年。

肝PRMT1通过诱导PGC1α改善饮食诱导的肝脂肪变性

陆旭 1 2, 哲黄 1 2, Tak-Ho Lo公司 三, 李子恒 1 2, 杨冉瑶 1 2, 兴群岩 1 2, 德威叶 4 5, 徐爱民 1 2 6, 黄志明 1 三 7
附属公司

肝PRMT1通过诱导PGC1α改善饮食诱导的肝脂肪变性

陆旭等。 治疗诊断科技. .

摘要

理论基础：过度营养会导致PRMT1过度表达，但在肥胖受试者的肝脏中观察到蛋白质低甲基化。脂肪肝疾病进展中PRMT1的表达和甲基转移酶活性的动态变化尚不清楚。方法：我们使用重组腺相关病毒介导的基因传递系统来控制饮食诱导肥胖小鼠的肝脏PRMT1表达水平，以研究PRMT1在肝脏脂肪变性中的作用。我们进一步利用一组经活检证实患有非酒精性脂肪肝的肥胖人类来支持我们在小鼠模型中的观察。结果：我们证明，敲除PRMT1可促进喂食高脂饮食（HFD）小鼠肝脏脂肪变性的发展。野生型PRMT1过度表达，但不表达甲基转移酶缺陷突变体PRMT1G80R型，可以缓解饮食诱导的肝脂肪变性。这一观察结果在患有生物医药证实的非酒精性脂肪性肝病的肥胖人体标本中得到了保存。从机制上讲，PRMT1的甲基转移酶活性需要通过HNF-4α向PGC-1α启动子的募集来诱导PGC-1βmRNA的表达，从而通过增强PGC-1γ介导的脂肪酸氧化来减轻HFD诱导的肝脂肪变性。结论：我们的结果表明，激活PRMT1/HNF-4α/PGC-1α信号是一种潜在的治疗策略，可用于治疗肥胖患者的非酒精性脂肪肝。

