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.2022年4月8日；18（4）：e1010353。
doi:10.1371/journal.ppat.1010353。 eCollection 2022年4月。

细小病毒非结构蛋白2与染色质调节细胞蛋白相互作用

萨拉·马托拉 1, 卡里·萨洛卡斯 2, 维萨·阿霍 1, 艾琳娜·曼蒂拉 三, 萨米·萨米宁 1, 萨图·哈卡宁 1, Einari A Niskanen公司 4, 朱利娅·斯维尔斯凯特 2, 蒂姆·O·伊哈莱宁 三, Kari J Airenne女士 5, Minna Kaikkonen-Määttä 4, 科林·帕里什 6, 马尔库·瓦尔乔萨洛 2, Maija Vihinen-Ranta公司 1
附属公司

细小病毒非结构蛋白2与染色质调节细胞蛋白相互作用

萨拉·马托拉等。 公共科学图书馆-病理学. .

摘要

自主细小病毒编码至少两种非结构蛋白，NS1和NS2。虽然NS1与病毒复制所需的重要核过程有关，但对NS2的作用知之甚少。具体而言，犬细小病毒NS2的功能尚未明确。在这里，我们使用邻近依赖性生物素鉴定（BioID）来筛选与CPV NS2相关的核蛋白。在非感染细胞和感染细胞中都发现了许多这种关联，然而，在感染细胞中，主要的相互作用蛋白类型从核膜蛋白转变为染色质相关蛋白。BioID相互作用揭示了NS2在DNA重塑和损伤反应中的潜在作用。对NS2蛋白截短型突变病毒基因组的研究表明，宿主染色质可及性发生了变化。此外，对NS2突变体的进一步研究表明，NS2具有影响与DNA损伤反应相关的蛋白质数量和分布的功能。值得注意的是，NS2剪接供体位点的突变导致优先形成小型病毒复制中心病灶，而不是野生型感染中出现的大型合并中心。总之，我们的结果提供了对细小病毒复制过程中CPV NS2在控制染色质重塑和DNA损伤反应中的潜在作用的见解。