关键词：饮食性肝脂肪变性；HNF-4α；非酒精性脂肪肝；前列腺素C-1α；PRMT1。

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竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
图1
长期喂食HFD可显著诱导肝细胞中PRMT1的表达水平。用STC或HFD喂养8周龄雄性C57BL/6N小鼠2个月。答：。通过qPCR分析确定PRMT1的肝脏mRNA表达水平。B类.PRMT1的肝蛋白表达水平由Western blotting测定（左）。每条车道都是来自不同个体的样本。PRMT1肝蛋白表达水平的量化（右）。C类PRMT1的肝蛋白表达水平由免疫组织化学（IHC）测定。肝切片中PRMT1免疫组织化学染色的代表性图像。（200倍）。D类左面板，通过Western blotting分析测定喂食STC或HFD小鼠肝脏中分离的肝细胞或非实质细胞（NPC）部分中PRMT1、白蛋白和CD11b的蛋白表达水平（左面板）。右侧面板，PRMT1（左）、白蛋白（中）和CD11b（右）蛋白表达水平的量化。蛋白质表达水平归一化为β-肌动蛋白的表达。除非另有说明，否则STC组的肝细胞分数为1，用于折叠式计算。数据表示为平均值±SEM；n=每组3个。E类蛋白质印迹法测定肝脏中的精氨酸甲基化水平。每条车道都是来自不同个体的样本。F类用质谱法测定小鼠肝脏中S-腺苷蛋氨酸（SAM）的浓度。除非另有说明，否则STC组被设置为1用于倍数变化计算。数据表示为平均值±SEM；n=4-5每组；通过三个独立实验进行重复*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图2
图2
在喂食HFD的小鼠中，肝脏PRMT1的敲除会加剧肝脏脂肪变性。用3×10感染8周龄雄性C57BL/6N小鼠11编码U6-PRMT1 shRNA（shPRMT1）或加扰控制（加扰）shRNA的AAV拷贝分别在喂食STC或HFD后9周。答：。病毒治疗示意图。B类通过qPCR分析确定PRMT1的肝脏mRNA表达水平。C类.PRMT1的肝蛋白表达水平由Western blotting测定（左）。每条车道都是来自不同个体的样本。PRMT1肝蛋白表达水平的量化（右）。D。肝脏组织的典型大体照片。E类肝切片油红O（上片）和H&E（下片）染色的代表性图像。（200倍）F类肝胆固醇和甘油三酯水平根据用于提取脂质的肝组织的总蛋白含量进行标准化。G公司血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶。靶基因的mRNA表达水平归一化为小鼠β-actin的表达。除非另有说明，否则折叠计算时，STC-Scramble组设置为1。数据表示为平均值±SEM；n=5-8个/组；通过三个独立实验进行重复*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图3
图3
肝脂肪酸的下调β-长期喂食HFD后，在PRMT1基因敲除的小鼠中观察到氧化（FAO）速率。用3×10感染8周龄雄性C57BL/6N小鼠11HFD喂食后，AAV编码U6-PRMT1 shRNA（shPRMT1）或加扰对照（加扰）shRNA的拷贝数分别为9周。答：。通过qPCR分析确定脂肪生成相关基因（乙酰辅酶A羧化酶-1[ACC-1]、硬脂酰辅酶A去饱和酶1[SCD1]和过氧化物酶体增殖物激活受体γ[PPARγ]和固醇调节元件结合蛋白1[SREBP-1c]）的肝脏mRNA表达。B。通过qPCR分析确定与VLDL分泌相关的基因（羧酸酯酶3/三酰甘油水解酶[TGH]、单酰甘油酰基转移酶1[MGAT1]、细胞死亡诱导DFF45样效应物b[Cideb]）的肝脏mRNA表达。C、。与FAO相关的基因的肝脏mRNA表达（肉碱依赖性转运-1α[CPT1α]、酰基辅酶A氧化酶1[ACOX1]、烯醇辅酶A水合酶和3-羟基芳基辅酶a脱氢酶[Ehhadh]、烯酸辅酶A水解酶和3-羟酰辅酶A脱氢酶[Acaa1b]、短链酰基辅酸脱氢酶[SCAD]、长链酰基CoA脱氢酶[CCAD]和超长链酰基辅酶A脱氢酶[VLCAD]）。D。通过以下方法测定HFD-Scramble和HFD-shPRMT1小鼠的肝脏FAO率体外新鲜小鼠肝组织与1的孵育-14C-棕榈酸。孵化后，14不被氧化成长度小于～6个碳的脂肪酰基-CoAs的C-棕榈酸酯在添加1M高氯酸后会从溶液中沉淀出来，剩下的部分作为不完全氧化的酸-可溶性代谢物（ASM）。此外，14C-标记的乙酰辅酶A也将进一步进入三羧酸（TCA）循环，并被氧化为14一氧化碳2.通过诱捕14一氧化碳2使用1M NaOH浸泡的纸片。为了计算粮农组织的总比率，我们计算了ASM和14一氧化碳2带闪烁计数器。每个样本每分钟的平均计数是ASM和14一氧化碳2该分析中使用的肝组织总蛋白含量的比例和归一化。E.公司。通过qPCR分析测定肝脏PGC-1αmRNA表达水平。靶基因的mRNA表达水平归一化为小鼠β-actin的表达。HFD-Scramble组设为1，用于折叠式计算。F、。Western blot分析PGC-1α的肝蛋白表达，通过Western blot测定（左）。每条车道都是来自不同个体的样本。PGC-1α肝蛋白表达水平的量化（右）。数据表示为平均值±SEM；n=5-8个/组；通过三个独立实验进行重复*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，NS，不显著。
图4
图4
PRMT1的甲基转移酶失活取消了其对饮食诱导的肝脂肪变性的保护作用。用3×10感染8周龄雄性C57BL/6N小鼠11编码野生型PRMT1（PRMT1 WT）的AAV拷贝，甲基转移酶活性缺陷的PRMT1g80转（PRMT1 Mut）或荧光素酶（Luc），在HFD喂养后持续12周。一个通过qPCR分析确定PRMT1（左）和PGC-1α（右）的肝脏mRNA表达水平。B类通过Western blotting测定这些小鼠肝组织中PRMT1和PGC-1α的蛋白表达（左）。每条车道都是来自不同个体的样本。PRMT1（中部）和PGC-1α（右侧）肝蛋白表达水平的量化。C类肝切片油红O（上片）和H&E（下片）染色的代表性图像。（200倍）D。肝脏胆固醇和甘油三酯水平根据用于提取脂质的肝组织的总蛋白含量进行标准化。E.公司。血清ALT和AST水平。F、。肝脏FAO率由在体外新鲜收获的小鼠肝组织与1-14C-棕榈酸，如图3B所示。每个样本每分钟的平均计数是ASM和14一氧化碳2该分析中使用的肝组织总蛋白含量的比例和归一化。靶基因的mRNA表达水平被标准化为小鼠β-肌动蛋白的表达。STC-Luc组折叠式计算设为1。数据表示为平均值±SEM；n=5-8个/组；通过三个独立实验进行重复*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图5