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数字

图1
图1。CPV感染导致NS1和NS2基因同时表达和NS2核仁积累。
（A）用RT-qPCR检测感染后4至24小时（hpi）NLFK细胞中NS1（蓝色）和NS2（红色）的相对表达水平。线周围的蓝色和红色阴影表示平均值的标准误差（SEM，n=3）。(B类)用NS2-EGFP转染的HeLa细胞的代表性共聚焦图像（绿色）和(C类)BirA*标记24 hpt非感染细胞和24 hpi感染细胞中的NS2（绿色）。NS1（红色）定位于DAPI染色细胞核（灰色）的细胞。(D类)用NS2（绿色）和核仁蛋白（红色）抗体染色的24 hpi非感染和感染NLFK细胞的典型共焦图像。灰色对应于DNA的DAPI染色。比例尺，3μm。
图2
图2。NS2的核相互作用物。
使用BioID识别NS2邻近相互作用组。(A类)48个与染色质修饰和DNA损伤反应细胞过程相关的高置信BioID NS2相互作用体的示意图。交互因子由其基因名称表示。NS2（HA-BirA*-NS2）的关联显示为存在感染（24 hpi，深蓝色虚线）或不存在感染（红色虚线），或在这两种情况下（黑色实线）。(B类)表显示了NS2 BioID数据集的GO功能注释集群。NS2高置信度相互作用物的功能注释图由PANTHER分类系统创建，用于GO生物过程过度表达(http://www.pantherdb.org网站/)使用默认的BFDR<0.01（黄色圆圈）和<0.05（白色圆圈）过滤器。GO术语按PANTHER分层分组，以说明功能类别之间的关系，并根据与两个确定的功能关联组的相关性进行着色：染色质修饰（蓝色）和DNA损伤反应（灰色）。
图3
图3。非感染细胞和感染细胞中NS2的分子背景不同。
用质谱（MS）显微镜分析CPV NS2在（A）未感染和（B）稳定感染的HA-BirA*-NS2表达Flp-in的T-REx 293细胞中的相互作用体定位。极坐标图显示了基于细胞标记蛋白的NS2蛋白结合的位置。每个扇区代表我们的参考数据库定义的一个亚细胞位置。分配给每个本地化的颜色基于注释频率（浅绿色：0–0.25；绿色：0.25–0.5；深绿色：0.5–1）。核仁（NUC）、染色质（CHR）和核膜（NE）的标记物分别为rRNA 2′-O-甲基转移酶纤维蛋白、组蛋白H3.1和前层蛋白A/C。
图4
图4。NS2相关蛋白在染色质重塑和DDR机制中发挥重要作用。
CPV NS2蛋白与控制染色质重塑和DDR通路的某些关键因子相关，以优化病毒复制的细胞条件。这张示意图显示了NS2（红色）与细胞蛋白（绿色阴影）的主要关联。虚线箭头表示染色质结合和DDR机制与NS2相互作用的关键因素。(A类)细胞染色质修饰机制包括染色质重塑复合物，如NORC、WICH、ACF和RSF。(B类)DNA损伤反应（DDR）因子包含ATM反应的主要上游介质，如DNA损伤检查点1（MDC1）蛋白和染色质和核小体重塑复合物中包含的蛋白。MDC1与磷酸化的γ-H2AX相互作用，并介导DDR反应蛋白向损伤部位的募集。DDR下游FACT复合物作为核小体重塑剂促进转录。在复制应激期间，FACT安排用宏观H2A.1替换γ-H2AX至损伤部位。显示了细小病毒基因组和病毒复制蛋白NS1（红色）在细胞染色质DNA损伤位点附近的位置。图是使用BioRender.com创建的。
图5
图5。近距离分析验证了NS2与关键BioID相互作用物的关联。
对转染NS2-EGFP和BioID鉴定的代表性细胞蛋白的HeLa细胞进行邻近连接分析（PLA）。这些蛋白是染色质重塑因子（SMARCA5）、转录抑制因子（macroH2A.1）和FACT复合物的组蛋白伴侣（SSRP1）。(A类)典型的单共焦横截面显示PLA信号的定位（绿色）和DAPI染色的细胞核（灰色）。(B类)阳性和阴性对照包括带有VP2衣壳蛋白抗体的PLA和20 hpi感染细胞和非感染细胞中完整衣壳。比例尺，3μm。(C类)该图显示了共焦图像三维重建分析的每个核的PLA信号焦点平均数（n=15）。误差条显示平均值的标准误差（SEM），与阴性对照组相比，PLA核病灶数量显著增加的样本表示为**（p<0.01）。采用泊松回归模型评估显著性。
图6
图6。NS2与感染细胞中由BioID识别的宿主蛋白相互作用。
24 hpi感染NLFK细胞中NS2与SMARCA5、MDC1、macroH2A.1和SSRP1相互作用的分析。(A类)DAPI染色细胞核中PLA信号的典型单共焦横截面（绿色）（灰色）。(B类)在24 hpi和非感染细胞中使用VP2抗体和完整衣壳制备的PLA阳性和阴性对照图像。比例尺，3μm。(C类)共聚焦PLA数据的3D重建分析显示了PLA信号病灶/细胞核的平均数量（n=15）。误差条显示平均值的标准误差（SEM），与阴性对照组相比，PLA核病灶数量显著增加的样本表示为**（p<0.01）。采用泊松回归模型评估显著性。
图7
图7。NS2突变导致常染色质的数量和分布发生变化。
(A类)典型的共焦图像显示了常染色质标记H3K27ac（品红色）、NS1（绿色）和DAPI染色（灰色）在未转染HeLa细胞以及转染wt、NS2供体和受体突变体的细胞中的核定位。(B类)常染色质的总荧光强度。(C类)非转染、wt和NS2突变转染细胞中H3K27ac的核分布随与NE距离增加而变化（n=29）。误差条显示平均值的标准误差。使用Dunnett的多重比较检验确定统计显著性。所示的显著性值表示为**（p<0.01）、*（p<0.05）或ns（不显著）。比例尺，5μm。
图8
图8。NS2突变导致DDR蛋白的数量和分布发生变化。
典型共焦图像显示NS1的核定位（绿色）(A类)γ-H2AX（品红色），（B）)未经转染的HeLa细胞中的MDC1（洋红色）和DAPI染色（灰色），或在24 hpt时使用wt、NS2剪接供体和受体突变体。比例尺，5μm。（C）)γ-H2AX的总荧光强度以及(D类)在未转染、wt和NS2突变体转染的细胞中，其核分布与NE距离的增加有关（n=29）。（E） 通过核仁测量γ-H2AX（紫色）和NS1（绿色）的强度线剖面。(如果)荧光强度和(G公司)NE中MDC1的核定位（n=28）。误差条显示平均值的标准误差。（H） 通过核仁测量MDC1（紫色）和NS1（绿色）的强度线轮廓。使用Dunnett的多重比较检验确定统计显著性。所示的显著性值表示为**（p<0.01）、*（p<0.05）或ns（不显著）。荧光强度分布(G公司)γ-H2AX（品红色），含NS1（绿色），以及(H（H）)MDC1（洋红色），NS1（绿色）位于缩放区域。
图9
图9。NS2突变导致复制中心的数量和体积发生变化。
(A类)共焦图像切片的典型伪彩色和投影显示了24 hpt转染HeLa细胞的非转染、wt、剪接供体和受体突变体中核NS1的数量和分布。显示了伪着色的校准条。比例尺，5μm。（B）)NS1的总荧光强度。误差条显示平均值的标准误差。(C类)NS1在wt和NS2突变体转染细胞中的核分布随着与NE距离的增加而增加（n=29）。(D类)数字和(E类)通过NS1染色确定的复制中心体积在转染HeLa细胞的wt、剪接供体和受体突变体中进行了分析（n=29）。误差条显示平均值的标准误差。使用Dunnett的多重比较检验确定统计显著性。所示的显著性值表示为**（p<0.01）、*（p<0.05）或ns（不显著）。
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这项工作由Jane和Aatos Erkko基金会资助；芬兰学院，授予编号330896（MVR）；芬兰生物中心、病毒基因转移（MVR）和Jyvaskyla大学研究生院（SM）。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。