图5
PGC-1α是PRMT1介导缓解饮食诱导的肝脂肪变性所必需的。用3×10感染8周龄雄性C57BL/6N小鼠11编码ApoE-PRMT1（PRMT1）的AAV拷贝，用于在HFD喂养后7周过度表达PRMT1或ApoE-荧光素酶对照（Luc）。随后通过尾静脉注射（2×109p.f.u./小鼠），在腺病毒感染后2周处死小鼠。一个.病毒治疗示意图。B。通过Western blotting测定PGC-1α和PRMT1的肝蛋白表达。每条车道都是来自不同个体的样本。C类PGC-1α和PRMT1肝蛋白表达的定量。D类.血清ALT和AST水平。E类肝切片油红O（上片）和H&E（下片）染色的代表性图像。（200倍）F类肝胆固醇和甘油三酯水平根据用于提取脂质的肝组织的总蛋白含量进行标准化。G.公司。肝脏FAO相关基因mRNA表达水平的qPCR分析。H。肝脏FAO率由体外新鲜收获的小鼠肝组织与1-14C-棕榈酸，如图3B所示。每个样本每分钟的平均计数是ASM和14一氧化碳2该分析中使用的肝组织总蛋白含量的比例和归一化。靶基因的mRNA表达水平归一化为小鼠β-actin的表达。将HFD-Luc-Scramble组设为1进行折叠式计算。数据表示为平均值±SEM；n=5-8个/组；通过三个独立实验进行重复*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图6
图6
PRMT1的甲基转移酶活性通过HNF-4α调节PGC-1α的转录活性。一个JASPAR（2018）生成了小鼠HNF-4α的DNA模体序列标志。使用PROMO（版本8.3）计算PGC-1α的查询序列和HNF-4α的预测转录因子结合位点序列之间的差异性、随机期望（RE）相等性和查询。B类通过截断分析对PGC-1α启动子进行荧光素酶报告分析，以应对WT或突变PRMT1的过度表达。用pAM2AA-ApoE-PRMT1 WT或具有不同长度的突变体（Mut）质粒或pGL3-PGC-1α启动子萤光素酶质粒的突变体（-146至-137区域缺失）共转染Hepa1-6细胞48小时。细胞裂解物用于荧光素酶分析。每个样品的总蛋白质含量用于归一化。用PRMT1 Mut和PGC-1α的启动子区-1000/+1进行联合转染的处理被设置为1，用于折迭计算。C类ChIP法检测到HNF-4α与GFP/PRMT1 WT/PRMT1 Mut在Hepa1-6细胞中的共表达，以兔抗HNF-4β多克隆抗体或非免疫兔IgG作为对照，对PGC-1α启动子区HNF-4γ的占据进行折叠富集。使用跨越PGC-1α近端启动子的引物（如表S2所示），通过qPCR分析沉淀的染色质。D。WT或非甲基化突变（Mut）HNF-4α质粒过度表达对PGC-1α启动子的荧光素酶报告分析。用pAM2AA-ApoE-PRMT1 WT/GFP与pAM2AA-ApoE-HNF-4αWT或带有pGL3-PGC-1α启动子（-300至+1）-荧光素酶质粒的Mut质粒共同转染Hepa1-6细胞48小时。细胞裂解物用于荧光素酶分析。每个样品的总蛋白质含量用于归一化。将HNF-4αWT、GFP和PGC-1α启动子区-300/+1的联合转染处理设为1，用于折迭计算。靶基因的mRNA表达水平归一化为小鼠β-actin的表达。GFP和HNF-4α联合转染的处理被设置为1，用于折迭计算。靶基因的mRNA表达水平归一化为小鼠β-actin的表达。数据表示为平均值±SEM；n=5-8个/组；通过三个独立实验进行重复*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.E.公司。对STC-Luc、HFD-Luc、HD-PRMT1 WT和HD-PRMT1 Mut小鼠肝裂解物中HNF-4α的甲基化水平进行了分析，并F类用抗二甲基精氨酸抗体免疫印迹法分析STC-Luc、HFD-Luc和HFD-shPRMT1小鼠肝裂解物中HNF-4α的甲基化水平。通过密度测定法测定甲基化HNF-4α相对于总HNF-4β的相对量，并在印迹下方显示。HNF-4α是PRMT1介导诱导Hepa1-6细胞上PGC-1α表达所必需的。用GFP或PRMT1过表达质粒转染Hepa1-6 24小时，然后用shScramble（Scramble）或shHNF-4α-1或shHGF-4α-2质粒转染72小时。G公司通过qPCR分析测定PRMT1、HNF4α和PGC-1α的mRNA表达水平。H（H）蛋白质印迹法测定PRMT1、HNF-4α和PGC-1α的蛋白质表达（左）。定量PRMT1、HNF4α和PGC-1α的蛋白表达水平（从左到右）。靶基因的mRNA表达水平归一化为小鼠β-actin的表达。将对照组设为1进行折叠式计算。数据表示为平均值±SEM；n=4个/组；通过三个独立实验进行重复*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，NS，不显著。
图7
图7
与肝脏形态正常的肥胖患者相比，脂肪肝患者的肝脏PRMT1表达下调，并且与肝脏PGC-1α表达水平呈正相关。答：。这些研究对象的肝脏切片中PRMT1的肝脏IHC染色。（200倍）B。使用ImageJ根据IHC染色结果对这些研究对象肝切片中PRMT1蛋白表达水平进行量化。C、。PRMT1和D。通过qPCR分析测定这些研究受试者肝脏中PGC-1α的mRNA表达水平。E.公司。这些研究对象肝脏中PRMT1和PGC-1α水平之间的相关性。靶基因的mRNA表达水平归一化为人β-actin的表达。将肝脏健康的肥胖受试者设为1，进行折迭计算。数据表示为平均值±SEM；n=每组4-8个。相关性通过非参数Spearman检验进行评估*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
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